Un modèle murin unique pour l’évaluation quantitative de la formation de biofilm sur les implants chirurgicaux dans l’abcès sous-cutané

Ce protocole décrit un modèle expérimental unique d’infections liées aux implants qui permet l’incubation simultanée de deux implants avec des bactéries dans des conditions identiques au sein d’une même souris. Il permet également une évaluation précise de la formation de biofilms sur les surfaces des implants à l’aide de méthodes analytiques comparatives optimisées, démontrant ainsi des techniques avancées d’évaluation des propriétés antimicrobiennes des biomatériaux.

Pour développer un nouveau biomatériau aux propriétés antibactériennes pour les procédures chirurgicales orthopédiques, il est crucial d’établir un modèle animal expérimental d’infections liées aux implants qui imite étroitement l’état pathologique. De plus, une comparaison quantitative avec des échantillons de contrôle est nécessaire pour évaluer la formation de biofilm sur les matériaux. Cependant, les modèles animaux actuels, qui impliquent l’implantation d’un seul matériau chez chaque individu, peuvent donner des résultats incohérents en raison de l’hétérogénéité du statut d’infection entre les sujets. De plus, il reste difficile de quantifier avec précision la formation de biofilms sur les matériaux in vivo , et les résultats peuvent manquer de fiabilité. Pour résoudre ces problèmes, cette étude a mis en évidence un modèle murin unique d’infection liée à l’implant qui permet l’incubation simultanée de deux implants avec des bactéries dans un environnement clos au sein d’une seule souris, formant un abcès sous-cutané encapsulé. Une poche d’air mature a d’abord été créée sous la peau du dos. Deux fils d’acier inoxydable ont été connectés et placés dans le sac, suivis de l’inoculation de Xen 36, une souche bioluminescente de Staphylococcus aureus. 14 jours après l’inoculation, un abcès sous-cutané s’était formé autour des fils. Le biofilm a été complètement retiré de la surface de chaque fil, et les suspensions bactériennes dissoutes ont été mesurées avec précision à l’aide de méthodes optimisées pour évaluer la formation de biofilm sur l’implant, déterminer les unités formant colonies et effectuer une analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase. En exploitant l’opéron lux des bactéries bioluminescentes, les niveaux d’expression relatifs de l’ARNr luxA et 16S ont été utilisés pour déterminer la charge bactérienne dans le biofilm sur chaque fil. Cette approche analytique comparative optimisée permet d’évaluer précisément la formation de biofilms sur deux fils dans des conditions d’infection uniformes au sein d’un seul modèle de souris et peut faciliter l’avancement de biomatériaux ayant des propriétés antibactériennes.

Les infections liées aux implants restent un défi important en milieu clinique, car elles peuvent entraîner des taux élevés de morbidité et de mortalité en chirurgie orthopédique, malgré les progrès de la technique chirurgicale et de la conception des implants¹. Bien que l’incidence des infections associées aux implants chirurgicaux ait considérablement diminué en raison des normes modernes de contrôle aseptique dans l’environnement de la salle d’opération et des protocoles appropriés pour l’antibioprophylaxie périopératoire, l’incidence des infections liées aux implants en chirurgie primaire reste de 2 % à 5 %².

Le principal mécanisme sous-jacent des infections liées aux implants est la formation d’un biofilm sur les surfaces de l’implant, qui protège les micro-organismes des antibiotiques et du système immunitaire, ce qui rend l’infection difficile à éradiquer ^3,4. Comme l’adhérence bactérienne sur la surface de l’implant est cruciale au cours de la première étape de la formation du biofilm, la minimisation de l’adhérence bactérienne et de la formation ultérieure du biofilm est une stratégie essentielle pour réduire le risque d’infections liées à l’implant. Malgré les propriétés antibactériennes de diverses technologies d’implants, celles-ci n’ont pas été largement utilisées cliniquement en raison d’événements indésirables, tels que la toxicité cellulaire et les allergies 5,6,7,8. Par conséquent, il existe encore un besoin clinique non satisfait d’implants antibactériens qui harmonisent l’innocuité, l’efficacité, la stabilité et la durabilité afin de réduire le risque d’infections liées aux implants. La recherche et le développement d’implants aux propriétés antibactériennes pourraient faire progresser la technologie chirurgicale pour surmonter ces problèmes.

Il est essentiel d’évaluer les propriétés antibactériennes de divers biomatériaux à l’aide de petits modèles animaux avant de passer à des modèles animaux plus grands et à des essais cliniques⁹. De nombreuses études ont montré des modèles murins applicables d’infections liées aux implants à l’aide d’une bactérie bioluminescente, qui contient l’opéron luxABCDE 10,11,12,13,14,15. Bien que ces modèles accélèrent la recherche sur le développement d’implants ou de technologies antibactériennes, ils ont certaines limites. Tout d’abord, une expertise de pointe et des équipements spécialisés, tels que des rayons X ou des systèmes d’imagerie dédiés, sont souvent nécessaires pour évaluer directement et avec précision la charge bactérienne sur les implants placés dans des modèles murins. Deuxièmement, alors que les implants collectés évaluent généralement un implant solitaire à un seul site d’infection par animal, les conditions d’infection et les réponses immunologiques peuvent varier d’un individu à l’autre, ce qui peut entraîner une variabilité des résultats des évaluations comparatives. Par conséquent, lorsque l’on compare les effets antibactériens de divers biomatériaux in vivo, il est plus avantageux de les implanter et de les inoculer avec des bactéries dans des environnements uniformes pour résoudre ces problèmes. De plus, il est essentiel d’optimiser la méthodologie actuelle et de réaliser des évaluations quantitatives avec reproductibilité et précision en exploitant les caractéristiques du modèle animal et des bactéries utilisées.

Cette étude présente une nouvelle approche expérimentale pour les infections liées aux implants in vivo qui permet des mesures précises pour évaluer la formation du biofilm sur les surfaces de deux implants au sein d’un seul modèle de souris grâce à des méthodes analytiques comparatives inter- et intra-individuelles. Le biofilm sur chaque implant peut être quantifié à l’aide de méthodes optimisées de visualisation du biofilm sur l’implant, de détermination des unités formant colonies (UFC) et d’analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase (qPCR) d’une souche bioluminescente de Staphylococcus aureus, Xen 36. L’étude précédente a montré qu’un nouvel implant métallique possède une efficacité antibactérienne in vivo prometteuse contre Staphylococcus aureus en utilisant cette approche globale¹⁶. Cette méthodologie peut être facilement mise en œuvre dans un cadre de laboratoire standard et peut accélérer la recherche sur le développement de biomatériaux antibactériens.

Toutes les procédures sur les animaux sont approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie à San Francisco (UCSF) et sont effectuées dans une installation BSL2 après consultation et approbation du programme de risque de biosécurité de l’UCSF, administré par l’UCSF Environmental Health and Safety. Des souris C57BL/6 mâles et femelles (âgées de 12 à 16 semaines, 25 à 50 mg) ont été utilisées. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation des bactéries

1. Utilisez le bioluminescent Staphylococcus aureus Xen36 (ATCC49525) comme agent pathogène.
   REMARQUE : Cette souche est obtenue à partir de l’American Type Culture Collection (Manassas, VA) et utilise de manière unique un opéron luxABCDE , qui est optimisé et intégré dans le plasmide natif de l’hôte. Xen36 utilise également le gène de résistance à la kanamycine lié à l’opéron lux .
2. Ajouter une petite quantité de bouillon de glycérol congelé de Xen 36 et ajouter les morceaux à 5 mL de bouillon de soja tryptique (TSB) contenant 200 μg/mL de kanamycine.
3. Incuber la culture pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur à agitation (200 tr/min).
4. Laisser traîner Xen36 sur des plaques de gélose TSB (TSB dans la gélose 1,5 %) contenant 200 μg/mL de kanamycine et incuber pendant une nuit à 37 °C.
5. Isoler des colonies individuelles de Xen36 et les mettre en culture dans 5 mL de BST contenant 200 μg/mL de kanamycine pendant une nuit à 37 °C dans un incubateur à agitation (200 tr/min).
6. Mesurer l’absorbance de la culture résultante à 630 nm.
7. Diluer la culture et faire une culture Xen36 de 1,0 x 10⁸ UFC/mL basée sur l’absorbance à 630 nm.
   REMARQUE : Une mesure de l’absorbance à 630 nm (contre un blanc TSB) de 0,5 est à peu près équivalente à 1,0 x 10⁸ UFC/ml de Xen36.
8. Diluez la culture et faites une culture Xen36 de 1,0 x 10⁵ UFC/mL.

2. Préparation des implants connectés

1. Utilisez deux fils en forme de tige composés d’acier inoxydable de qualité chirurgicale (SUS316L, chacun mesurant 8 mm de long et 0,5 mm de diamètre.
2. Connectez les deux fils verticalement en les insérant aux deux extrémités d’une pointe de pipette de 20 μL coupée à une longueur d’environ 3 mm.
   REMARQUE : insérez les fils connectés verticalement dans la pointe de l’aiguille 18 G (Figure 1). Assurez-vous que les fils sont solidement fixés par la pointe de la pipette pour éviter toute déconnexion.
3. Autoclavez les fils avant de les implanter chirurgicalement dans les souris.

3. Création d’un sac sous-cutané mature

REMARQUE : 7 jours avant l’inoculation bactérienne, créez la poche d’air comme suit :

1. Anesthésier la souris (C57BL/6) avec de l’isoflurane à 2 % par inhalation (en suivant les protocoles approuvés par l’établissement).
   REMARQUE : Évaluez le niveau d’anesthésie approprié en observant la fréquence respiratoire, le tonus musculaire, le pincement des orteils, le réflexe cornéen et la couleur des muqueuses. Utilisez une pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
2. Transférez la souris anesthésiée sur le lit chirurgical et rasez la région cervicale/thoracique dorsale de la souris.
3. Écouvillonnez et stérilisez toute la région avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée.
4. Remplissez une seringue de 10 ml d’air stérile et fixez une aiguille de 27 G à la sortie.
5. Pincez et élevez doucement la base du cou de la souris pour créer un espace entre le tissu sous-cutané et le fascia.
6. Placez l’aiguille dans la ligne médiane entre les omoplates de la souris et injectez 3 ml d’air stérile par voie sous-cutanée pour créer la poche d’air (figure 2).
   REMARQUE : Tout en injectant de l’air, maintenez les deux côtés du dos avec la main opposée pour vous assurer que l’air se propage au centre du dos, créant une poche au milieu.
7. Remettez la souris dans une cage chauffée avec un tampon thermique et surveillez-la de près jusqu’à ce qu’elle se remette de l’anesthésie.
8. Injectez 3 mL d’air stérile comme décrit ci-dessus pour maintenir le gonflage de la cavité et créer un sac mature tous les 2 jours.
   REMARQUE : Avant chaque gonflage, aspirez l’air du sachet pour confirmer le bon placement de la pointe de l’aiguille. Retirez délicatement la seringue de l’aiguille, en laissant la pointe de l’aiguille dans le sachet. Regonflez le sachet avec 3 ml d’air stérile.

4. Implantation de fils connectés et inoculation bactérienne

1. 7 jours après la première injection d’air, anesthésie la souris comme décrit à l’étape 3.1.
   REMARQUE : Pendant l’intervention chirurgicale, vérifiez constamment que la souris respire et est anesthésiée. L’ensemble de l’intervention chirurgicale prend généralement 10 à 15 minutes lorsqu’elle est effectuée par un chirurgien qualifié. L’anesthésie est maintenue en plaçant un tube délivrant 2 % d’isoflurane mélangé à de l’oxygène à côté du museau de la souris.
2. Écouvillonnez et stérilisez toute la région avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée.
3. Injectez la bupivacaïne par voie sous-cutanée juste avant la chirurgie.
4. Faites une incision longitudinale médiane de 3 mm en haut du sac.
5. Insérez une aiguille de 18 G contenant les fils connectés dans le sac par le trou et poussez les fils à l’aide d’une seringue intérieure d’une aiguille spinale de 25 G (Figure 3A,B).
6. En laissant la pointe de l’aiguille de 18 G à l’intérieur du sac, retirer délicatement le cylindre intérieur et injecter 3 mL de culture de Xen36 1,0 x 10⁵ UFC/mL à l’aide de la seringue (figures 3C,D).
7. Retirez soigneusement toutes les aiguilles, fermez la peau à l’aide d’une pince à plaie et scellez-la avec un adhésif cutané topique (figures 3E, F).
8. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite, remettez la souris dans la cage individuelle chauffée avec un tampon thermique et surveillez comme auparavant.

5. Extraction des implants de l’abcès sous-cutané

1. Après l’euthanasie par surdosage d’isofluorane, rasez la région dorsale cervicale, thoracique et lombaire de la souris, puis frottez et stérilisez toute la région avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée (Figure 4A).
   REMARQUE : L’euthanasie a été menée conformément aux lignes directrices de l’American Veterinary Medical Association (AVMA) pour l’euthanasie des animaux.
2. Faites une incision médiane de 2 cm dans la région lombaire et exfoliez soigneusement le tissu sous-cutané à l’aide de ciseaux.
3. Étendez l’incision et la dissection sous-cutanée vers la partie proximale et séparez le tissu adhérent entourant l’abcès (Figure 4B - D).
4. Excise tout l’abcès sous-cutané (Figure 4E).
5. Coupez l’abcès et extrayez soigneusement le fil de l’intérieur de l’abcès (Figure 4F).

6. Quantification du biofilm formé sur les surfaces de l’implant

1. Dosage du violet cristallin
   1. Placez les fils extraits de l’abcès dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits contenant 1 mL d’eau désionisée (DI).
   2. Transférez les fils dans de nouveaux puits contenant 1 ml d’eau DI pour éliminer les bactéries qui adhèrent peu à la surface des fils.
   3. Fixez le biofilm sur les fils avec de l’éthanol à 100 % pendant 1 min et laissez-les sécher.
   4. Transférez les fils dans de nouveaux puits contenant 1 mL de réactif violet cristallin à 0,1 %.
   5. Après 15 min de coloration, lavez délicatement les fils deux fois avec de l’eau DI pour éliminer tout excès de colorant.
   6. Placez l’implant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 250 μL d’acide acétique à 33 % pendant 15 min ; Solubiliser le violet cristallin adhérent au biofilm sur l’implant, puis vortex pendant 1 min.
   7. Transférez 200 μL de la suspension sur une plaque à 96 puits et mesurez l’absorbance à_{OD 630 nm} à l’aide d’un lecteur de microplaques. Toutes les mesures sont effectuées en trois exemplaires.
2. Comptage des unités formant colonies (UFC)
   1. Retirez toutes les bactéries faiblement adhérentes de la surface des fils comme décrit à l’étape 6.1.2.
   2. Placez l’implant dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 200 μL de trypsine 10x et incubez à 37 °C pendant 1 h.
   3. Vortex pendant 1 min et sonicate dans un bain-marie à 100 W pendant 5 min, suivi d’un vortex supplémentaire pendant 30 s pour détacher le biofilm dans la suspension.
   4. Inoculer 10 μL de la suspension diluée en série sur les plaques de gélose TSB (TSB dans la gélose 1,5 %) avec 200 μg/mL de kanamycine.
      REMARQUE : Effectuez cette procédure en trois exemplaires pour chaque solution.
   5. Après avoir incubé les plaques à 37 °C pendant 24 h, comptez les colonies sur les plaques et calculez le nombre de cellules bactériennes dans la culture d’origine en utilisant le nombre moyen de colonies¹⁷.
      REMARQUE : Pour vous assurer que toutes les bactéries sont éliminées des fils, ce qui est crucial pour une mesure précise, colorez les fils avec du violet cristallin et observez-les après avoir appliqué la suspension sur les plaques. Dans les expériences préliminaires, la combinaison de la dissociation mécanique et chimique ci-dessus a permis d’éliminer tous les biofilms Xen36 des surfaces du fil d’acier inoxydable conventionnel (Figure 5).
3. Analyse quantitative de l’amplification en chaîne par polymérase (qPCR)
   1. Retirez toutes les bactéries faiblement adhérentes de la surface des fils comme décrit à l’étape 6.1.2.
   2. Placez l’implant dans un microtube de 1,5 mL contenant 600 μL de TSB.
   3. Extraire l’ADN à l’aide du système de lyse alcaline modifiée sans pastilles¹⁶.
      REMARQUE : Le volume final d’ADN élué est de 20 μL.
   4. Diluez l’ADN 1:10 et stockez-le à -20 °C.
   5. Effectuer une qPCR pour les gènes de l’ARNr luxA et 16S ¹⁶.
      REMARQUE : Toutes les réactions qPCR sont effectuées en trois exemplaires. Le volume total du mélange réactionnel est de 10 μL, contenant 3 μL de matrice d’ADN, 5 μL de SYBR Green, 1 μL d’eau sans nucléases et 0,5 μL de chaque amorce. Les amorces du gène luxA sont 5'- GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3' et 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. Les amorces du gène de l’ARNr 16S sont 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' et 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC - 3'. Les conditions de la PCR sont les suivantes : dénaturation initiale pendant 2 min à 94 °C suivie de 40 cycles de 15 s à 94 °C, 30 s à 60 °C et 30 s à 72 °C, et une extension finale à 72 °C pendant 5 min.
   6. La moyenne des valeurs seuils à trois cycles (Ct) est comparée à une courbe d’étalonnage générée avec de l’ADN purifié directement à partir de cultures Xen36 pures diluées en série pour estimer la charge bactérienne sur l’implant (Figure 6).

Cette étude a évalué la fiabilité d’une approche globale utilisant un nouveau modèle murin d’infection liée à l’implant avec des évaluations quantitatives optimisées de la formation de biofilm sur les surfaces de l’implant, qui a été utilisé dans l’étude précédente¹⁶. Les deux implants identiques ont été utilisés pour examiner le biofilm formé à leur surface, dans le but de vérifier que les deux implants pouvaient être incubés simultanément dans des conditions d’infection uniformes au sein d’un espace sous-cutané solitaire dans un seul modèle de souris. Les souris ont subi une procédure de création de poche sous-cutanée (Figure 2), et après 7 jours, les fils d’acier inoxydable connectés ont été implantés dans la poche mature, suivie d’une inoculation avec Staphylococcus aureus Xen36 (Figure 3). 14 jours après l’inoculation, un abcès encapsulé d’environ 2 cm de longueur et 1 cm de largeur, contenant les fils connectés, s’est formé dans la poche (figure 4). Les fils ont été prélevés à partir de l’abcès et le biofilm formé sur chaque fil a été évalué par coloration violette cristalline, comptage UFC et analyse qPCR. Les fils cristallins colorés en violet ont montré une formation constante de biofilm sur les surfaces, sans aucun changement observable entre les deux fils (figure 7A). Les mesures précises visant à évaluer la formation du biofilm à l’aide de méthodes analytiques comparatives inter- et intra-individuelles ont indiqué que les mesures d’absorbance du dosage du violet à cristaux dissous (figure 7B), du comptage des UFC (figure 7C) et de l’analyse qPCR (figure 7D) n’ont montré aucune différence statistiquement significative dans la charge bactérienne au sein du biofilm sur les deux fils. Ces résultats suggèrent que les deux fils ont été incubés simultanément dans des conditions d’infection identiques au niveau d’une poche sous-cutanée solitaire au sein d’un seul modèle de souris.

Figure 1 : Préparation des fils connectés pour l’implantation d’une poche sous-cutanée. (A) Une image représentative d’un implant unique composé de deux fils en acier inoxydable connectés (longueur : 8 mm, diamètre : 0,5 mm). (B) L’embout d’une pipette de 20 μL sert de connexion pour les deux fils. (C) Les fils connectés sont ensuite insérés dans la pointe d’une aiguille de 18 G pour être implantés dans une poche sous-cutanée mature. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Création d’une poche sous-cutanée mature pour l’implantation et l’inoculation. (A) La vue latérale, et (B) la vue de dessus d’une poche sous-cutanée entièrement formée juste après l’injection d’air. Une poche sous-cutanée est créée sur le dos d’un modèle de souris en insérant une aiguille de 27 G dans la peau le long de la ligne médiane entre les omoplates et en injectant 3 mL d’air stérile par voie sous-cutanée. Par la suite, 3 mL d’air stérile sont administrés tous les deux jours pendant 7 jours pour faciliter la maturation d’un sac sous-cutané. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Implantation de fils connectés et inoculation bactérienne dans une poche sous-cutanée mature. (A) La vue latérale, et (B) la vue de dessus de la procédure d’insertion de l’aiguille dans une poche sous-cutanée mature. Les fils connectés sont placés dans la pointe d’une aiguille de 18 G, et une seringue intérieure d’une aiguille vertébrale de 25 G est utilisée pour pousser les fils. Ils sont insérés dans la poche sous-cutanée mature par le trou cutané. Les fils sont ensuite placés dans le sac à l’aide d’une aiguille spinale de 25 G. Inoculation bactérienne dans la poche telle qu’observée à partir de la vue latérale (C) et de la vue de dessus (D). Après avoir fixé une seringue contenant une solution bactérienne à l’aiguille de 18 G, 3 mL de culture Xen36 (1,0 x 10⁵ UFC/ml) sont inoculés dans le sachet. Le site d’insertion est fermé après le retrait de l’aiguille 18 G, sans qu’aucune fuite ne soit détectée dans la vue latérale (E) ou la vue supérieure (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Collecte de fils connectés dans un abcès sous-cutané. (A) Une vue latérale d’un modèle murin pour les infections liées aux implants à 14 jours après l’inoculation. (B) La vue latérale, (C) la vue de dessus et (D) la vue inférieure de l’abcès sous-cutané avec les vaisseaux sanguins bien développés environnants après avoir séparé les tissus adhérents. (E) L’abcès sous-cutané est entièrement encapsulé, et (F) les fils connectés sont entièrement enveloppés à l’intérieur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Élimination du biofilm formé sur les fils pour l’évaluation de l’UFC. (A) Le biofilm formé à la surface de chaque fil est systématiquement coloré au violet cristallin 14 jours après l’inoculation in vitro. (B) Le biofilm coloré est diminué par vortex et sonication. (C) Il est entièrement éliminé par l’ajout d’un traitement à la trypsine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Courbe d’étalonnage des gènes de l’ARNr 16S et de luxA chez Staphylococcus aureus. Une courbe d’étalonnage convertit les valeurs Ct en charge bactérienne équivalente en UFC. Une dilution en série de la culture pure de Staphylococcus aureus Xen36 (10⁸ à 10¹ UFC) est créée. Un coefficient de corrélation de Pearson élevé est obtenu pour l’ARNr 16S (R² = 0,951) et luxA (R² = 0,985), indiquant des courbes standard linéaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Évaluations quantitatives de la formation de biofilm sur des fils connectés dans un modèle murin. (A) Images représentatives d’un seul implant composé de deux fils d’acier inoxydable connectés pour l’implantation sous-cutanée de la poche (à gauche) et d’un biofilm cristallin coloré au violet formé à la surface de chaque fil (fil 1 ou fil 2) 14 jours après l’inoculation (à droite). Des mesures visant à évaluer le biofilm à l’aide de méthodes analytiques comparatives inter- et intra-individuelles sont effectuées pour chaque fil dans un modèle de souris (total n = 12), y compris (B) la mesure de l’absorbance du biofilm coloré en violet cristallin (n = 4 ; le point circulaire indique la souris #1 ; le point triangulaire indique la souris #2 ; le point carré indique la souris #3 ; le point diamant indique la souris #4). (C) comptage CFU (n = 4 ; le point circulaire indique la souris #5 ; le point triangulaire indique la souris #6 ; le point carré indique la souris #7 ; le point diamant indique la souris #8), et (D) l’analyse qPCR (n = 4 ; le point circulaire indique la souris #9 ; le point triangulaire indique la souris #10 ; le point carré indique la souris #11 ; le point diamant indique la souris #12). Les différences entre les groupes de fils sont évaluées à l’aide d’une analyse de variance à un facteur (ANOVA). Toutes les données sont présentées sous forme d’erreur moyenne ± d’erreur-type. Les valeurs statistiquement significatives ont été définies comme p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cette étude a démontré une approche complète pour des évaluations quantitatives précises de la formation de biofilms sur plusieurs implants en exploitant un nouveau modèle de souris et des techniques d’analyse optimisées pour les infections liées aux implants. Pour s’assurer que deux implants ont été incubés dans des conditions d’infection identiques chez le même sujet, une poche sous-cutanée mature a été créée au sein d’une seule souris par des injections d’air répétées. Ce modèle a fourni un environnement fermé et stable où deux implants connectés pouvaient être incubés dans des conditions d’infection identiques, même lorsque la souris se déplaçait. Après l’inoculation de Staphylococcus aureus, un abcès sous-cutané encapsulé solitaire, d’environ 2 cm de long, s’est développé, enfermant entièrement les deux fils et ressemblant étroitement aux caractéristiques des infections cliniques liées aux implants. Les deux fils ont été extraits de l’abcès et le biofilm a été retiré de chaque surface par dissociation mécanique et chimique. La solution bactérienne dissoute a été utilisée pour analyser quantitativement la charge bactérienne dans le biofilm sur chaque fil. Une analyse analytique comparative inter et intra-individuelle de plusieurs fils a été effectuée entre les deux types de groupes de fils pour une évaluation quantitative. De plus, les deux fils placés dans la même souris ont été mesurés de manière comparative pour une évaluation plus précise, car ils ont été incubés simultanément avec une infection uniforme. L’analyse qPCR a utilisé les niveaux d’expression relatifs du gène de l’ARNr 16S et de l’opéron lux, qui code pour la luciférase dans un Staphylococcus aureus bioluminescent, pour une évaluation quantitative. Cette étude portant sur deux fils identiques n’a révélé aucune différence significative dans toutes les évaluations quantitatives de la formation du biofilm entre les groupes de fils de plusieurs souris ou entre les fils d’une même souris. Pendant ce temps, l’étude précédente a montré des différences significatives dans les évaluations quantitatives de la formation du biofilm entre deux groupes de fils distincts chez plusieurs souris¹⁶. Par conséquent, cette approche globale optimise le modèle murin et les techniques analytiques afin de minimiser la variabilité des résultats, ce qui pourrait améliorer la précision et la reproductibilité des évaluations quantitatives de la formation de biofilms sur plusieurs biomatériaux.

Plusieurs modèles in vivo d’infections liées aux implants ont été établis pour évaluer l’efficacité antimicrobienne dans les biomatériaux 9,18,19,20. Dans ces modèles, un seul implant est généralement placé dans le tibia, le fémur ou le processus rachidien par animal, avec l’inoculation bactérienne. Comme l’abcès se développe autour ou à proximité de l’implant après l’inoculation, imitant étroitement les caractéristiques cliniques, ces modèles sont utiles pour l’étude in vivo de l’infection liée à l’implant. Cependant, les résultats des évaluations quantitatives peuvent être incohérents en raison d’un seul implant par sujet, de l’inoculation dans un espace imparfaitement clos et de la variabilité des réponses immunitaires et des conditions d’infection entre les sujets. De plus, les évaluations quantitatives de ces modèles nécessitent souvent une expertise spécialisée et des appareils de mesure spécifiques, ce qui limite leur applicabilité. Bien que la taille de l’implant soit limitée dans ce modèle de souris, ces problèmes peuvent être améliorés par les attributs de cette méthodologie complète, qui implique l’incubation simultanée de plusieurs implants avec des bactéries dans des conditions d’infection identiques au sein d’une seule souris.

L’étape la plus critique de cette approche est l’élimination du biofilm formé de l’implant. Une méthode représentative de l’évaluation quantitative du biofilm est le comptage des UFC, qui nécessite le détachement des bactéries du biofilm, leur suspension dans un milieu et le placage ultérieur¹¹. Bien que les techniques de stress mécanique impliquant la sonication et le vortex soient couramment utilisées pour détacher le biofilm dans de nombreuses études, on s’inquiète de leur suffisance à éliminer complètement tout le biofilm des implants. Si ces techniques s’avèrent insuffisantes, la fiabilité des résultats peut être compromise. Cette étude a démontré que la stimulation mécanique seule ne pouvait pas détacher complètement le biofilm. Par conséquent, l’intégration d’un traitement chimique avec de la trypsine et d’une stimulation mécanique est nécessaire pour obtenir un détachement bactérien plus fiable et quantifier avec précision la charge bactérienne vivante dans le biofilm²¹.

L’analyse qPCR est couramment utilisée dans les études du microbiome pour évaluer la charge bactérienne globale dans le biofilm. Il s’agit probablement d’une méthode d’évaluation quantitative plus précise que le dosage du violet cristallin²². En créant une courbe d’étalonnage avec de l’ADN plasmidique purifié directement à partir de cultures bactériennes pures, la charge bactérienne dans le biofilm peut être précise. Étant donné que le gène de l’ARNr 16S est une sous-unité ribosomique présente chez toutes les bactéries, la qPCR ciblant le gène de l’ARNr 16S est largement utilisée pour la quantification bactérienne, et l’expression du gène de l’ARNr 16S est relativement stable pendant la croissance de Staphylococcus aureus^23,24. Le gène luxA est un composant de l’opéron lux d’une souche bioluminescente de Staphylococcus aureus Xen 36. Cette étude a démontré que la qPCR pour le gène luxA est également efficace pour évaluer quantitativement la formation du biofilm après l’inoculation de Xen 36. Ainsi, l’évaluation quantitative de la formation du biofilm peut être optimisée en inoculant une bactérie bioluminescente et en utilisant l’analyse de l’expression génique de l’opéron lux. Cette procédure est relativement facile à mettre en œuvre, reproductible et permet aux chercheurs d’analyser plusieurs échantillons simultanément. De plus, il est économique et ne nécessite aucun équipement spécial, ce qui en fait un choix réalisable pour tout laboratoire.

Cette approche globale présente certaines limites. Dans un premier temps, cette étude vise principalement à évaluer la formation de biofilms sur les implants en milieu localisé et clos, rendant ainsi insuffisante l’évaluation de l’impact des biomatériaux sur les infections systémiques. Deuxièmement, la charge bactérienne nécessaire pour former un abcès bien développé dans ce modèle de souris est considérablement plus élevée que dans d’autres modèles, ce qui peut créer un environnement difficile pour l’évaluation de la résistance des biomatériaux au biofilm²⁵. Cependant, pour former un abcès entourant complètement les implants et la culture des implants dans des conditions d’infection bactérienne identiques, une dose plus élevée de culture bactérienne a été nécessaire. Troisièmement, ce modèle ne peut pas être utilisé si l’un des implants libère des composés, car ils peuvent affecter l’autre implant. Quatrièmement, la pointe de pipette utilisée pour relier les deux implants peut influencer l’évolution de l’infection, bien que l’utilisation d’une pointe de pipette couramment disponible rende le modèle facile à mettre en œuvre dans n’importe quel laboratoire.

En conclusion, cette étude présente un nouveau modèle murin d’infection liée à l’implant et des méthodes analytiques optimisées pour une évaluation quantitative précise de la formation du biofilm. Cette approche globale devrait améliorer l’exactitude, la reproductibilité et la polyvalence des mesures de résultats pour la quantification comparative du biofilm sur les implants chirurgicaux en exploitant ses attributs, contribuant ainsi au développement futur des implants antimicrobiens.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Cette recherche a été partiellement financée par un programme de recherche coopérative industrie-université de la NSF appelé Center for Disruptive Musculoskeletal Innovations (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. et Rosies Base, LLC.