Un modello murino unico per la valutazione quantitativa della formazione di biofilm su impianti chirurgici in ascesso sottocutaneo

Questo protocollo descrive un modello sperimentale unico di infezioni correlate all'impianto che consente l'incubazione simultanea di due impianti con batteri in condizioni identiche all'interno di un singolo topo. Consente inoltre una valutazione precisa della formazione di biofilm sulle superfici implantari utilizzando metodi analitici comparativi ottimizzati, dimostrando tecniche avanzate per valutare le proprietà antimicrobiche dei biomateriali.

Per sviluppare un nuovo biomateriale con proprietà antibatteriche per le procedure chirurgiche ortopediche, è fondamentale stabilire un modello animale sperimentale di infezioni correlate all'impianto che imiti da vicino lo stato patologico. Inoltre, è necessario un confronto quantitativo con campioni di controllo per valutare la formazione di biofilm sui materiali. Tuttavia, gli attuali modelli animali, che prevedono l'impianto di un singolo materiale per ogni individuo, possono produrre risultati incoerenti a causa dell'eterogeneità dello stato di infezione tra i soggetti. Inoltre, quantificare con precisione la formazione di biofilm su materiali in vivo rimane difficile e i risultati potrebbero non essere affidabili. Per affrontare questi problemi, questo studio ha dimostrato un modello murino unico di infezione correlata all'impianto che consente l'incubazione simultanea di due impianti con batteri in un ambiente chiuso all'interno di un singolo topo, formando un ascesso sottocutaneo incapsulato. Inizialmente è stata creata una sacca d'aria matura sotto la pelle della schiena. Due fili di acciaio inossidabile sono stati collegati e inseriti nella busta, seguiti dall'inoculazione di Xen 36, un ceppo bioluminescente di Staphylococcus aureus. Entro 14 giorni dall'inoculazione, si era formato un ascesso sottocutaneo attorno ai fili. Il biofilm è stato completamente rimosso dalla superficie di ciascun filo e le sospensioni batteriche disciolte sono state misurate con precisione utilizzando metodi ottimizzati per valutare la formazione di biofilm sull'impianto, determinare le unità formanti colonie ed eseguire l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi. Sfruttando l'operone lux dei batteri bioluminescenti, i livelli di espressione relativi di luxA e 16S rRNA sono stati utilizzati per determinare la carica batterica all'interno del biofilm su ciascun filo. Questo approccio analitico comparativo ottimizzato consente valutazioni precise della formazione di biofilm su due fili in condizioni di infezione uniformi all'interno di un singolo modello murino e può facilitare l'avanzamento di biomateriali con proprietà antibatteriche.

Le infezioni correlate all'impianto rimangono una sfida significativa in ambito clinico perché possono causare alti tassi di morbilità e mortalità in chirurgia ortopedica nonostante i progressi nella tecnica chirurgica e nella progettazione degli impianti¹. Sebbene l'incidenza delle infezioni associate agli impianti chirurgici sia diminuita significativamente grazie ai moderni standard di controllo asettico nell'ambiente della sala operatoria e ai protocolli appropriati per la profilassi antibiotica perioperatoria, l'incidenza di infezioni correlate all'impianto in chirurgia primaria rimane del 2%-5%².

Il principale meccanismo alla base delle infezioni correlate all'impianto è la formazione di un biofilm sulla superficie dell'impianto, che protegge i microrganismi dagli antibiotici e dal sistema immunitario, rendendo l'infezione difficile da sradicare ^3,4. Poiché l'adesione batterica sulla superficie dell'impianto è fondamentale durante la prima fase di formazione del biofilm, ridurre al minimo l'adesione batterica e la successiva formazione di biofilm è una strategia essenziale per ridurre il rischio di infezioni correlate all'impianto. Nonostante le proprietà antibatteriche di varie tecnologie implantari, queste non sono state ampiamente utilizzate clinicamente a causa di eventi avversi, come tossicità cellulare e allergie 5,6,7,8. Pertanto, esiste ancora un'esigenza clinica insoddisfatta di impianti antibatterici che armonizzino sicurezza, efficacia, stabilità e durata per ridurre il rischio di infezioni correlate all'impianto. La ricerca e lo sviluppo di impianti con proprietà antibatteriche potrebbero far progredire la tecnologia chirurgica per superare questi problemi.

La valutazione delle proprietà antibatteriche di vari biomateriali utilizzando modelli di piccoli animali è essenziale prima di procedere a modelli animali più grandi e studi clinici⁹. Numerosi studi hanno dimostrato l'applicazione di modelli murini di infezioni correlate all'impianto utilizzando un batterio bioluminescente, che contiene l'operone luxABCDE 10,11,12,13,14,15. Sebbene questi modelli accelerino la ricerca nello sviluppo di impianti o tecnologie antibatteriche, presentano alcune limitazioni. In primo luogo, sono spesso necessarie competenze avanzate e attrezzature specializzate, come i raggi X o i sistemi di imaging dedicati, per valutare direttamente e con precisione la carica batterica sugli impianti inseriti nei modelli murini. In secondo luogo, mentre gli impianti raccolti in genere valutano un impianto solitario in un singolo sito di infezione per animale, le condizioni di infezione e le risposte immunologiche possono variare da individuo a individuo, portando potenzialmente a variabilità nei risultati delle valutazioni comparative. Pertanto, quando si confrontano gli effetti antibatterici di vari biomateriali in vivo, impiantarli e inocularli con batteri in contesti uniformi è più vantaggioso per affrontare questi problemi. Inoltre, è essenziale ottimizzare l'attuale metodologia e condurre valutazioni quantitative con riproducibilità e accuratezza, sfruttando le caratteristiche del modello animale e dei batteri utilizzati.

Questo studio presenta un nuovo approccio sperimentale per le infezioni correlate all'impianto in vivo che consente misurazioni precise per valutare la formazione di biofilm sulla superficie di due impianti all'interno di un singolo modello murino attraverso metodi analitici comparativi inter- e intra-individuali. Il biofilm su ciascun impianto può essere quantificato utilizzando metodi ottimizzati per la visualizzazione del biofilm sull'impianto, la determinazione delle unità formanti colonie (CFU) e l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) di un ceppo bioluminescente di Staphylococcus aureus, Xen 36. Lo studio precedente ha dimostrato che un nuovo impianto metallico possiede una promettente efficacia antibatterica in vivo contro lo Staphylococcus aureus utilizzando questo approccio completo¹⁶. Questa metodologia può essere facilmente implementata in un ambiente di laboratorio standard e può accelerare la ricerca nello sviluppo di biomateriali antibatterici.

Tutte le procedure per gli animali sono approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California di San Francisco (UCSF) e vengono eseguite in una struttura BSL2 dopo la consultazione e l'approvazione da parte dell'UCSF Biosafety Hazard Program, amministrato dall'UCSF Environmental Health and Safety. Sono stati utilizzati topi C57BL/6 maschi e femmine (12-16 settimane, 25-50 mg). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione dei batteri

1. Utilizzare lo Staphylococcus aureus Xen36 (ATCC49525) bioluminescente come agente patogeno.
   NOTA: Questo ceppo è ottenuto dall'American Type Culture Collection (Manassas, VA) e utilizza in modo univoco un operone luxABCDE , che è ottimizzato e integrato nel plasmide nativo dell'ospite. Xen36 utilizza anche il gene di resistenza alla kanamicina legato all'operone lux .
2. Aggiungere una piccola quantità di brodo di glicerolo congelato di Xen 36 e aggiungere i pezzi a 5 ml di brodo di soia triptico (TSB) contenente 200 μg/mL di kanamicina.
3. Incubare la coltura per una notte a 37 °C in un'incubatrice vibrante (200 giri/min).
4. Strisciare Xen36 su piastre di agar TSB (TSB in agar 1,5%) contenenti 200 μg/mL di kanamicina e incubare per una notte a 37 °C.
5. Isolare singole colonie di Xen36 e coltura in 5 mL di TSB contenenti 200 μg/mL di kanamicina per una notte a 37 °C in un incubatore con agitazione (200 giri/min).
6. Misurare l'assorbanza della coltura risultante a 630 nm.
7. Diluire la coltura ed effettuare una coltura Xen36 di 1,0 x 10⁸ CFU/mL in base all'assorbanza a 630 nm.
   NOTA: Una misura di assorbanza a 630 nm (contro un bianco TSB) di 0,5 equivale all'incirca a 1,0 x 10⁸ CFU/ml di Xen36.
8. Diluire la coltura e ottenere una coltura Xen36 di 1,0 x 10⁵ CFU/mL.

2. Preparazione degli impianti collegati

1. Utilizzare due fili a forma di asta composti da acciaio inossidabile chirurgico (SUS316L) disponibile in commercio, ciascuno con una lunghezza di 8 mm e un diametro di 0,5 mm.
2. Collegare i due fili verticalmente inserendoli in entrambe le estremità di un puntale per pipetta da 20 μl tagliato a una lunghezza di circa 3 mm.
   NOTA: Inserire i fili collegati verticalmente nella punta dell'ago da 18 G (Figura 1). Assicurarsi che i fili siano saldamente fissati dalla punta della pipetta per evitare lo scollegamento.
3. Autoclavare i fili prima di impiantarli chirurgicamente nei topi.

3. Creazione di una sacca sottocutanea matura

NOTA: 7 giorni prima dell'inoculazione batterica, creare la sacca d'aria come segue:

1. Anestetizzare il topo (C57BL/6) con isoflurano al 2% per inalazione (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
   NOTA: Valutare il livello appropriato di anestesia osservando la frequenza respiratoria, il tono muscolare, il pizzicamento delle dita dei piedi, il riflesso corneale e il colore delle mucose. Usa un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
2. Trasferire il topo anestetizzato sul letto chirurgico e radere la regione cervicale/toracica dorsale del topo.
3. Tamponare e sterilizzare l'intera regione con etanolo al 70% e iodio povidone.
4. Riempire una siringa da 10 ml con aria sterile e collegare un ago da 27 G all'uscita.
5. Pizzicare delicatamente ed elevare la base del collo del topo per creare spazio tra il tessuto sottocutaneo e la fascia.
6. Posizionare l'ago nella linea mediana tra le scapole del topo e iniettare 3 mL di aria sterile per via sottocutanea per creare la sacca d'aria (Figura 2).
   NOTA: Durante l'iniezione dell'aria, tenere premuti entrambi i lati della schiena con la mano opposta per assicurarsi che l'aria si diffonda al centro della schiena, creando una sacca al centro.
7. Rimetti il mouse in una gabbia riscaldata con un pad termico e monitoralo attentamente fino a quando non si sarà ripreso dall'anestesia.
8. Iniettare 3 ml di aria sterile come descritto sopra per mantenere il gonfiaggio della cavità e creare una sacca matura ogni 2 giorni.
   NOTA: Prima di ogni gonfiaggio, aspirare l'aria dalla busta per confermare il corretto posizionamento della punta dell'ago. Rimuovere con cautela la siringa dall'ago, lasciando la punta dell'ago nella busta. Rigonfiare la sacca con 3 ml di aria sterile.

4. Impianto di fili collegati e inoculazione batterica

1. 7 giorni dopo la prima iniezione d'aria, anestetizzare il topo come descritto al punto 3.1.
   NOTA: Durante la procedura chirurgica, controllare costantemente che il topo respiri e sia anestetizzato. L'intera procedura chirurgica richiede solitamente 10-15 minuti se eseguita da un chirurgo qualificato. L'anestesia viene mantenuta posizionando un tubo che eroga isoflurano al 2% mescolato con ossigeno adiacente al muso del topo.
2. Tamponare e sterilizzare l'intera regione con etanolo al 70% e iodio povidone.
3. Iniettare bupivacaina per via sottocutanea appena prima dell'intervento chirurgico.
4. Praticare un'incisione longitudinale mediana di 3 mm nella parte superiore della busta.
5. Inserire un ago da 18 G contenente i fili collegati nella sacca attraverso il foro e spingere fuori i fili utilizzando una siringa interna di un ago spinale da 25 G (Figura 3A, B).
6. Lasciando la punta dell'ago da 18 G all'interno della busta, rimuovere delicatamente il cilindro interno e iniettare 3 mL di coltura Xen36 1,0 x 10⁵ CFU/mL utilizzando la siringa (Figura 3C,D).
7. Rimuovere con cautela tutti gli aghi, chiudere la pelle utilizzando una clip per ferite e sigillare con adesivo topico per la pelle (Figura 3E, F).
8. Assicurarsi che non vi siano perdite, rimettere il mouse nella gabbia individuale riscaldata con un pad termico e monitorare come prima.

5. Estrazione degli impianti dall'ascesso sottocutaneo

1. Dopo l'eutanasia per sovradosaggio di isofluorano, radere la regione cervicale, toracica e lombare dorsale del topo, quindi tamponare e sterilizzare l'intera regione con etanolo al 70% e iodio povidone (Figura 4A).
   NOTA: L'eutanasia è stata condotta in conformità con le linee guida dell'American Veterinary Medical Association (AVMA) per l'eutanasia degli animali.
2. Praticare un'incisione della linea mediana di 2 cm nella regione lombare ed esfoliare accuratamente il tessuto sottocutaneo con le forbici.
3. Estendere l'incisione e la dissezione sottocutanea prossimalmente e separare il tessuto aderente che circonda l'ascesso (Figura 4B - D).
4. Asportare l'intero ascesso sottocutaneo (Figura 4E).
5. Tagliare l'ascesso ed estrarre con cautela il filo dall'interno dell'ascesso (Figura 4F).

6. Quantificazione del biofilm formato sulle superfici implantari

1. Saggio con cristallovioletto
   1. Posizionare i fili estratti dall'ascesso nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente 1 mL di acqua deionizzata (DI).
   2. Trasferire i fili in nuovi pozzetti contenenti 1 ml di acqua deionizzata per rimuovere eventuali batteri poco aderenti dalla superficie dei fili.
   3. Fissare il biofilm sui fili con etanolo al 100% per 1 minuto e lasciarli asciugare.
   4. Trasferire i fili in nuovi pozzetti contenenti 1 mL di reagente cristallovioletto allo 0,1%.
   5. Dopo 15 minuti di colorazione, lavare delicatamente i fili due volte con acqua deionizzata per rimuovere il colorante in eccesso.
   6. Posizionare l'impianto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 250 μL di acido acetico al 33% per 15 minuti; Solubilizzare il cristallovioletto aderente al biofilm sull'impianto, quindi agitare per 1 minuto.
   7. Trasferire 200 μl della sospensione in una piastra a 96 pozzetti e misurare l'assorbanza a OD_{630 nm} utilizzando un lettore di micropiastre. Tutte le misurazioni vengono eseguite in triplice copia.
2. Conteggio delle unità formanti colonie (CFU)
   1. Rimuovere eventuali batteri leggermente aderenti dalla superficie dei fili come descritto al punto 6.1.2.
   2. Inserire l'impianto in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 200 μL di tripsina 10x e incubare a 37 °C per 1 ora.
   3. Vorticare per 1 minuto e sonicare in un bagno d'acqua a 100 W per 5 minuti, seguito da un ulteriore vortice per 30 s per staccare il biofilm nella sospensione.
   4. Inoculare 10 μl della sospensione diluita in serie sulle piastre di agar TSB (TSB in agar 1,5%) con 200 μg/mL di kanamicina.
      NOTA: Eseguire questa procedura in triplice copia per ogni soluzione.
   5. Dopo aver incubato le piastre a 37 °C per 24 ore, contare le colonie sulle piastre e calcolare il numero di cellule batteriche nella coltura originale utilizzando il conteggio medio delle colonie¹⁷.
      NOTA: Per garantire che tutti i batteri vengano rimossi dai fili, il che è fondamentale per una misurazione accurata, colorare i fili con cristallovioletto e osservarli dopo aver applicato la sospensione alle piastre. Negli esperimenti preliminari, la combinazione della dissociazione meccanica e chimica di cui sopra ha rimosso con successo tutti i biofilm di Xen36 dalle superfici del filo di acciaio inossidabile convenzionale (Figura 5).
3. Analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR)
   1. Rimuovere eventuali batteri leggermente aderenti dalla superficie dei fili come descritto al punto 6.1.2.
   2. Posizionare l'impianto in una microprovetta da 1,5 mL contenente 600 μL di TSB.
   3. Estrarre il DNA utilizzando il sistema di lisi alcalina modificata senza pellet¹⁶.
      NOTA: Il volume finale di DNA eluito è di 20 μl.
   4. Diluire il DNA 1:10 e conservarlo a -20 °C.
   5. Eseguire la qPCR per i geni luxA e 16S rRNA ¹⁶.
      NOTA: Tutte le reazioni qPCR vengono eseguite in triplice copiato. Il volume totale della miscela di reazione è di 10 μl, contenente 3 μl di DNA mascherina, 5 μl di SYBR Green, 1 μl di acqua priva di nucleasi e 0,5 μl di ciascun primer. I primer per il gene luxA sono 5'- GAGCATTTCACGGAGTTTG -3' e 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. I primer per il gene 16S rRNA sono 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' e 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC - 3'. Le condizioni della PCR sono le seguenti: denaturazione iniziale per 2 minuti a 94 °C seguita da 40 cicli di 15 s a 94 °C, 30 s a 60 °C e 30 s a 72 °C e un'estensione finale a 72 °C per 5 min.
   6. Tracciato la media dei valori di soglia a tre cicli (Ct) viene tracciata rispetto a una curva di calibrazione generata con DNA purificato direttamente da colture di Xen36 puro diluite in serie per stimare la carica batterica sull'impianto (Figura 6).

Questo studio ha valutato l'affidabilità di un approccio completo utilizzando un nuovo modello murino di infezione correlata all'impianto con valutazioni quantitative ottimizzate della formazione di biofilm sulle superfici implantari, che è stato utilizzato nel precedente studio¹⁶. I due impianti identici sono stati utilizzati per esaminare il biofilm formatosi sulle loro superfici, con l'obiettivo di verificare che entrambi gli impianti potessero essere incubati contemporaneamente in condizioni di infezione uniformi all'interno di uno spazio sottocutaneo solitario in un unico modello murino. I topi sono stati sottoposti a una procedura di creazione della sacca sottocutanea (Figura 2) e, dopo 7 giorni, i fili di acciaio inossidabile collegati sono stati impiantati nella sacca matura, seguita dall'inoculazione con Staphylococcus aureus Xen36 (Figura 3). Entro 14 giorni dall'inoculazione, un ascesso incapsulato di circa 2 cm di lunghezza e 1 cm di larghezza, contenente i fili collegati formati nella sacca (Figura 4). I fili sono stati prelevati dall'ascesso e il biofilm formato su ciascun filo è stato valutato mediante colorazione cristallovioletto, conteggio CFU e analisi qPCR. I fili colorati con cristallovioletto hanno mostrato una formazione di biofilm coerente sulle superfici, senza cambiamenti osservabili tra i due fili (Figura 7A). Le misurazioni precise per valutare la formazione del biofilm attraverso metodi analitici comparativi inter- e intra-individuali hanno indicato che le misurazioni dell'assorbanza del saggio del cristallovioletto disciolto (Figura 7B), il conteggio delle CFU (Figura 7C) e l'analisi qPCR (Figura 7D) non hanno mostrato differenze statisticamente significative nella carica batterica all'interno del biofilm su entrambi i fili. Questi risultati hanno suggerito che entrambi i fili sono stati incubati simultaneamente in condizioni di infezione identiche in una sacca sottocutanea solitaria all'interno di un singolo modello murino.

Figura 1: Preparazione dei fili collegati per l'impianto di sacca sottocutanea. (A) Un'immagine rappresentativa di un singolo impianto costituito da due fili di acciaio inossidabile collegati (lunghezza: 8 mm, diametro: 0,5 mm). (B) Una punta di una punta per pipetta da 20 μl funge da collegamento per i due fili. (C) I fili collegati vengono successivamente inseriti nella punta di un ago da 18 G per l'impianto in una sacca sottocutanea matura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Creazione di una sacca sottocutanea matura per l'impianto e l'inoculazione. (A) La vista laterale e (B) la vista dall'alto di una sacca sottocutanea completamente formata subito dopo l'iniezione d'aria. Una sacca sottocutanea viene creata sul dorso di un modello murino inserendo un ago da 27 G nella pelle lungo la linea mediana tra le scapole e iniettando 3 ml di aria sterile per via sottocutanea. Successivamente, vengono somministrati 3 ml di aria sterile a giorni alterni per 7 giorni per facilitare la maturazione di una sacca sottocutanea. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Impianto di fili collegati e inoculazione batterica in una sacca sottocutanea matura. (A) La vista laterale e (B) la vista dall'alto della procedura di inserimento dell'ago in una sacca sottocutanea matura. I fili collegati vengono inseriti nella punta di un ago da 18 G e una siringa interna di un ago spinale da 25 G viene utilizzata per spingere fuori i fili. Vengono inseriti nella sacca sottocutanea matura attraverso il foro cutaneo. I fili vengono successivamente inseriti nella sacca utilizzando un ago spinale da 25 G. Inoculazione batterica nella sacca osservata dalla vista laterale (C) e dall'alto (D). Dopo aver inserito una siringa contenente soluzione batterica all'ago da 18 G, 3 ml di coltura Xen36 (1,0 x 10⁵ CFU/ml) vengono inoculati nella busta. Il sito di inserimento viene chiuso dopo la rimozione dell'ago da 18 G, senza che vengano rilevate perdite né dalla vista laterale (E) né dalla vista dall'alto (F). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Raccolta di fili collegati in un ascesso sottocutaneo. (A) Una vista laterale di un modello murino per infezioni correlate all'impianto a 14 giorni dopo l'inoculazione. (B) La vista laterale, (C) la vista dall'alto e (D) la vista dal basso dell'ascesso sottocutaneo con i vasi sanguigni circostanti ben sviluppati dopo aver separato i tessuti aderenti. (E) L'ascesso sottocutaneo è interamente incapsulato e (F) i fili collegati sono completamente avvolti al suo interno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Rimozione del biofilm formatosi sui fili per la valutazione delle UFC. (A) Il biofilm formatosi sulle superfici di ciascun filo viene costantemente colorato con cristallovioletto a 14 giorni dopo l'inoculazione in vitro. (B) Il biofilm colorato viene diminuito dal vortice e dalla sonicazione. (C) Viene completamente eliminato con l'aggiunta di un trattamento con tripsina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Curva di calibrazione dei geni 16S rRNA e luxA in Staphylococcus aureus. Una curva di calibrazione converte i valori di Ct nella carica batterica equivalente in CFU. Viene creata una diluizione seriale della coltura pura di Staphylococcus aureus Xen36 (da 10⁸ a 10¹ CFU). Un alto coefficiente di correlazione di Pearson si ottiene per l'rRNA 16S (R² = 0,951) e luxA (R² = 0,985), indicando curve standard lineari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Valutazioni quantitative della formazione di biofilm su fili collegati all'interno di un modello murino. (A) Immagini rappresentative di un singolo impianto costituito da due fili di acciaio inossidabile collegati per l'impianto della sacca sottocutanea (a sinistra) e biofilm colorato con cristallovioletto formato sulle superfici di ciascun filo (filo 1 o filo 2) a 14 giorni dopo l'inoculazione (a destra). Le misurazioni per valutare il biofilm utilizzando metodi analitici comparativi inter- e intra-individuali vengono eseguite per ciascun filo all'interno di un modello murino (totale n = 12), tra cui (B) la misurazione dell'assorbanza del biofilm colorato con cristallo violetto (n = 4; il punto circolare indica il topo #1; il punto triangolare indica il topo #2; il punto quadrato indica il topo #3; il punto diamantato indica il topo #4). (C) conteggio CFU (n = 4; il punto circolare indica il mouse #5; il punto triangolare indica il mouse #6; il punto quadrato indica il mouse #7; il punto diamante indica il mouse #8) e (D) l'analisi qPCR (n = 4; il punto circolare indica il mouse #9; il punto triangolare indica il mouse #10; il punto quadrato indica il mouse #11; il punto diamante indica il mouse #12). Le differenze tra i gruppi di fili vengono valutate utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). Tutti i dati sono presentati come errore medio ± standard. I valori statisticamente significativi sono stati definiti come p < 0,05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo studio ha dimostrato un approccio completo per valutazioni quantitative precise della formazione di biofilm su più impianti, sfruttando un nuovo modello murino e tecniche di analisi ottimizzate per l'infezione correlata all'impianto. Per garantire che due impianti fossero incubati in condizioni di infezione identiche nello stesso soggetto, è stata creata una sacca sottocutanea matura all'interno di un singolo topo attraverso ripetute iniezioni d'aria. Questo modello ha fornito un ambiente chiuso e stabile in cui due impianti collegati potevano essere incubati in condizioni di infezione identiche, anche mentre il topo si muoveva. Dopo l'inoculazione con Staphylococcus aureus, si è sviluppato un ascesso sottocutaneo incapsulato solitario, lungo circa 2 cm, che racchiude completamente entrambi i fili e assomiglia molto alle caratteristiche delle infezioni cliniche correlate all'impianto. Entrambi i fili sono stati estratti dall'ascesso e il biofilm è stato rimosso da ciascuna superficie mediante dissociazione meccanica e chimica. La soluzione batterica disciolta è stata utilizzata per analizzare quantitativamente la carica batterica all'interno del biofilm su ciascun filo. È stata condotta un'analisi analitica comparativa inter e intraindividuale di più fili tra i due tipi di gruppi di fili per una valutazione quantitativa. Inoltre, entrambi i fili posizionati all'interno dello stesso topo sono stati misurati comparativamente per una valutazione più accurata perché sono stati incubati contemporaneamente con un'infezione uniforme. L'analisi qPCR ha utilizzato i livelli di espressione relativi del gene 16S rRNA e dell'operone lux, che codifica per la luciferasi in uno Staphylococcus aureus bioluminescente, per la valutazione quantitativa. Questo studio che ha coinvolto due fili identici non ha portato a differenze significative in tutte le valutazioni quantitative della formazione di biofilm tra i gruppi di fili in diversi topi o tra i fili all'interno di un singolo topo. Nel frattempo, lo studio precedente ha mostrato differenze significative nelle valutazioni quantitative della formazione di biofilm tra due distinti gruppi di fili in diversi topi¹⁶. Pertanto, questo approccio completo ottimizza il modello murino e le tecniche analitiche per ridurre al minimo la variabilità dei risultati, migliorando potenzialmente l'accuratezza e la riproducibilità delle valutazioni quantitative della formazione di biofilm su più biomateriali.

Sono stati stabiliti diversi modelli in vivo di infezioni correlate all'impianto per valutare l'efficacia antimicrobica nei biomateriali 9,18,19,20. In questi modelli, un singolo impianto viene tipicamente inserito nella tibia, nel femore o nel processo spinale per animale, insieme all'inoculazione batterica. Poiché l'ascesso si sviluppa intorno o adiacente all'impianto dopo l'inoculazione, imitando da vicino le caratteristiche cliniche, questi modelli sono utili per lo studio in vivo dell'infezione correlata all'impianto. Tuttavia, i risultati delle valutazioni quantitative possono essere incoerenti a causa di un singolo impianto per soggetto, dell'inoculazione in uno spazio non perfettamente chiuso e della variabilità delle risposte immunitarie e delle condizioni di infezione tra i soggetti. Inoltre, le valutazioni quantitative in questi modelli richiedono spesso competenze specialistiche e strumenti di misurazione specifici, limitandone l'applicabilità. Sebbene le dimensioni dell'impianto siano limitate in questo modello murino, questi problemi possono essere migliorati dalle caratteristiche di questa metodologia completa, che prevede l'incubazione simultanea di più impianti con batteri in condizioni di infezione identiche all'interno di un singolo topo.

La fase più critica di questo approccio è la rimozione del biofilm formato dall'impianto. Un metodo rappresentativo per la valutazione quantitativa del biofilm è la conta delle UFC, che richiede il distacco dei batteri dal biofilm, la loro sospensione in un mezzo e la successiva placcatura¹¹. Mentre le tecniche di stress meccanico che coinvolgono la sonicazione e il vortice sono comunemente utilizzate per staccare il biofilm in molti studi, ci sono preoccupazioni sulla loro sufficiente rimozione di tutto il biofilm dagli impianti. Se queste tecniche si rivelano insufficienti, l'affidabilità dei risultati può essere compromessa. Questo studio ha dimostrato che la stimolazione meccanica da sola non è in grado di staccare completamente il biofilm. Pertanto, l'integrazione del trattamento chimico con tripsina e stimolazione meccanica è necessaria per ottenere un distacco batterico più affidabile e quantificare accuratamente la carica batterica viva all'interno del biofilm²¹.

L'analisi qPCR è comunemente utilizzata negli studi sul microbioma per valutare la carica batterica complessiva all'interno del biofilm. Questo test è probabilmente un metodo più accurato per la valutazione quantitativa rispetto al test crystal violet²². Creando una curva di calibrazione con DNA plasmidico purificato direttamente da colture batteriche pure, la carica batterica all'interno del biofilm può essere accurata. Dato che il gene 16S rRNA è una subunità ribosomiale presente in tutti i batteri, la qPCR che ha come bersaglio il gene 16S rRNA è ampiamente utilizzata per la quantificazione batterica e l'espressione del gene 16S rRNA è relativamente stabile durante la crescita di Staphylococcus aureus^23,24. Il gene luxA è un componente dell'operone lux in un ceppo bioluminescente di Staphylococcus aureus Xen 36. Questo studio ha dimostrato che la qPCR per il gene luxA è efficace anche per valutare quantitativamente la formazione di biofilm dopo l'inoculazione di Xen 36. Pertanto, la valutazione quantitativa della formazione del biofilm può essere ottimizzata inoculando un batterio bioluminescente e utilizzando l'analisi dell'espressione genica dell'operone lux. Questa procedura è relativamente facile da implementare, riproducibile e consente ai ricercatori di analizzare più campioni contemporaneamente. Inoltre, è economico e non richiede attrezzature speciali, il che lo rende una scelta fattibile per qualsiasi laboratorio.

Questo approccio globale presenta alcune limitazioni. In primo luogo, questo studio mira principalmente a valutare la formazione di biofilm su impianti in un ambiente localizzato e chiuso, rendendolo così insufficiente per valutare l'impatto dei biomateriali sulle infezioni sistemiche. In secondo luogo, la carica batterica necessaria per formare un ascesso ben sviluppato in questo modello murino è considerevolmente più alta rispetto ai modelli alternativi, il che può creare un ambiente difficile per valutare la resistenza dei biomateriali al biofilm²⁵. Tuttavia, per formare un ascesso che circonda completamente gli impianti e coltivare gli impianti in condizioni di infezione batterica identiche, è stata necessaria una dose più elevata di coltura batterica. In terzo luogo, questo modello non può essere utilizzato se una delle protesi rilascia composti, poiché potrebbero influenzare l'altra protesi. In quarto luogo, la punta della pipetta utilizzata per collegare i due impianti può influenzare il decorso dell'infezione, sebbene l'utilizzo di una punta per pipette comunemente disponibile renda il modello facile da implementare in qualsiasi ambiente di laboratorio.

In conclusione, questo studio presenta un nuovo modello murino di infezione correlata all'impianto e metodi analitici ottimizzati per una precisa valutazione quantitativa della formazione del biofilm. Si prevede che questo approccio completo migliorerà l'accuratezza, la riproducibilità e la versatilità delle misure di esito per la quantificazione comparativa del biofilm su impianti chirurgici, sfruttandone le caratteristiche, contribuendo così allo sviluppo futuro di impianti antimicrobici.

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Questa ricerca è stata parzialmente finanziata da un programma di ricerca cooperativa NSF tra industria e università chiamato Center for Disruptive Musculoskeletal Innovations (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. e Rosies Base, LLC.