نموذج فأر فريد للتقييم الكمي لتكوين الأغشية الحيوية على الغرسات الجراحية في الخراج تحت الجلد

يصف هذا البروتوكول نموذجا تجريبيا فريدا للعدوى المرتبطة بالزرع يتيح الحضانة المتزامنة لزرعتين بالبكتيريا في ظل ظروف متطابقة داخل فأر واحد. كما يسمح بإجراء تقييم دقيق لتكوين الأغشية الحيوية على أسطح الزرع باستخدام طرق تحليلية مقارنة محسنة، مما يدل على التقنيات المتقدمة لتقييم الخصائص المضادة للميكروبات للمواد الحيوية.

لتطوير مادة حيوية جديدة ذات خصائص مضادة للبكتيريا للإجراءات الجراحية لتقويم العظام ، يعد إنشاء نموذج حيواني تجريبي للالتهابات المرتبطة بالزرع يحاكي الحالة المرضية عن كثب أمرا بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يلزم إجراء مقارنة كمية مع عينات التحكم لتقييم تكوين الأغشية الحيوية على المواد. ومع ذلك ، فإن النماذج الحيوانية الحالية ، التي تنطوي على زرع كل فرد بمادة واحدة ، قد تؤدي إلى نتائج غير متسقة بسبب عدم تجانس حالة العدوى بين الأشخاص. علاوة على ذلك ، لا يزال القياس الكمي الدقيق لتكوين الأغشية الحيوية على المواد في الجسم الحي يمثل تحديا ، وقد تفتقر النتائج إلى الموثوقية. لمعالجة هذه المشكلات ، أظهرت هذه الدراسة نموذجا فريدا للفأر للعدوى المرتبطة بالزرع يتيح الحضانة المتزامنة لزرعتين مع البكتيريا في بيئة مغلقة داخل فأر واحد ، مما يشكل خراج مغلف تحت الجلد. تم إنشاء كيس هواء ناضج في البداية تحت جلد الظهر. تم توصيل سلكين من الفولاذ المقاوم للصدأ ووضعهما في الحقيبة ، متبوعا بتلقيح Xen 36 ، وهي سلالة مضيئة بيولوجيا من المكورات العنقودية الذهبية. بحلول 14 يوما بعد التلقيح ، تشكل خراج تحت الجلد حول الأسلاك. تمت إزالة الأغشية الحيوية بالكامل من سطح كل سلك ، وتم قياس المعلقات البكتيرية الذائبة بدقة باستخدام طرق محسنة لتقييم تكوين الأغشية الحيوية على الغرسة ، وتحديد وحدات تكوين المستعمرات ، وإجراء تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. من خلال الاستفادة من أوبرون لوكس للبكتيريا المضيئة بيولوجيا ، تم استخدام مستويات التعبير النسبية ل luxA و 16S rRNA لتحديد الحمل البكتيري داخل الأغشية الحيوية على كل سلك. يتيح هذا النهج التحليلي المقارن الأمثل إجراء تقييمات دقيقة لتكوين الأغشية الحيوية على سلكين في ظل ظروف عدوى موحدة داخل نموذج فأر واحد وقد يسهل تقدم المواد الحيوية ذات الخصائص المضادة للبكتيريا.

لا تزال العدوى المرتبطة بالزرع تمثل تحديا كبيرا في البيئات السريرية لأنها قد تسبب معدلات عالية من المراضة والوفيات في جراحة العظام على الرغم من التقدم في التقنية الجراحية وتصميم الزرع¹. على الرغم من أن حدوث الالتهابات المرتبطة بالغرسات الجراحية قد انخفض بشكل كبير بسبب المعايير الحديثة للتحكم المعقم في بيئة غرفة العمليات والبروتوكولات المناسبة للوقاية بالمضادات الحيوية في الفترة المحيطة بالجراحة ، إلا أن حدوث الالتهابات المرتبطة بالزرع في الجراحة الأولية لا يزال 2٪ -5٪ ².

تتمثل الآلية الأساسية الأساسية للعدوى المرتبطة بالزرع في تكوين غشاء حيوي على أسطح الزرع ، والذي يحمي الكائنات الحية الدقيقة من المضادات الحيوية والجهاز المناعي ، مما يجعل من الصعب القضاء على العدوى^3،4. نظرا لأن الالتصاق البكتيريا على سطح الغرسة أمر بالغ الأهمية خلال المرحلة الأولى من تكوين الأغشية الحيوية ، فإن تقليل الالتصاق البكتيري وتكوين الأغشية الحيوية اللاحقة يعد استراتيجية أساسية لتقليل مخاطر الإصابة بالعدوى المرتبطة بالزرع. على الرغم من الخصائص المضادة للبكتيريا لتقنيات الزرع المختلفة ، إلا أنها لم يتم استخدامها على نطاق واسع سريريا بسبب الأحداث الضائرة ، مثل سمية الخلايا والحساسية^5،6،7،8. لذلك ، لا تزال هناك حاجة سريرية غير ملباة للغرسات المضادة للبكتيريا التي تنسق السلامة والفعالية والاستقرار والمتانة لتقليل مخاطر الإصابة بالعدوى المرتبطة بالزرع. يمكن أن يؤدي البحث والتطوير للغرسات ذات الخصائص المضادة للبكتيريا إلى تطوير التكنولوجيا الجراحية للتغلب على هذه المشاكل.

يعد تقييم الخصائص المضادة للبكتيريا لمختلف المواد الحيوية باستخدام نماذج حيوانية صغيرة أمرا ضروريا قبل الشروع في النماذج الحيوانية الأكبر والتجارب السريرية⁹. أظهرت العديد من الدراسات نماذج فئران قابلة للتطبيق للعدوى المرتبطة بالزرع باستخدام بكتيريا مضيئة بيولوجيا ، والتي تحتوي على luxABCDE operon^{10،11،12،13،14،15}. في حين أن هذه النماذج تسرع البحث في تطوير غرسات أو تقنيات مضادة للبكتيريا ، إلا أن لها قيودا معينة. أولا ، غالبا ما تكون الخبرة المتقدمة والمعدات المتخصصة ، مثل الأشعة السينية أو أنظمة التصوير المخصصة ، مطلوبة لتقييم الحمل البكتيري على الغرسات الموضوعة في نماذج الفئران بشكل مباشر ودقيق. ثانيا ، في حين أن الغرسات التي تم جمعها عادة ما تقيم الغرسة الانفرادية في موقع عدوى واحد لكل ، فقد تختلف ظروف العدوى والاستجابات المناعية بين الأفراد ، مما قد يؤدي إلى تباين في نتائج التقييمات المقارنة. لذلك ، عند مقارنة التأثيرات المضادة للبكتيريا للمواد الحيوية المختلفة في الجسم الحي ، فإن زرعها وتلقيحها بالبكتيريا في إعدادات موحدة يكون أكثر فائدة لمعالجة هذه المشكلات. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري تحسين المنهجية الحالية وإجراء تقييمات كمية مع قابلية التكرار والدقة من خلال استغلال خصائص النموذج الحيواني والبكتيريا المستخدمة.

تقدم هذه الدراسة نهجا تجريبيا جديدا للعدوى المرتبطة بالزرع في الجسم الحي يتيح إجراء قياسات دقيقة لتقييم تكوين الأغشية الحيوية على أسطح زرعتين داخل نموذج فأر واحد من خلال طرق تحليلية مقارنة بين الأفراد وداخلها. يمكن قياس الأغشية الحيوية الموجودة على كل غرسة باستخدام طرق محسنة لتصور الأغشية الحيوية على الغرسة ، وتحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) وتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لسلالة مضيئة حيوية من المكورات العنقودية الذهبية ، Xen 36. أظهرت الدراسة السابقة أن غرسة معدنية جديدة تمتلك فعالية واعدة مضادة للبكتيريا في الجسم الحي ضد المكورات العنقودية الذهبية باستخدام هذا النهج^{الشامل 16}. يمكن تنفيذ هذه المنهجية بسهولة في بيئة معملية قياسية وقد تسرع البحث في تطوير المواد الحيوية المضادة للبكتيريا.

تتم الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو (UCSF) ويتم إجراؤها في منشأة BSL2 بعد التشاور والموافقة من قبل برنامج مخاطر السلامة البيولوجية UCSF ، الذي تديره UCSF للصحة والسلامة البيئية. تم استخدام ذكور وإناث C57BL / 6 الفئران (12-16 أسبوعا ، 25-50 مجم). تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير البكتيريا

1. استخدم المكورات العنقودية الذهبية Xen36 (ATCC49525) كعامل ممرض.
   ملاحظة: يتم الحصول على هذه السلالة من مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ماناساس ، فيرجينيا) وتستخدم بشكل فريد عامل luxABCDE ، والذي تم تحسينه ودمجه في البلازميد الأصلي للمضيف. يستخدم Xen36 أيضا جين مقاومة الكاناميسين المرتبط بأوبرون لوكس .
2. أضف كمية صغيرة من مخزون الجلسرين المجمد من Xen 36 وأضف القطع إلى 5 مل من وسط مرق الصويا المشبقي (TSB) الذي يحتوي على 200 ميكروغرام / مل كاناميسين.
3. احتضان المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
4. قم بوضع Xen36 على ألواح أجار TSB (TSB في أجار 1.5٪) تحتوي على 200 ميكروغرام / مل من الكاناميسين وتحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
5. عزل مستعمرات مفردة من Xen36 وزراعتها في 5 مل من TSB تحتوي على 200 ميكروغرام / مل كاناميسين طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز (200 دورة في الدقيقة).
6. قم بقياس امتصاص الثقافة الناتجة عند 630 نانومتر.
7. قم بتخفيف الثقافة وعمل ثقافة Xen36 بحجم 1.0 × 10⁸ CFU / مل بناء على الامتصاص عند 630 نانومتر.
   ملاحظة: قياس الامتصاص عند 630 نانومتر (مقابل فراغ TSB) البالغ 0.5 يعادل تقريبا 1.0 × 10⁸ CFU / مل من Xen36.
8. قم بتخفيف الثقافة وعمل ثقافة Xen36 بحجم 1.0 × 10⁵ CFU / مل.

2. تحضير الغرسات المتصلة

1. استخدم سلكين على شكل قضيب يتكون من الفولاذ المقاوم للصدأ من الدرجة الجراحية المتوفرة تجاريا (SUS316L) ، يبلغ طول كل منهما 8 مم وقطره 0.5 مم.
2. قم بتوصيل السلكين عموديا عن طريق إدخالهما في طرفي طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر مقطوعة بطول 3 مم تقريبا.
   ملاحظة: أدخل الأسلاك المتصلة رأسيا في طرف إبرة 18 G (الشكل 1). تأكد من أن الأسلاك مؤمنة بإحكام بواسطة طرف الماصة لمنع الانفصال.
3. قم بتعقيم الأسلاك قبل زرعها جراحيا في الفئران.

3. إنشاء كيس ناضج تحت الجلد

ملاحظة: قبل 7 أيام من التلقيح البكتيري ، قم بإنشاء كيس الهواء على النحو التالي:

1. تخدير الفأر (C57BL / 6) بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران عن طريق الاستنشاق (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
   ملاحظة: قم بتقييم المستوى المناسب للتخدير من خلال مراقبة معدل التنفس ، وتوتر العضلات ، وقرص إصبع القدم ، وانعكاس القرنية ، ولون الأغشية المخاطية. استخدم مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
2. انقل الفأر المخدر إلى سرير الجراحة وحلق منطقة عنق الرحم / الصدر الظهرية للفأر.
3. امسح وتعقيم المنطقة بأكملها بنسبة 70٪ من الإيثانول واليود.
4. املأ حقنة سعة 10 مل بهواء معقم وقم بتوصيل إبرة 27 جم بالمخرج.
5. قم بقرص قاعدة عنق الفأر برفق وارفعها لخلق مسافة بين الأنسجة تحت الجلد واللفافة.
6. ضع الإبرة في خط الوسط بين لوح الكتف وحقن 3 مل من الهواء المعقم تحت الجلد لإنشاء كيس الهواء (الشكل 2).
   ملاحظة: أثناء حقن الهواء ، اضغط باستمرار على جانبي الظهر باليد المعاكسة لضمان انتشار الهواء إلى منتصف الظهر ، مما يؤدي إلى إنشاء كيس في المنتصف.
7. أعد الفأر إلى قفص دافئ بلوحة حرارية وراقبه عن كثب حتى يتعافى من التخدير.
8. حقن 3 مل من الهواء المعقم كما هو موضح أعلاه للحفاظ على تضخم التجويف وإنشاء كيس ناضج كل يومين.
   ملاحظة: قبل كل نفخ ، قم بشفط الهواء من الكيس لتأكيد الوضع الصحيح لطرف الإبرة. قم بإزالة المحقنة بعناية من الإبرة ، مع ترك طرف الإبرة في الحقيبة. أعد نفخ الكيس ب 3 مل من الهواء المعقم.

4. زرع الأسلاك المتصلة والتلقيح البكتيري

1. بعد 7 أيام من حقن الهواء الأول ، قم بتخدير الفأر كما هو موضح في الخطوة 3.1.
   ملاحظة: أثناء العملية الجراحية ، تحقق باستمرار من أن الفأر يتنفس ومخدر. عادة ما تستغرق العملية الجراحية بأكملها من 10 إلى 15 دقيقة عند إجراؤها بواسطة جراح مدرب. يتم الحفاظ على التخدير عن طريق وضع أنبوب يوصل 2٪ من الأيزوفلوران الممزوج بالأكسجين المجاور لأنف الفأر.
2. امسح وتعقيم المنطقة بأكملها بنسبة 70٪ من الإيثانول واليود.
3. حقن بوبيفاكائين تحت الجلد قبل الجراحة مباشرة.
4. قم بعمل شق طولي في خط الوسط 3 مم في الجزء العلوي من الحقيبة.
5. أدخل إبرة 18 G تحتوي على الأسلاك المتصلة في الحقيبة من خلال الفتحة وادفع الأسلاك للخارج باستخدام حقنة داخلية لإبرة شوكية 25 G (الشكل 3 أ ، ب).
6. اترك طرف الإبرة 18 جم داخل الحقيبة ، قم بإزالة الأسطوانة الداخلية برفق وحقن 3 مل من ثقافة Xen36 1.0 × 10⁵ CFU / مل باستخدام المحقنة (الشكل 3C ، D).
7. قم بإزالة جميع الإبر بعناية ، وأغلق الجلد باستخدام مشبك الجرح ، وأغلقه بمادة لاصقة موضعية للجلد (الشكل 3E ، F).
8. تأكد من عدم وجود تسرب ، وأعد الماوس إلى القفص الفردي الدافئ بلوحة حرارية ، وراقبه كما كان من قبل.

5. استخراج الغرسات من الخراج تحت الجلد

1. بعد القتل الرحيم عن طريق جرعة زائدة من الأيزوفلوران ، حلق المنطقة الظهرية العنقية والصدرية والقطنية للفأر ، وقم بمسح وتعقيم المنطقة بأكملها بنسبة 70٪ من الإيثانول والبوفيدون اليود (الشكل 4 أ).
   ملاحظة: تم إجراء القتل الرحيم وفقا لإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA) للقتل الرحيم للحيوانات.
2. قم بعمل شق خط الوسط بطول 2 سم في منطقة أسفل الظهر وقم بتقشير الأنسجة تحت الجلد بعناية باستخدام المقص.
3. قم بتمديد الشق والتسلخ تحت الجلد بشكل قريب وافصل الأنسجة الملتصقة المحيطة بالخراج (الشكل 4 ب - د).
4. استئصال الخراج تحت الجلد بالكامل (الشكل 4E).
5. اقطع الخراج واستخرج السلك بعناية من داخل الخراج (الشكل 4F).

6. القياس الكمي للأغشية الحيوية المشكلة على أسطح الزرع

1. فحص البنفسجي الكريستالي
   1. ضع الأسلاك المستخرجة من الخراج في آبار فردية من صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 1 مل من الماء منزوع الأيونات (DI).
   2. انقل الأسلاك إلى آبار جديدة تحتوي على 1 مل من ماء DI لإزالة أي بكتيريا غير ملتصقة بشكل فضفاض من سطح الأسلاك.
   3. قم بتثبيت الأغشية الحيوية على الأسلاك باستخدام الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة واتركها تجف.
   4. انقل الأسلاك إلى آبار جديدة تحتوي على 1 مل من كاشف بنفسجي بلوري 0.1٪.
   5. بعد 15 دقيقة من التلوين ، اغسل الأسلاك برفق مرتين بماء DI لإزالة أي صبغة زائدة.
   6. ضع الغرسة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 250 ميكرولتر من حمض الأسيتيك 33٪ لمدة 15 دقيقة ؛ قم بإذابة البنفسج البلوري الملتصق بالغشاء الحيوي على الغرسة ، متبوعا بالدوامة لمدة 1 دقيقة.
   7. انقل 200 ميكرولتر من التعليق إلى صفيحة ذات 96 بئرا وقم بقياس الامتصاص عند OD_{630 نانومتر} باستخدام قارئ صفيحة دقيقة. يتم إجراء جميع القياسات في ثلاث نسخ.
2. عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU)
   1. قم بإزالة أي بكتيريا غير ملتصقة بشكل فضفاض من سطح الأسلاك كما هو موضح في الخطوة 6.1.2.
   2. ضع الغرسة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 200 ميكرولتر من 10x trypsin واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
   3. دوامة لمدة 1 دقيقة والصوتنة في حمام مائي عند 100 واط لمدة 5 دقائق ، تليها دوامة إضافية لمدة 30 ثانية لفصل الأغشية الحيوية في التعليق.
   4. تلقيح 10 ميكرولتر من المعلق المخفف بشكل متسلسل على ألواح أجار TSB (TSB في أجار 1.5٪) ب 200 ميكروغرام / مل كاناميسين.
      ملاحظة: قم بتنفيذ هذا الإجراء ثلاث نسخ لكل محلول.
   5. بعد احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، عد المستعمرات على الصفائح واحسب عدد الخلايا البكتيرية في الثقافة الأصلية باستخدام متوسط عدد المستعمرات¹⁷.
      ملاحظة: لضمان إزالة جميع البكتيريا من الأسلاك ، وهو أمر بالغ الأهمية للقياس الدقيق ، قم بتلطيخ الأسلاك باللون البنفسجي الكريستالي وراقبها بعد تطبيق التعليق على الألواح. في التجارب الأولية ، نجح الجمع بين التفكك الميكانيكي والكيميائي أعلاه في إزالة جميع الأغشية الحيوية Xen36 من أسطح أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ التقليدية (الشكل 5).
3. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)
   1. قم بإزالة أي بكتيريا غير ملتصقة بشكل فضفاض من سطح الأسلاك كما هو موضح في الخطوة 6.1.2.
   2. ضع الغرسة في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 600 ميكرولتر من TSB.
   3. استخراج الحمض النووي باستخدام نظام التحلل القلوي المعدل الخالي من الحبيبات¹⁶.
      ملاحظة: الحجم النهائي للحمض النووي الملوطوف هو 20 ميكرولتر.
   4. خفف الحمض النووي 1:10 وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
   5. قم بإجراء qPCR لجينات luxA و 16S rRNA ¹⁶.
      ملاحظة: يتم إجراء جميع تفاعلات qPCR في ثلاث نسخ. يبلغ إجمالي حجم مزيج التفاعل 10 ميكرولتر ، يحتوي على 3 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 5 ميكرولتر من SYBR Green ، و 1 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، و 0.5 ميكرولتر من كل طبقة أولية. بادئات لجين luxA هي 5'- GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3' و 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. البادئات لجين 16S rRNA هي 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3 'و 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTC - 3'. شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل هي كما يلي: التمسخ الأولي لمدة دقيقتين عند 94 درجة مئوية متبوعا ب 40 دورة من 15 ثانية عند 94 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 60 درجة مئوية ، و 30 ثانية عند 72 درجة مئوية ، والتمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   6. رسم متوسط قيم عتبة الدورات الثلاث (Ct) مقابل منحنى معايرة تم إنشاؤه باستخدام الحمض النووي المنقى مباشرة من مزارع Xen36 النقية المخففة بشكل متسلسل لتقدير الحمل البكتيري على الغرسة (الشكل 6).

قيمت هذه الدراسة موثوقية نهج شامل باستخدام نموذج فأر جديد للعدوى المرتبطة بالزرع مع تقييمات كمية محسنة لتكوين الأغشية الحيوية على أسطح الزرع ، والتي تم استخدامها في الدراسة السابقة¹⁶. تم استخدام الزرعتين المتطابقتين لفحص الأغشية الحيوية المتكونة على أسطحهما ، بهدف التحقق من أنه يمكن تحضين كلتا الزرعتين في وقت واحد في ظروف عدوى موحدة داخل مساحة منفردة تحت الجلد في نموذج فأر واحد. خضعت الفئران لإجراء إنشاء كيس تحت الجلد (الشكل 2) ، وبعد 7 أيام ، تم زرع أسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ المتصلة في الحقيبة الناضجة ، متبوعا بالتلقيح بالمكورات العنقودية الذهبية Xen36 (الشكل 3). بحلول 14 يوما بعد التلقيح ، يكون خراج مغلف يبلغ طوله حوالي 2 سم وعرضه 1 سم ، يحتوي على الأسلاك المتصلة المتكونة في الحقيبة (الشكل 4). تم حصاد الأسلاك من الخراج ، وتم تقييم الأغشية الحيوية المتكونة على كل سلك عن طريق تلطيخ البنفسج البلوري ، وعد CFU ، وتحليل qPCR. أظهرت الأسلاك الملطخة بالبنفسج الكريستالي تكوينا متسقا للأغشية الحيوية على الأسطح ، مع عدم وجود تغييرات ملحوظة بين كلا السلكين (الشكل 7 أ). أشارت القياسات الدقيقة لتقييم تكوين الأغشية الحيوية من خلال الطرق التحليلية المقارنة بين الأفراد وداخلها إلى أن قياسات امتصاص مقايسة البنفسج البلوري المذاب (الشكل 7 ب) ، وعد CFU (الشكل 7 ج) ، وتحليل qPCR (الشكل 7 د) لم تظهر أي اختلافات ذات دلالة إحصائية في الحمل البكتيري داخل الأغشية الحيوية على كلا السلكين. أشارت هذه النتائج إلى أن كلا السلكين قد تم احتضانهما في وقت واحد في ظل ظروف عدوى متطابقة في كيس منفرد تحت الجلد داخل نموذج فأر واحد.

الشكل 1: تحضير الأسلاك المتصلة لزرع الحقيبة تحت الجلد. (أ) صورة تمثيلية لغرسة واحدة تتكون من سلكين متصلين من الفولاذ المقاوم للصدأ (الطول: 8 مم ، القطر: 0.5 مم). (ب) يعمل طرف طرف ماصة سعة 20 ميكرولتر كوصلة للسلكين. (ج) يتم إدخال الأسلاك المتصلة لاحقا في طرف إبرة 18 جم لزرعها في كيس ناضج تحت الجلد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: إنشاء كيس ناضج تحت الجلد للزرع والتلقيح. (أ) المنظر الجانبي ، و (ب) المنظر العلوي لحقيبة تحت الجلد كاملة التكوين بعد حقن الهواء مباشرة. يتم إنشاء كيس تحت الجلد على الجزء الخلفي من طراز الفأر عن طريق إدخال إبرة 27 جم في الجلد على طول خط الوسط بين لوح الكتف وحقن 3 مل من الهواء المعقم تحت الجلد. بعد ذلك ، يتم إعطاء 3 مل من الهواء المعقم كل يومين لمدة 7 أيام لتسهيل نضوج الحقيبة تحت الجلد. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: زرع الأسلاك المتصلة والتلقيح البكتيري في كيس تحت الجلد الناضج. (أ) المنظر الجانبي ، و (ب) المنظر العلوي لإجراء إدخال الإبرة في كيس ناضج تحت الجلد. يتم وضع الأسلاك المتصلة في طرف إبرة 18 G ، ويتم استخدام حقنة داخلية من إبرة شوكية 25 G لدفع الأسلاك للخارج. يتم إدخالها في الحقيبة الناضجة تحت الجلد من خلال ثقب الجلد. يتم وضع الأسلاك لاحقا في الحقيبة باستخدام إبرة شوكية 25 جرام. التلقيح البكتيري في الحقيبة كما لوحظ من المنظر الجانبي (C) والمنظر العلوي (D). بعد ربط حقنة تحتوي على محلول بكتيري بإبرة 18 جم ، يتم تلقيح 3 مل من مزرعة Xen36 (1.0 × 10⁵ CFU / مل) في الحقيبة. يتم إغلاق موقع الإدخال بعد إزالة إبرة 18 G، مع عدم اكتشاف أي تسرب من المنظر الجانبي (E) أو المنظر العلوي (F). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مجموعة الأسلاك المتصلة في خراج تحت الجلد. (أ) عرض جانبي لنموذج فأر للعدوى المرتبطة بالزرع بعد 14 يوما من التطعيم. (ب) المنظر الجانبي ، (ج) المنظر العلوي ، و (د) المنظر السفلي للخراج تحت الجلد مع الأوعية الدموية المحيطة المتطورة بعد فصل الأنسجة الملتصقة. (ه) يتم تغليف الخراج تحت الجلد بالكامل ، و (و) يتم تغليف الأسلاك المتصلة بالكامل بداخله. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: إزالة الأغشية الحيوية المتكونة على الأسلاك لتقييم CFU. (أ) يتم تلطيخ الأغشية الحيوية المتكونة على أسطح كل سلك باستمرار بالبنفسج البلوري بعد 14 يوما من التلقيح في المختبر. (ب) يتضاءل الأغشية الحيوية الملطخة عن طريق الدوامة والصوتنة. (ج) يتم التخلص منه تماما عن طريق إضافة علاج التربسين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: منحنى معايرة جينات 16S rRNA و luxA في المكورات العنقودية الذهبية. يحول منحنى المعايرة قيم Ct إلى الحمل البكتيري المكافئ في CFU. يتم إنشاء تخفيف تسلسلي لثقافة المكورات العنقودية الذهبية Xen36 النقية (10⁸ إلى 10¹ CFU). يتم الحصول على معامل ارتباط بيرسون مرتفع ل 16S rRNA (R² = 0.951) و luxA (R² = 0.985) ، مما يشير إلى المنحنيات القياسية الخطية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: التقييمات الكمية لتكوين الأغشية الحيوية على الأسلاك المتصلة داخل نموذج الفأر. (أ) صور تمثيلية لغرسة واحدة تتكون من سلكين متصلين من الفولاذ المقاوم للصدأ لزرع الحقيبة تحت الجلد (يسار) وغشاء حيوي بلوري ملطخ بالبنفسج المتشكل على أسطح كل سلك (السلك 1 أو السلك 2) بعد 14 يوما من التلقيح (يمين). يتم إجراء قياسات لتقييم الأغشية الحيوية باستخدام طرق تحليلية مقارنة بين الفرديين وداخلهم لكل سلك داخل نموذج الفأر (إجمالي n = 12) ، بما في ذلك (ب) قياس امتصاص الأغشية الحيوية الملطخة بالبنفسج البلوري (ن = 4 ؛ تشير نقطة الدائرة إلى الماوس # 1 ؛ نقطة المثلث تشير إلى الماوس # 2 ؛ النقطة المربعة تشير إلى الماوس # 3 ؛ النقطة الماسية تشير إلى الماوس # 4). (ج) عد CFU (ن = 4 ؛ نقطة دائرية تشير إلى الماوس # 5 ؛ نقطة المثلث تشير إلى الماوس # 6 ؛ نقطة مربعة تشير إلى الماوس # 7 ؛ النقطة الماسية تشير إلى الماوس # 8) ، و (د) تحليل qPCR (ن = 4 ؛ نقطة دائرة تشير إلى الماوس # 9 ؛ نقطة المثلث تشير إلى الماوس # 10 ؛ نقطة مربعة تشير إلى الماوس # 11 ؛ النقطة الماسية تشير إلى الماوس # 12). يتم تقييم الاختلافات بين مجموعات الأسلاك باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA). يتم تقديم جميع البيانات كخطأ معياري ± متوسط. تم تعريف القيم ذات الدلالة الإحصائية على أنها p < 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أظهرت هذه الدراسة نهجا شاملا للتقييمات الكمية الدقيقة لتكوين الأغشية الحيوية على غرسات متعددة من خلال الاستفادة من نموذج فأر جديد وتقنيات التحليل المحسنة للعدوى المرتبطة بالزرع. لضمان احتضان زرعتين في ظل ظروف عدوى متطابقة في نفس الموضوع ، تم إنشاء كيس ناضج تحت الجلد داخل فأر واحد من خلال حقن الهواء المتكرر. وفر هذا النموذج بيئة مغلقة ومستقرة حيث يمكن احتضان زرعتين متصلتين في ظل ظروف عدوى متطابقة ، حتى أثناء تحرك الفأر. بعد التلقيح بالمكورات العنقودية الذهبية ، تم تطوير خراج مغلف منفرد تحت الجلد ، يبلغ طوله حوالي 2 سم ، ويحيط بكلا السلكين بالكامل ويشبه إلى حد كبير خصائص الالتهابات المرتبطة بالزرع السريري. تم استخراج كلا السلكين من الخراج ، وتمت إزالة الأغشية الحيوية من كل سطح باستخدام التفكك الميكانيكي والكيميائي. تم استخدام المحلول البكتيري المذاب لتحليل الحمل البكتيري داخل الأغشية الحيوية على كل سلك. تم إجراء تحليل تحليلي مقارن بين الأفراد وداخلهم للأسلاك المتعددة بين نوعي مجموعات الأسلاك للتقييم الكمي. بالإضافة إلى ذلك ، تم قياس كلا السلكين الموضوعين داخل نفس الماوس نسبيا لتقييم أكثر دقة لأنهما تم احتضانهما في نفس الوقت بعدوى موحدة. استخدم تحليل qPCR مستويات التعبير النسبية لجين 16S rRNA ومشغل لوكس ، الذي يشفر لوسيفيراز في المكورات العنقودية الذهبية المضيئة بيولوجيا ، للتقييم الكمي. لم تسفر هذه الدراسة التي شملت سلكين متطابقين عن فروق ذات دلالة إحصائية في جميع التقييمات الكمية لتكوين الأغشية الحيوية بين مجموعات الأسلاك في عدة فئران أو بين الأسلاك داخل فأر واحد. وفي الوقت نفسه ، أظهرت الدراسة السابقة اختلافات كبيرة في التقييمات الكمية لتكوين الأغشية الحيوية بين مجموعتين متمايزتين من الأسلاك في العديد من^{الفئران 16}. لذلك ، يعمل هذا النهج الشامل على تحسين نموذج الفأر والتقنيات التحليلية لتقليل تباين النتائج ، مما قد يعزز دقة وقابلية استنساخ التقييمات الكمية لتكوين الأغشية الحيوية على مواد حيوية متعددة.

تم إنشاء العديد من النماذج في الجسم الحي للعدوى المرتبطة بالزرع لتقييم فعالية مضادات الميكروبات في المواد^{الحيوية 9،18،19،20}. في هذه النماذج ، عادة ما يتم وضع غرسة واحدة في عملية الساق أو عظم الفخذ أو العمود الفقري لكل ، جنبا إلى جنب مع التلقيح البكتيري. نظرا لأن الخراج يتم تطويره حول الغرسة أو بجوارها بعد التلقيح ، مما يحاكي عن كثب السمات السريرية ، فإن هذه النماذج مفيدة في دراسة العدوى المرتبطة بالزرع في الجسم الحي . ومع ذلك ، قد تكون نتائج التقييمات الكمية غير متسقة بسبب زرع واحد لكل موضوع ، والتلقيح في مكان مغلق بشكل غير كامل ، والتباين في الاستجابات المناعية وظروف العدوى بين الأشخاص. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب التقييمات الكمية في هذه النماذج في كثير من الأحيان خبرة متخصصة وأجهزة قياس محددة ، مما يحد من قابليتها للتطبيق. على الرغم من أن حجم الغرسة محدود في نموذج الفأر هذا ، إلا أنه يمكن تحسين هذه المشكلات من خلال سمات هذه المنهجية الشاملة ، والتي تتضمن الحضانة المتزامنة لغرسات متعددة مع البكتيريا في ظل ظروف عدوى متطابقة داخل فأر واحد.

الخطوة الأكثر أهمية في هذا النهج هي إزالة الأغشية الحيوية المشكلة من الزرع. طريقة تمثيلية للتقييم الكمي للأغشية الحيوية هي عد CFU ، والذي يتطلب فصل البكتيريا عن الأغشية الحيوية ، وتعليقها في وسط ، والطلاء اللاحق¹¹. في حين أن تقنيات الإجهاد الميكانيكي التي تنطوي على صوتنة ودوامة تستخدم بشكل شائع لفصل الأغشية الحيوية في العديد من الدراسات ، إلا أن هناك مخاوف بشأن كفايتها في إزالة جميع الأغشية الحيوية تماما من الغرسات. إذا ثبت أن هذه التقنيات غير كافية ، فقد تتعرض موثوقية النتائج للخطر. أظهرت هذه الدراسة أن التحفيز الميكانيكي وحده لا يمكن أن يفصل الأغشية الحيوية تماما. لذلك ، يعد دمج العلاج الكيميائي مع التربسين والتحفيز الميكانيكي ضروريا لتحقيق انفصال بكتيري أكثر موثوقية وتحديد الحمل البكتيري الحي بدقة داخل الأغشية^{الحيوية 21}.

يستخدم تحليل qPCR بشكل شائع في دراسات الميكروبيوم لتقييم الحمل البكتيري الكلي داخل الأغشية الحيوية. من المحتمل أن يكون هذا الاختبار طريقة أكثر دقة للتقييم الكمي من مقايسة البنفسج البلوري²². من خلال إنشاء منحنى معايرة باستخدام الحمض النووي البلازميدي المنقى مباشرة من المزارع البكتيرية النقية ، يمكن أن يكون الحمل البكتيري داخل الأغشية الحيوية دقيقا. بالنظر إلى أن جين 16S rRNA هو وحدة فرعية ريبوسومية موجودة في جميع البكتيريا ، فإن qPCR الذي يستهدف جين 16S rRNA يستخدم على نطاق واسع للقياس الكمي البكتيري ، والتعبير عن جين 16S rRNA مستقر نسبيا أثناء نمو المكورات العنقودية الذهبية^23،24. الجين luxA هو أحد مكونات أوبرون لوكس في سلالة مضيئة بيولوجية من المكورات العنقودية الذهبية Xen 36. أظهرت هذه الدراسة أن qPCR لجين luxA فعال أيضا في التقييم الكمي لتكوين الأغشية الحيوية بعد تلقيح Xen 36. وبالتالي ، يمكن تحسين التقييم الكمي لتكوين الأغشية الحيوية عن طريق تلقيح بكتيريا مضيئة بيولوجيا واستخدام تحليل التعبير الجيني لأوبرون لوكس. هذا الإجراء سهل التنفيذ نسبيا وقابل للتكرار ويمكن الباحثين من تحليل عينات متعددة في وقت واحد. علاوة على ذلك ، فهي اقتصادية ولا تتطلب معدات خاصة ، مما يجعلها خيارا ممكنا لأي مختبر.

هذا النهج الشامل له بعض القيود. أولا ، تهدف هذه الدراسة في المقام الأول إلى تقييم تكوين الأغشية الحيوية على الغرسات في بيئة موضعية ومغلقة ، مما يجعلها غير كافية لتقييم تأثير المواد الحيوية على الالتهابات الجهازية. ثانيا ، الحمل البكتيري المطلوب لتكوين خراج متطور في نموذج الفأر هذا أعلى بكثير مما هو عليه في النماذج البديلة ، مما قد يخلق بيئة صعبة لتقييم مقاومة المواد الحيوية للأغشية^{الحيوية 25}. ومع ذلك ، لتشكيل خراج يحيط تماما بالغرسات وزراعة الغرسات في ظل ظروف عدوى بكتيرية متطابقة ، كانت هناك حاجة إلى جرعة أعلى من زراعة البكتيريا. ثالثا ، لا يمكن استخدام هذا النموذج إذا أطلقت إحدى الغرسات مركبات ، لأنها قد تؤثر على الغرسة الأخرى. رابعا، قد يؤثر طرف الماصة المستخدم لتوصيل الغرستين على مسار العدوى، على الرغم من أن استخدام طرف الماصة المتاح بشكل شائع يجعل النموذج سهل التنفيذ في أي بيئة معملية.

في الختام ، تقدم هذه الدراسة نموذجا جديدا للفأر للعدوى المرتبطة بالزرع وطرقا تحليلية محسنة للتقييم الكمي الدقيق لتكوين الأغشية الحيوية. من المتوقع أن يعزز هذا النهج الشامل دقة وقابلية التكرار والتنوع في مقاييس النتائج لقياس الأغشية الحيوية المقارن على الغرسات الجراحية من خلال استغلال سماته ، وبالتالي المساهمة في التطوير المستقبلي للغرسات المضادة للميكروبات.

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح متضاربة.

تم تمويل هذا البحث جزئيا من قبل برنامج أبحاث تعاوني للصناعة / الجامعة NSF يسمى مركز الابتكارات العضلية الهيكلية التخريبية (IIP-1916629) ، و Komatsuseiki Kosakusho Co.، Ltd. ، و Rosies Base، LLC.