Ein einzigartiges Mausmodell zur quantitativen Beurteilung der Biofilmbildung auf chirurgischen Implantaten bei subkutanem Abszess

Dieses Protokoll beschreibt ein einzigartiges experimentelles Modell implantatbedingter Infektionen, das die gleichzeitige Inkubation von zwei Implantaten mit Bakterien unter identischen Bedingungen innerhalb einer einzigen Maus ermöglicht. Es ermöglicht auch eine präzise Beurteilung der Biofilmbildung auf Implantatoberflächen mit optimierten vergleichenden Analysemethoden und demonstriert fortschrittliche Techniken zur Bewertung der antimikrobiellen Eigenschaften von Biomaterialien.

Um ein neuartiges Biomaterial mit antibakteriellen Eigenschaften für orthopädische chirurgische Eingriffe zu entwickeln, ist die Etablierung eines experimentellen Tiermodells für implantatbedingte Infektionen, das den pathologischen Zustand genau nachahmt, von entscheidender Bedeutung. Zusätzlich ist ein quantitativer Vergleich mit Kontrollproben erforderlich, um die Biofilmbildung auf Materialien zu beurteilen. Aktuelle Tiermodelle, bei denen jedem Individuum ein einzelnes Material implantiert wird, können jedoch aufgrund der Heterogenität des Infektionsstatus bei den Probanden zu inkonsistenten Ergebnissen führen. Darüber hinaus bleibt die genaue Quantifizierung der Biofilmbildung auf Materialien in vivo eine Herausforderung, und die Ergebnisse sind möglicherweise nicht zuverlässig. Um diese Probleme zu lösen, wurde in dieser Studie ein einzigartiges Mausmodell für implantatbedingte Infektionen demonstriert, das die gleichzeitige Inkubation von zwei Implantaten mit Bakterien in einer geschlossenen Umgebung innerhalb einer einzigen Maus ermöglicht, wodurch ein eingekapselter subkutaner Abszess gebildet wird. Unter der Haut des Rückens wurde zunächst ein ausgereifter Airpouch erstellt. Zwei Edelstahldrähte wurden miteinander verbunden und in den Beutel gelegt, gefolgt von der Inokulation mit Xen 36, einem biolumineszierenden Stamm von Staphylococcus aureus. 14 Tage nach der Inokulation hatte sich ein subkutaner Abszess um die Drähte gebildet. Der Biofilm wurde vollständig von der Oberfläche jedes Drahtes entfernt, und die gelösten bakteriellen Suspensionen wurden mit optimierten Methoden genau gemessen, um die Biofilmbildung auf dem Implantat zu beurteilen, koloniebildende Einheiten zu bestimmen und eine quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse durchzuführen. Durch die Nutzung des Lux-Operons der biolumineszierenden Bakterien wurden die relativen Expressionsniveaus von luxA und 16S rRNA verwendet, um die bakterielle Belastung innerhalb des Biofilms auf jedem Draht zu bestimmen. Dieser optimierte vergleichende analytische Ansatz ermöglicht eine präzise Beurteilung der Biofilmbildung auf zwei Drähten unter einheitlichen Infektionsbedingungen innerhalb eines einzigen Mausmodells und kann die Weiterentwicklung von Biomaterialien mit antibakteriellen Eigenschaften erleichtern.

Implantatbedingte Infektionen stellen im klinischen Umfeld nach wie vor eine große Herausforderung dar, da sie in der orthopädischen Chirurgie trotz Fortschritten in der Operationstechnik und im Implantatdesign hohe Morbiditäts- und Mortalitätsraten verursachen können¹. Obwohl die Inzidenz von Infektionen im Zusammenhang mit chirurgischen Implantaten aufgrund moderner Standards der aseptischen Kontrolle im Operationssaal und geeigneter Protokolle für die perioperative Antibiotikaprophylaxe deutlich zurückgegangen ist, bleibt die Inzidenz implantatbedingter Infektionen in der Primärchirurgie bei 2 % bis 5 %².

Der primäre zugrundeliegende Mechanismus implantatbedingter Infektionen ist die Bildung eines Biofilms auf den Implantatoberflächen, der Mikroorganismen vor Antibiotika und das Immunsystem schützt, wodurch die Infektion schwer auszurotten ist ^3,4. Da die bakterielle Adhäsion auf der Implantatoberfläche in der ersten Phase der Biofilmbildung von entscheidender Bedeutung ist, ist die Minimierung der bakteriellen Adhäsion und der anschließenden Biofilmbildung eine wesentliche Strategie, um das Risiko implantatbedingter Infektionen zu verringern. Trotz der antibakteriellen Eigenschaften verschiedener Implantattechnologien wurden diese aufgrund von unerwünschten Ereignissen wie Zelltoxizität und Allergien klinisch nicht weit verbreitet eingesetzt 5,6,7,8. Daher besteht nach wie vor ein ungedeckter klinischer Bedarf an antibakteriellen Implantaten, die Sicherheit, Wirksamkeit, Stabilität und Haltbarkeit in Einklang bringen, um das Risiko implantatbedingter Infektionen zu verringern. Die Erforschung und Entwicklung von Implantaten mit antibakteriellen Eigenschaften könnte die Operationstechnik voranbringen, um diese Probleme zu überwinden.

Die Bewertung der antibakteriellen Eigenschaften verschiedener Biomaterialien anhand von Kleintiermodellen ist unerlässlich, bevor zu größeren Tiermodellen und klinischen Studien übergegangen wird⁹. Zahlreiche Studien haben anwendbare Mausmodelle für implantatbedingte Infektionen unter Verwendung eines biolumineszierenden Bakteriums gezeigt, das das luxABCDE-Operon 10,11,12,13,14,15 enthält. Diese Modelle beschleunigen zwar die Forschung zur Entwicklung antibakterieller Implantate oder Technologien, haben aber gewisse Einschränkungen. Erstens sind häufig fortgeschrittenes Fachwissen und spezielle Geräte wie Röntgenstrahlen oder spezielle Bildgebungssysteme erforderlich, um die bakterielle Belastung auf den in Mausmodellen platzierten Implantaten direkt und genau zu beurteilen. Zweitens können bei gesammelten Implantaten zwar in der Regel ein einzelnes Implantat an einer einzigen Infektionsstelle pro Tier bewertet werden, die Infektionsbedingungen und immunologischen Reaktionen jedoch von Individuum zu Individuum variieren, was möglicherweise zu unterschiedlichen Ergebnissen vergleichender Bewertungen führt. Wenn man die antibakterielle Wirkung verschiedener Biomaterialien in vivo vergleicht, ist es daher vorteilhafter, sie in einheitlichen Umgebungen zu implantieren und mit Bakterien zu impfen, um diese Probleme anzugehen. Darüber hinaus ist es unerlässlich, die derzeitige Methodik zu optimieren und quantitative Bewertungen mit Reproduzierbarkeit und Genauigkeit durchzuführen, indem die Eigenschaften des Tiermodells und der verwendeten Bakterien ausgenutzt werden.

Diese Studie stellt einen neuartigen experimentellen Ansatz für in vivo implantatbedingte Infektionen vor, der präzise Messungen zur Beurteilung der Biofilmbildung auf den Oberflächen von zwei Implantaten innerhalb eines einzigen Mausmodells durch vergleichende inter- und intraindividuelle Analysemethoden ermöglicht. Der Biofilm auf jedem Implantat kann mit optimierten Methoden zur Visualisierung des Biofilms auf dem Implantat, zur Bestimmung der koloniebildenden Einheiten (KBE) und zur quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-Analyse eines biolumineszierenden Stammes von Staphylococcus aureus, Xen 36, quantifiziert werden. Die vorangegangene Studie zeigte, dass ein neuartiges Metallimplantat unter Verwendung dieses umfassenden Ansatzes eine vielversprechende antibakterielle Wirksamkeit in vivo gegen Staphylococcus aureus besitzt¹⁶. Diese Methodik kann leicht in einer Standardlaborumgebung implementiert werden und kann die Forschung zur Entwicklung antibakterieller Biomaterialien beschleunigen.

Alle Tierverfahren sind vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of California San Francisco (UCSF) genehmigt und werden in einer BSL2-Einrichtung nach Absprache und Genehmigung durch das UCSF Biosafety Hazard Program durchgeführt, das von UCSF Environmental Health and Safety verwaltet wird. Es wurden männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (12-16 Wochen alt, 25-50 mg) verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Bakterien

1. Als Erreger wird der biolumineszierende Staphylococcus aureus Xen36 (ATCC49525) verwendet.
   HINWEIS: Dieser Stamm stammt aus der American Type Culture Collection (Manassas, VA) und verwendet auf einzigartige Weise ein luxABCDE-Operon , das optimiert und in das native Plasmid des Wirts integriert ist. Xen36 verwendet auch das Kanamycin-Resistenzgen, das mit dem Lux-Operon verbunden ist.
2. Fügen Sie eine kleine Menge gefrorener Glycerinbrühe von Xen 36 hinzu und geben Sie die Stücke in 5 ml tryptische Sojabrühe (TSB) Medium mit 200 μg/ml Kanamycin.
3. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (200 U/min).
4. Xen36 auf TSB-Agarplatten (TSB in Agar 1,5%) mit 200 μg/mL Kanamycin auftragen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
5. Einzelne Kolonien von Xen36 isolieren und über Nacht in 5 ml TSB mit 200 μg/ml Kanamycin in einem Schüttelinkubator (200 U/min) bei 37 °C kultivieren.
6. Messen Sie die Absorption der resultierenden Kultur bei 630 nm.
7. Verdünnen Sie die Kultur und stellen Sie eine Xen36-Kultur von 1,0 x 10⁸ KBE/ml her, basierend auf der Extinktion bei 630 nm.
   HINWEIS: Eine Absorptionsmessung bei 630 nm (gegenüber einem TSB-Rohling) von 0,5 entspricht in etwa 1,0 x 10⁸ KBE/ml Xen36.
8. Verdünnen Sie die Kultur und stellen Sie eine Xen36-Kultur von 1,0 x 10⁵ KBE/ml her.

2. Präparation von verbundenen Implantaten

1. Verwenden Sie zwei stabförmige Drähte aus handelsüblichem chirurgischem Edelstahl (SUS316L) mit einer Länge von jeweils 8 mm und einem Durchmesser von 0,5 mm.
2. Verbinden Sie die beiden Drähte vertikal, indem Sie sie in beide Enden einer 20-μl-Pipettenspitze einführen, die auf eine Länge von ca. 3 mm geschnitten ist.
   HINWEIS: Führen Sie die vertikal verbundenen Drähte in die Spitze der 18-G-Nadel ein (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Drähte fest mit der Pipettenspitze befestigt sind, um ein Trennen zu verhindern.
3. Autoklavieren Sie die Drähte, bevor Sie sie chirurgisch in die Mäuse implantieren.

3. Schaffung eines reifen subkutanen Beutels

HINWEIS: 7 Tage vor der bakteriellen Inokulation den Luftbeutel wie folgt erstellen:

1. Betäubung der Maus (C57BL/6) mit 2% Isofluran durch Inhalation (nach institutionell anerkannten Protokollen).
   HINWEIS: Beurteilen Sie das geeignete Anästhesieniveau, indem Sie die Atemfrequenz, den Muskeltonus, das Einklemmen der Zehen, den Hornhautreflex und die Farbe der Schleimhäute beobachten. Verwenden Sie Augensalbe auf den Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
2. Bringen Sie die anästhesierte Maus auf das Operationsbett und rasieren Sie die dorsale Hals-/Brustregion der Maus.
3. Tupfen und sterilisieren Sie die gesamte Region mit 70% Ethanol und Povidon-Jod.
4. Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit steriler Luft und halten Sie eine 27-g-Nadel an den Auslass.
5. Kneifen und heben Sie die Basis des Maushalses vorsichtig an, um Platz zwischen dem Unterhautgewebe und der Faszie zu schaffen.
6. Platzieren Sie die Nadel in der Mittellinie zwischen den Schulterblättern der Maus und injizieren Sie 3 ml sterile Luft subkutan, um den Luftbeutel zu erstellen (Abbildung 2).
   HINWEIS: Halten Sie beim Einspritzen von Luft beide Seiten des Rückens mit der anderen Hand nach unten, um sicherzustellen, dass sich die Luft in der Mitte des Rückens ausbreitet und in der Mitte ein Beutel entsteht.
7. Setzen Sie die Maus wieder in einen mit einem Wärmeleitpad erwärmten Käfig und überwachen Sie sie genau, bis sie sich von der Narkose erholt hat.
8. Injizieren Sie 3 ml sterile Luft wie oben beschrieben, um das Aufblasen der Kavität aufrechtzuerhalten und alle 2 Tage einen reifen Beutel zu erstellen.
   HINWEIS: Saugen Sie vor jedem Aufblasen die Luft aus dem Beutel an, um die korrekte Platzierung der Nadelspitze zu bestätigen. Nehmen Sie die Spritze vorsichtig von der Nadel und lassen Sie die Nadelspitze im Beutel. Blasen Sie den Beutel mit 3 mL steriler Luft wieder auf.

4. Implantation der angeschlossenen Drähte und bakterielle Inokulation

1. 7 Tage nach der ersten Luftinjektion betäuben Sie die Maus wie in Schritt 3.1 beschrieben.
   HINWEIS: Überprüfen Sie während des chirurgischen Eingriffs ständig, ob die Maus atmet und betäubt ist. Der gesamte chirurgische Eingriff dauert in der Regel 10-15 Minuten, wenn er von einem ausgebildeten Chirurgen durchgeführt wird. Die Anästhesie wird aufrechterhalten, indem ein Schlauch, der 2% Isofluran gemischt mit Sauerstoff liefert, in der Nähe der Mausschnauze platziert wird.
2. Tupfen und sterilisieren Sie die gesamte Region mit 70% Ethanol und Povidon-Jod.
3. Injizieren Sie Bupivacain unmittelbar vor der Operation subkutan.
4. Machen Sie einen 3 mm langen Mittellinien-Längsschnitt am oberen Rand des Beutels.
5. Führen Sie eine 18-G-Nadel mit den angeschlossenen Drähten durch das Loch in den Beutel ein und drücken Sie die Drähte mit einer Innenspritze einer 25-G-Spinalnadel heraus (Abbildung 3A,B).
6. Lassen Sie die Spitze der 18-g-Nadel im Beutel, entfernen Sie vorsichtig den inneren Zylinder und injizieren Sie mit der Spritze 3 ml Xen36-Kultur von 1,0 x 10⁵ KBE/ml (Abbildung 3C,D).
7. Entfernen Sie vorsichtig alle Nadeln, verschließen Sie die Haut mit einem Wundclip und verschließen Sie sie mit topischem Hautkleber (Abbildung 3E,F).
8. Stellen Sie sicher, dass keine Leckagen vorhanden sind, legen Sie die Maus wieder in den einzelnen Käfig, der mit einem Wärmeleitpad erwärmt wurde, und überwachen Sie sie wie zuvor.

5. Extraktion der Implantate aus dem subkutanen Abszess

1. Nach der Euthanasie durch Überdosierung von Isofluoran ist die dorsale Hals-, Brust- und Lendenwirbelsäule der Maus zu rasieren und die gesamte Region mit 70 % Ethanol und Povidon-Jod abzutupfen und zu sterilisieren (Abbildung 4A).
   HINWEIS: Die Euthanasie wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der American Veterinary Medical Association (AVMA) für die Euthanasie von Tieren durchgeführt.
2. Machen Sie einen 2 cm langen Schnitt in der Mittellinie im Lendenbereich und peelen Sie das Unterhautgewebe vorsichtig mit einer Schere.
3. Verlängern Sie die Inzision und die subkutane Dissektion proximal und trennen Sie das anhaftende Gewebe, das den Abszess umgibt (Abbildung 4B - D).
4. Exzidieren Sie den gesamten subkutanen Abszess (Abbildung 4E).
5. Schneiden Sie den Abszess ab und ziehen Sie den Draht vorsichtig aus der Innenseite des Abszesses heraus (Abbildung 4F).

6. Quantifizierung des gebildeten Biofilms auf den Implantatoberflächen

1. Kristallviolett-Assay
   1. Legen Sie die aus dem Abszess extrahierten Drähte in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte, die 1 ml deionisiertes (DI) Wasser enthält.
   2. Übertragen Sie die Drähte in neue Vertiefungen mit 1 ml DI-Wasser, um lose anhaftende Bakterien von der Oberfläche der Drähte zu entfernen.
   3. Den Biofilm mit 100% Ethanol 1 min auf den Drähten fixieren und trocknen lassen.
   4. Übertragen Sie die Drähte in neue Vertiefungen, die 1 ml 0,1 % Kristallviolett-Reagenz enthalten.
   5. Waschen Sie die Drähte nach 15 Minuten Färbung vorsichtig zweimal mit DI-Wasser, um überschüssige Farbe zu entfernen.
   6. Setzen Sie das Implantat 15 Minuten lang in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 250 μl 33%iger Essigsäure ein. Solubilisieren Sie das Kristallviolett, das am Biofilm auf dem Implantat haftet, und wirbeln Sie es anschließend 1 Minute lang vortexen.
   7. Übertragen Sie 200 μl der Suspension auf eine 96-Well-Platte und messen Sie die Extinktion bei OD_{630 nm} mit einem Mikroplatten-Reader. Alle Messungen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
2. Zählung von koloniebildenden Einheiten (KBE)
   1. Entfernen Sie lose anhaftende Bakterien von der Oberfläche der Drähte, wie in Schritt 6.1.2 beschrieben.
   2. Setzen Sie das Implantat in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 μl 10x Trypsin ein und inkubieren Sie es 1 h lang bei 37 °C.
   3. 1 min Vortex und 5 min Beschallung in einem Wasserbad bei 100 W, gefolgt von einem zusätzlichen Vortexen für 30 s, um den Biofilm in der Suspension abzulösen.
   4. 10 μl der seriell verdünnten Suspension auf die TSB-Agarplatten (TSB in Agar 1,5%) mit 200 μg/mL Kanamycin imkulieren.
      HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren für jede Lösung in dreifacher Ausführung aus.
   5. Nachdem Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert haben, zählen Sie die Kolonien auf den Platten und berechnen Sie die Anzahl der Bakterienzellen in der Originalkultur mit der mittleren Koloniezahl^{von 17}.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass alle Bakterien von den Drähten entfernt werden, was für eine genaue Messung entscheidend ist, färben Sie die Drähte mit Kristallviolett und beobachten Sie sie, nachdem Sie die Suspension auf die Platten aufgetragen haben. In den Vorversuchen gelang es, durch die Kombination der oben genannten mechanischen und chemischen Dissoziation alle Xen36-Biofilme von den Oberflächen des herkömmlichen Edelstahldrahtes zu entfernen (Abbildung 5).
3. Analyse der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)
   1. Entfernen Sie lose anhaftende Bakterien von der Oberfläche der Drähte, wie in Schritt 6.1.2 beschrieben.
   2. Platzieren Sie das Implantat in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 600 μl TSB.
   3. Extraktion der DNA mit dem pelletfreien modifizierten alkalischen Lysesystem¹⁶.
      HINWEIS: Das endgültige Volumen der eluierten DNA beträgt 20 μl.
   4. Verdünnen Sie die DNA 1:10 und lagern Sie sie bei -20 °C.
   5. Durchführung einer qPCR für die luxA - und 16S-rRNA-Gene ¹⁶.
      HINWEIS: Alle qPCR-Reaktionen werden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung beträgt 10 μl und enthält 3 μl DNA-Template, 5 μl SYBR Green, 1 μl nukleasefreies Wasser und 0,5 μl jedes Primers. Primer für das luxA-Gen sind 5'- GAGCATCATTTCACGGAGTTTG -3' und 5'- ATAGCGGCAGTTCCTACATTC -3'. Primer für das 16S rRNA-Gen sind 5'- GTGGAGGGTCATTGGAAACT - 3' und 5'- CACTGGTGTTCCTCCATATCTCTC - 3'. Die PCR-Bedingungen sind wie folgt: anfängliche Denaturierung für 2 min bei 94 °C, gefolgt von 40 Zyklen à 15 s bei 94 °C, 30 s bei 60 °C und 30 s bei 72 °C und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 min.
   6. Der Mittelwert der Drei-Zyklus-Schwellenwerte (Ct) wird gegen eine Kalibrierungskurve aufgetragen, die mit DNA erstellt wurde, die direkt aus seriell verdünnten reinen Xen36-Kulturen aufgereinigt wurde, um die bakterielle Belastung des Implantats abzuschätzen (Abbildung 6).

In dieser Studie wurde die Zuverlässigkeit eines umfassenden Ansatzes unter Verwendung eines neuartigen Mausmodells für implantatbedingte Infektionen mit optimierten quantitativen Bewertungen der Biofilmbildung auf Implantatoberflächen untersucht, das in der vorherigen Studie^{verwendet wurde 16}. Die beiden identischen Implantate wurden verwendet, um den auf ihren Oberflächen gebildeten Biofilm zu untersuchen, um zu überprüfen, ob beide Implantate gleichzeitig unter einheitlichen Infektionsbedingungen in einem einzigen subkutanen Raum in einem einzigen Mausmodell inkubiert werden können. Die Mäuse wurden einem subkutanen Beutelherstellungsverfahren unterzogen (Abbildung 2), und nach 7 Tagen wurden die angeschlossenen Edelstahldrähte in den reifen Beutel implantiert, gefolgt von der Inokulation mit Staphylococcus aureus Xen36 (Abbildung 3). 14 Tage nach der Inokulation entsteht ein eingekapselter Abszess von etwa 2 cm Länge und 1 cm Breite, der die im Beutel gebildeten verbundenen Drähte enthält (Abbildung 4). Die Drähte wurden aus dem Abszess entnommen, und der auf jedem Draht gebildete Biofilm wurde durch Kristallviolettfärbung, KBE-Zählung und qPCR-Analyse bewertet. Die kristallviolett gefärbten Drähte zeigten eine konsistente Biofilmbildung auf den Oberflächen, ohne beobachtbare Veränderungen zwischen beiden Drähten (Abbildung 7A). Die präzisen Messungen zur Beurteilung der Biofilmbildung durch vergleichende inter- und intraindividuelle Analysemethoden zeigten, dass die Absorptionsmessungen des gelösten Kristallviolett-Assays (Abbildung 7B), der KBE-Zählung (Abbildung 7C) und der qPCR-Analyse (Abbildung 7D) keine statistisch signifikanten Unterschiede in der bakteriellen Belastung innerhalb des Biofilms auf beiden Drähten zeigten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Drähte gleichzeitig unter identischen Infektionsbedingungen an einem einzelnen subkutanen Beutel innerhalb eines einzigen Mausmodells inkubiert wurden.

Abbildung 1: Präparation der angeschlossenen Drähte für die Implantation in die Unterhauttasche. (A) Ein repräsentatives Bild eines einzelnen Implantats, das aus zwei miteinander verbundenen Edelstahldrähten besteht (Länge: 8 mm, Durchmesser: 0,5 mm). (B) Eine Spitze einer 20 μL Pipettenspitze dient als Verbindung für die beiden Drähte. (C) Die angeschlossenen Drähte werden anschließend in die Spitze einer 18-G-Nadel eingeführt, um sie in einen reifen Unterhautbeutel zu implantieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schaffung eines reifen subkutanen Beutels für die Implantation und Inokulation. (A) Die Seitenansicht und (B) die Draufsicht eines vollständig ausgebildeten subkutanen Beutels kurz nach der Luftinjektion. Ein subkutaner Beutel wird auf der Rückseite eines Mausmodells hergestellt, indem eine 27-G-Nadel entlang der Mittellinie zwischen den Schulterblättern in die Haut eingeführt und 3 ml sterile Luft subkutan injiziert werden. Danach werden 7 Tage lang jeden zweiten Tag 3 ml sterile Luft verabreicht, um die Reifung eines subkutanen Beutels zu erleichtern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Implantation von verbundenen Drähten und bakterieller Inokulation in einen reifen subkutanen Beutel. (A) Die Seitenansicht und (B) die Draufsicht auf das Einstechen der Nadel in einen reifen subkutanen Beutel. Die angeschlossenen Drähte werden in die Spitze einer 18-G-Nadel eingeführt, und eine Innenspritze einer 25-G-Spinalnadel wird verwendet, um die Drähte herauszudrücken. Sie werden durch das Hautloch in den reifen Unterhautbeutel eingeführt. Die Drähte werden anschließend mit einer 25 G Spinalnadel in den Beutel eingeführt. Bakterielle Inokulation in den Beutel, wie in der Seitenansicht (C) und in der Draufsicht (D) zu beobachten. Nach dem Anbringen einer Spritze mit bakterieller Lösung an der 18-G-Nadel werden 3 ml Xen36-Kultur (1,0 x 10⁵ KBE/ml) in den Beutel geimpft. Die Einstichstelle wird nach dem Entfernen der 18-G-Nadel geschlossen, wobei weder in der Seitenansicht (E) noch in der Draufsicht (F) eine Leckage festgestellt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Ansammlung von angeschlossenen Drähten in einem subkutanen Abszess. (A) Eine Seitenansicht eines Mausmodells für implantatbedingte Infektionen 14 Tage nach der Inokulation. (B) Die Seitenansicht, (C) die Draufsicht und (D) die Unteransicht des subkutanen Abszesses mit den umgebenden gut entwickelten Blutgefäßen nach der Trennung des anhaftenden Gewebes. (E) Der subkutane Abszess ist vollständig eingekapselt und (F) die angeschlossenen Drähte sind vollständig von ihm umhüllt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Entfernung des auf Drähten gebildeten Biofilms für die KBE-Beurteilung. (A) Der auf den Oberflächen jedes Drahtes gebildete Biofilm wird 14 Tage nach der Inokulation in vitro konsistent mit Kristallviolett gefärbt. (B) Der gefärbte Biofilm wird durch Vortexen und Beschallung verkleinert. (C) Es wird durch Zugabe einer Trypsin-Behandlung vollständig eliminiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Kalibrierungskurve der 16S rRNA- und luxA-Gene in Staphylococcus aureus. Eine Kalibrierungskurve rechnet die Ct-Werte in die äquivalente Bakterienlast in KBE um. Es wird eine serielle Verdünnung der reinen Staphylococcus aureus Xen36-Kultur (10⁸ bis 10¹ KBE) hergestellt. Ein hoher Pearson-Korrelationskoeffizient wird für 16S rRNA (R² = 0,951) und luxA (R² = 0,985) erhalten, was auf lineare Standardkurven hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Quantitative Bewertungen der Biofilmbildung auf verbundenen Drähten in einem Mausmodell. (A) Repräsentative Bilder eines einzelnen Implantats, bestehend aus zwei verbundenen Edelstahldrähten für die subkutane Pouch-Implantation (links) und einem kristallviolett gefärbten Biofilm, der sich 14 Tage nach der Inokulation auf den Oberflächen jedes Drahtes (Draht 1 oder Draht 2) gebildet hat (rechts). Messungen zur Beurteilung des Biofilms mit vergleichenden inter- und intraindividuellen Analysemethoden werden für jeden Draht innerhalb eines Mausmodells (insgesamt n = 12) durchgeführt, einschließlich (B) der Absorptionsmessung von kristallviolett gefärbtem Biofilm (n = 4; kreisförmiger Punkt steht für Maus #1; dreieckiger Punkt steht für Maus #2; quadratischer Punkt steht für Maus #3; Diamantpunkt zeigt Maus #4 an). (C) KBE-Zählung (n = 4; Kreispunkt steht für Maus #5; dreieckiger Punkt zeigt Maus #6; quadratischer Punkt zeigt Maus #7 an; Diamantpunkt zeigt Maus #8 an) und (D) qPCR-Analyse (n = 4; Kreispunkt zeigt Maus #9; dreieckiger Punkt zeigt Maus #10 an; quadratischer Punkt zeigt Maus #11 an; Diamantpunkt zeigt Maus #12 an). Die Unterschiede zwischen den Drahtgruppen werden mit Hilfe einer unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA) bewertet. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt. Statistisch signifikante Werte wurden als p < 0,05 definiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Diese Studie demonstrierte einen umfassenden Ansatz für eine präzise quantitative Bewertung der Biofilmbildung auf mehreren Implantaten unter Nutzung eines neuartigen Mausmodells und optimierter Analysetechniken für implantatbedingte Infektionen. Um sicherzustellen, dass zwei Implantate unter identischen Infektionsbedingungen bei ein und demselben Probanden inkubiert wurden, wurde durch wiederholte Luftinjektionen ein reifer subkutaner Beutel in einer einzigen Maus hergestellt. Dieses Modell bot eine geschlossene und stabile Umgebung, in der zwei verbundene Implantate unter identischen Infektionsbedingungen inkubiert werden konnten, selbst wenn sich die Maus bewegte. Nach der Inokulation mit Staphylococcus aureus entwickelte sich ein solitär eingekapselter subkutaner Abszess von einer Länge von etwa 2 cm, der beide Drähte vollständig umschließt und den Merkmalen klinischer implantatbedingter Infektionen sehr ähnlich ist. Beide Drähte wurden aus dem Abszess extrahiert, und der Biofilm wurde durch mechanische und chemische Dissoziation von jeder Oberfläche entfernt. Die gelöste bakterielle Lösung wurde verwendet, um die bakterielle Belastung innerhalb des Biofilms auf jedem Draht quantitativ zu analysieren. Zur quantitativen Bewertung wurde eine vergleichende inter- und intraindividuelle analytische Analyse mehrerer Drähte zwischen den beiden Arten von Drahtgruppen durchgeführt. Zusätzlich wurden beide Drähte, die in derselben Maus platziert waren, vergleichend vermessen, um eine genauere Bewertung zu ermöglichen, da sie gleichzeitig mit einer einheitlichen Infektion inkubiert wurden. Die qPCR-Analyse verwendete die relativen Expressionsniveaus des 16S rRNA-Gens und des Lux-Operons, das für Luciferase in einem biolumineszierenden Staphylococcus aureus kodiert, für die quantitative Bewertung. Diese Studie mit zwei identischen Drähten ergab keine signifikanten Unterschiede in allen quantitativen Bewertungen der Biofilmbildung zwischen den Drahtgruppen bei mehreren Mäusen oder zwischen Drähten innerhalb einer einzelnen Maus. In der Zwischenzeit zeigte die vorangegangene Studie signifikante Unterschiede in der quantitativen Bewertung der Biofilmbildung zwischen zwei verschiedenen Drahtgruppen bei mehreren Mäusen¹⁶. Daher optimiert dieser umfassende Ansatz das Mausmodell und die Analysetechniken, um die Variabilität der Ergebnisse zu minimieren und möglicherweise die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit quantitativer Bewertungen der Biofilmbildung auf mehreren Biomaterialien zu verbessern.

Es wurden mehrere In-vivo-Modelle implantatbedingter Infektionen etabliert, um die antimikrobielle Wirksamkeit in Biomaterialien zu bewerten 9,18,19,20. In diesen Modellen wird in der Regel pro Tier ein einzelnes Implantat in die Tibia, den Femur oder den Wirbelsäulenfortsatz eingesetzt, zusammen mit der bakteriellen Inokulation. Da sich der Abszess nach der Inokulation um oder neben dem Implantat entwickelt und die klinischen Merkmale genau nachahmt, sind diese Modelle hilfreich für die In-vivo-Untersuchung implantatbedingter Infektionen. Die Ergebnisse der quantitativen Bewertungen können jedoch aufgrund eines einzigen Implantats pro Proband, der Inokulation in einem unvollkommen geschlossenen Raum und der Variabilität der Immunantworten und Infektionsbedingungen zwischen den Probanden inkonsistent sein. Darüber hinaus erfordern die quantitativen Bewertungen in diesen Modellen häufig spezielles Fachwissen und spezifische Messgeräte, was ihre Anwendbarkeit einschränkt. Obwohl die Implantatgröße in diesem Mausmodell begrenzt ist, können diese Probleme durch die Eigenschaften dieser umfassenden Methodik verbessert werden, die die gleichzeitige Inkubation mehrerer Implantate mit Bakterien unter identischen Infektionsbedingungen innerhalb einer einzigen Maus beinhaltet.

Der wichtigste Schritt bei diesem Ansatz ist die Entfernung des gebildeten Biofilms vom Implantat. Ein repräsentatives Verfahren zur quantitativen Bewertung von Biofilm ist die KBE-Zählung, die das Ablösen von Bakterien aus dem Biofilm, ihre Suspension in einem Medium und das anschließende Plattieren¹¹ erfordert. Während mechanische Stresstechniken mit Ultraschall und Vortexen in vielen Studien häufig zur Ablösung des Biofilms eingesetzt werden, gibt es Bedenken hinsichtlich ihrer ausreichenden Entfernung, um den gesamten Biofilm von den Implantaten vollständig zu entfernen. Wenn sich diese Techniken als unzureichend erweisen, kann die Zuverlässigkeit der Ergebnisse beeinträchtigt werden. Diese Studie zeigte, dass mechanische Stimulation allein den Biofilm nicht vollständig ablösen konnte. Daher ist die Integration einer chemischen Behandlung mit Trypsin und mechanischer Stimulation notwendig, um eine zuverlässigere Bakterienablösung zu erreichen und die lebende Bakterienlast innerhalb des Biofilms genau zu quantifizieren²¹.

Die qPCR-Analyse wird häufig in Mikrobiomstudien verwendet, um die Gesamtbakterienlast innerhalb des Biofilms zu beurteilen. Dieser Assay ist wahrscheinlich eine genauere Methode zur quantitativen Bewertung als der Kristallviolett-Assay²². Durch die Erstellung einer Kalibrierungskurve mit Plasmid-DNA, die direkt aus reinen Bakterienkulturen aufgereinigt wurde, kann die Bakterienlast innerhalb des Biofilms genau sein. Angesichts der Tatsache, dass das 16S rRNA-Gen eine ribosomale Untereinheit ist, die in allen Bakterien vorkommt, wird die qPCR, die auf das 16S rRNA-Gen abzielt, häufig für die bakterielle Quantifizierung verwendet, und die Expression des 16S rRNA-Gens ist während des Wachstums von Staphylococcus aureus^{relativ stabil 23,24}. Das luxA-Gen ist ein Bestandteil des Lux-Operons in einem biolumineszierenden Stamm von Staphylococcus aureus Xen 36. Diese Studie zeigte, dass die qPCR für das luxA-Gen auch für die quantitative Bewertung der Biofilmbildung nach der Inokulation von Xen 36 wirksam ist. So kann die quantitative Beurteilung der Biofilmbildung durch die Inokulation eines biolumineszierenden Bakteriums und die Genexpressionsanalyse des Lux-Operons optimiert werden. Dieses Verfahren ist relativ einfach zu implementieren, reproduzierbar und ermöglicht es den Forschern, mehrere Proben gleichzeitig zu analysieren. Darüber hinaus ist es wirtschaftlich und erfordert keine spezielle Ausrüstung, was es zu einer praktikablen Wahl für jedes Labor macht.

Dieser umfassende Ansatz hat einige Einschränkungen. Erstens zielt diese Studie in erster Linie darauf ab, die Biofilmbildung auf Implantaten in einer lokalisierten und geschlossenen Umgebung zu bewerten, was sie für die Bewertung des Einflusses von Biomaterialien auf systemische Infektionen unzureichend macht. Zweitens ist die bakterielle Last, die erforderlich ist, um einen gut entwickelten Abszess zu bilden, in diesem Mausmodell erheblich höher als in alternativen Modellen, was eine schwierige Umgebung für die Beurteilung der Resistenz von Biomaterialien gegen Biofilm^{schaffen kann 25}. Um jedoch einen Abszess zu bilden, der die Implantate vollständig umgibt und Implantate unter identischen bakteriellen Infektionsbedingungen kultiviert, war eine höhere Dosis an Bakterienkultur erforderlich. Drittens kann dieses Modell nicht verwendet werden, wenn eines der Implantate Verbindungen freisetzt, da diese das andere Implantat beeinträchtigen können. Viertens kann die Pipettenspitze, mit der die beiden Implantate verbunden werden, den Verlauf der Infektion beeinflussen, obwohl das Modell durch die Verwendung einer allgemein erhältlichen Pipettenspitze in jeder Laborumgebung leicht zu implementieren ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie ein neuartiges Mausmodell der implantatbedingten Infektion und optimierte Analysemethoden zur präzisen quantitativen Beurteilung der Biofilmbildung vorstellt. Es wird erwartet, dass dieser umfassende Ansatz die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit von Ergebnismessungen für die vergleichende Biofilmquantifizierung auf chirurgischen Implantaten verbessert, indem seine Eigenschaften genutzt werden, und so zur zukünftigen Entwicklung antimikrobieller Implantate beiträgt.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Diese Forschung wurde teilweise durch ein kooperatives Forschungsprogramm der NSF Industry/University mit dem Namen Center for Disruptive Musculoskeletal Innovations (IIP-1916629), Komatsuseiki Kosakusho Co., Ltd. und Rosies Base, LLC finanziert.