В пробирке Моделирование нейрогенеза синдрома Дауна с использованием индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

В этом протоколе изложена методология рекомитуляции нарушенного нейрогенеза синдрома Дауна (СД) с использованием ИПСК человека с синдромом Дауна. Протокол определил двухфазный дефект клеточного цикла как причину нарушения нейрогенеза при синдроме Дауна. Он обеспечивает надежную платформу для понимания клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе аномального нейрогенеза, связанного с синдромом Дауна.

Синдром Дауна (СД), вызванный дополнительной копией хромосомы 21, является основной причиной умственной отсталости. Одним из ключевых факторов, способствующих этой умственной отсталости, является нарушение нейрогенеза, наблюдаемое начиная с внутриутробных стадий. Для изучения этих аномалий развития нервной системы индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные с использованием клеток, полученных от пациентов с синдромом Дауна, представляют собой ценную и актуальную модель. В данной работе описан комплексный протокол для повторения нейрогенеза с нарушением ДС, наблюдаемого на стадиях развития плода при СД. В этом протоколе используется пара DS-hiPSCs, имеющих три копии хромосомы 21, и его изогенные эуплоидные HiPSCs, имеющие две копии хромосомы 21. Важно отметить, что описанный здесь протокол резюмирует DS-нарушенный нейрогенез и обнаружил, что двухфазный дефект клеточного цикла, т.е. сниженная пролиферация нейральных клеток-предшественников DS (NPC) во время ранней фазы нейрогенной стадии с последующим увеличением пролиферации DS NPC во время поздней фазы нейрогенной стадии, является причиной нарушения нейрогенеза DS. Повышенная пролиферация DS NPC во время поздней фазы нейрогенной стадии приводит к задержке выхода из клеточного цикла, вызывая снижение генерации постмитотических нейронов из DS NPC. Этот протокол включает в себя подробные шаги по поддержанию ИПСК, их дифференцировке в нейронные линии, демонстрирующие дефект двухфазного клеточного цикла на нейрогенной стадии, и последующую валидацию сниженной нейронной дифференцировки в клетках DS. Следуя этой методологии, исследователи могут создать надежную экспериментальную систему, которая имитирует условия развития нервной системы при синдроме Дауна, что позволяет им исследовать специфические изменения в развитии мозга, вызванные трисомией 21.

Синдром Дауна (ДА), или трисомия 21, является наиболее распространенной хромосомной аномалией и основной причиной умственной отсталости (ИД)¹. Нарушение нейрогенеза во время внутриутробного развития плода при СД является одной из причин умственной отсталости при СД². Исследования плода человека с синдромом Дауна показывают уменьшение массы и объема мозга, уменьшение количества нейронов, увеличение астроцитов ^3,4 и аномальное распределение нейронов в слоях II и IV ^5,6. Кроме того, вторая фаза развития коры головного мозга, т.е. возникновение ламинации, при DS⁷ происходит с задержкой и дезорганизацией.

Дефекты нейроразвития при синдроме Дауна изучались в основном с использованием мышиных моделей синдрома Дауна, таких как Ts65Dn, Ts1Rhr и Ts1cje⁸. Тем не менее, эти модели мышей не смогли полностью воспроизвести различные фенотипы, наблюдаемые в исследованиях DS, из-за физиологических различий и различий в развитии между мышами и людьми^9, что привело к неудачным клиническим испытаниям¹⁰. Изобретение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток^11,12 дало возможность моделировать неврологические нарушения с синдромом Дауна с использованием клеток, полученных непосредственно от людей с синдромом Дауна. Тем не менее, более ранние попытки смоделировать дефекты развития нервной системы при синдроме Дауна с использованием человеческих ИПСК не увенчались успехом и не смогли полностью объяснить дефекты развития нервной системы, наблюдаемые в отделах мозга плода 13,14,15,16 при синдроме Дауна. Например, в докладе, опубликованном Shi et al., обнаружены фенотипы болезни Альцгеймера, связанные с синдромом Альцгеймера, но не сообщается о различиях в нейрогенезе синдрома Альцгеймера по сравнению с эуплоидным^{контролем.} Аналогичным образом, Weick et al. сообщили о снижении синаптической активности, но нормальном нейрогенезе при синдроме Дауна по сравнению с эуплоидным контролем¹⁶. Тем не менее, нормальный нейрогенез при синдроме Дауна, о котором сообщалось в этих публикациях, не согласуется с наблюдениями из срезов мозга плода при синдроме Дауна. Позже в отчете Hibaoui et al. сообщалось о снижении нейрогенеза при СД, что согласуется с наблюдениями из^14-го отдела мозга плода при ДС. Тем не менее, в этом и другом недавнем отчете снижение пролиферации NPC DS описывается как причина снижения нейрогенеза при DS ^14,17. Однако только сниженная пролиферация NPC DS не может объяснить увеличение астроглиальных клеток и замедленное появление ламинации во время развития мозга плода при DS.

В недавно опубликованной работе была разработана модель нейрогенеза человека с нарушением DS на основе iPSC, показывающая сниженный нейрогенез. Эта модель показала, что нарушение нейрогенеза при синдроме Дауна обусловлено дефектами двухфазного клеточного цикла на нейрогенной стадии (стадия, на которой нейральные клетки-предшественники генерируются из плюрипотентных стволовых клеток). Во время первой фазы нейрогенной стадии NPC DS демонстрируют сниженную пролиферацию по сравнению с изогенными эуплоидными нервными клетками, за которой следует повышенная пролиферация NPC DS по сравнению с изогенными эуплоидными клетками в поздней фазе нейрогенной стадии¹⁸.

В данной рукописи описан пошаговый подробный протокол дифференцировки ИПСК синдрома Дауна и его изогенных эуплоидных ИПСК в корковые нейроны. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы предоставить подробный, пошаговый протокол для дифференциации пары гипертрофеев DS и его изогенных эуплоидных hiPSCs в корковые нейроны с акцентом на моделирование дефектов нейрогенеза, связанных с DS. Этот протокол разработан для того, чтобы предложить надежную и воспроизводимую систему для исследования клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе аномалий, вызывающих нейрогенез с нарушением DS.

Обоснование разработки этого протокола заключается в том, чтобы обеспечить дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в корковые нейроны с использованием принципов нейробиологии развития, тем самым позволяя идентифицировать фенотипы, возникающие из-за заболевания/расстройства. Он был направлен на минималистский подход к нейронной дифференцировке ИПСК путем исключения таких соединений, как цАМФ или DAPT, которые могут маскировать фенотипы заболеваний, возникающие из-за дефектов в канале Ca⁺⁺ или пути NOTCH соответственно. Аналогичным образом, было исключено использование аскорбиновой кислоты, BDNF и GDNF, которые могут маскировать другие фенотипы, связанные с неврологическими заболеваниями, путем потенцирования нейрогенеза.

Преимущества этой методики перед альтернативными методами заключаются в обеспечении надежной рекапитуляции неврологических фенотипов, наблюдаемых в срезах мозга плода с синдромом Дауна. Следует отметить, что по сравнению с мышиными моделями, система на основе ИПСК человека устраняет межвидовые различия, обеспечивая более актуальную модель для изучения специфических для человека процессов развития нервной^{системы9} , но до сих пор не смогла воспроизвести нарушение нейрогенеза при синдроме Дауна, наблюдаемое на внутриутробных стадиях болезни Дауна и далее. Кроме того, использование изогенных пар ИПСК снижает вариабельность и повышает достоверность наблюдаемых фенотипических различий. Этот протокол будет представлять особый интерес для исследователей, изучающих нарушения развития нервной системы и нейрогенез человека. Это особенно актуально для тех, кто стремится смоделировать специфичные для человека аспекты синдрома Дауна или тех, кто заинтересован в разработке терапевтических вмешательств, направленных на дефекты нейрогенеза, связанные с трисомией 21.

По следующему протоколу применяли две пары синдрома Дауна и его изогенные эуплоидные ИПСК человека. Одну пару генерировали с использованием ретровирусно-опосредованного способа перепрограммирования^19, а вторую пару (NSi003-A и NSi003-B) генерировали с использованием неинтегрирующегося способа доставки вируса^{Сендай 20}. Протокол в целом состоит из двух стадий: нейрогенной стадии (стадия 1) и стадии нейронной дифференцировки (стадия 2). Кроме того, в нейрогенной стадии наблюдаются две фазы, основанные на различиях в пролиферации линий эуплоидных клеток синдрома Дауна и изогенных эуплоидных клеток, т.е. ранняя и поздняя фазы. Подробная информация о реагентах, средах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Культивирование и поддержание ИПСК при синдроме Дауна и изогенном эуплоидном ИПСК

1. Обшивка фидера для гиПСК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Качество и плотность кормушки чрезвычайно важны для хорошего качества культуры iPSCs человека.
   1. Добавьте 2 мл 0,1% желатина для покрытия 6-луночного планшета в течение не менее 1-2 ч при 37 °C перед посевом с питающими клетками.
   2. Подержите покрытую желатином пластину при комнатной температуре в колпаке для клеточных культур не менее 30 минут перед нанесением покрытия на клетки.
   3. Теплая среда эмбриональных фибробластов мыши (MEF) для использования для оживления в ванне с шариками/водяной бане.
   4. Добавьте 5 мл среды MEF в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
   5. Достаньте флакон с питательными ячейками из бака с жидким азотом (бак LN2).
      Фидерные клетки получали путем обработки эмбриональных фибробластов мышей E13.5 10 мкг/мл митомицина C в течение 3 ч с последующей 2-3-кратной промывкой DPBS¹⁸. Питающие ячейки можно использовать непосредственно или заморозить в резервуаре LN2 для использования в будущем. Все мыши были использованы после одобрения Институционального комитета по этике животных.
   6. Держите флакон при температуре 37 °C на водяной бане с помощью плавающей решетки, пока не останется небольшой кусочек льда.
   7. Поместите флакон внутрь биозащитного шкафа и простерилизуйте его спиртом, прежде чем поместить в биозащитный шкаф.
   8. Добавляйте 1 мл теплого материала MEF (см. Таблицу материалов) по каплям.
   9. Аккуратно выньте среду из флакона и вылейте по капле в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую среду MEF.
   10. Центрифуга при комнатной температуре в течение 5 мин при 200 x g.
   11. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью вакуумной аспирационной системы (ВАШ).
   12. Добавьте 1 мл среды MEF и аккуратно пипеткой вверх и вниз 3-4 раза.
   13. Возьмите подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Мертвые клетки были исключены с помощью Trypan Blue.
   14. Планшет 3,1-3,3 x 10⁵ активных питающих ячеек на лунку 6-луночного планшета или 2 x 10⁶ ячеек на 6-луночный планшет в среде MEF.
   15. Держите планшет внутри инкубатора с_CO2 при температуре 37 °C и влажности 85% в течение ночи. Встряхните пластину внутри инкубатора CO₂ спереди-назад и вбок 2-3 раза, чтобы добиться равномерного распределения питающих ячеек.
2. Возрождение ИПСК с синдромом Дауна и изогенных эуплоидных ИПСК
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрейте необходимый объем фильтрующего материала hiPSC в ванне с шариками при температуре 37 °C.
   Среда для оживления индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC): Добавьте 25 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) и 10 мкМ ингибитора камня (RI) (Y-27632 2HCl) в среду hiPSC.
   1. Хорошо удалите фильтрующий материал MEF из питателей и дайте кормушкам одну промывку, осторожно добавив 1 мл теплого DMEM/F12 с боков лунки. Отсадите среду и добавьте 2 мл/лунку теплую среду для восстановления ИПСК . Оставьте планшет внутри инкубатора не менее чем на 2 ч перед нанесением гиПСК.
   2. Достаньте пузырек с ИПСК
   3. Держите флакон на плавающей решетке на водяной бане при температуре 37 °C, пока не останется небольшой кусочек льда.
   4. Перед тем, как взять флакон внутрь шкафа биобезопасности, простерилизуйте его 70% спиртом.
   5. Добавьте 1 мл теплой среды для восстановления hiPSC.
   6. Осторожно выньте среду из флакона и вылейте по капле в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл среды для оживления hiPSCs.
   7. Центрифуга при комнатной температуре в течение 2 мин при 100 х г.
   8. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью ВАШ и вытесните гранулу, осторожно постукивая по трубке.
   9. Залейте 500 мкл среды hiPSC с 10 мкМ RI и полейте подающую пластину, содержащую среду для оживления hiPSC. Пометьте табличку названием ячейки, номером прохода, именем исследователя и датой.
   10. Наблюдайте за колониями гиПСК под инвертированным микроскопом при 4-кратном увеличении; Должны быть скопления клеток.
   11. Удерживая планшет внутри инкубатора CO₂ , встряхните планшет спереди-назад и вбок 2-3 раза, чтобы добиться равномерного распределения клеток. Не тревожьте пластину в течение 24 часов.
   12. На следующий день некоторые колонии могут выглядеть прилипшими к кормушкам, а некоторые будут плавать. Не отсасывая среды, добавьте свежую среду hiPSCs с добавлением 25 нг/мл bFGF и 10 мкМ RI.
   13. На второй день после пробуждения большая часть колоний будет прикреплена к поверхности. Полностью замените среду на среду hiPSC с концентрацией 25 нг/мл bFGF. В последующие дни будут видны колонии ИПСК.
       Примечание: Требуется не менее недели, чтобы иПСК ожили и создали колонии с гладкими, четко очерченными границами, однородной морфологией клеток и плотным центром колонии.
3. Пассаж при синдроме Дауна и изогенные эуплоидные ИПСК на кормушках
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом приема все реагенты должны быть теплыми. Избегайте чрезмерного дозирования клеток. Обращайтесь с клетками очень аккуратно.
   1. Пассаж ИПСК происходит, когда большинство колоний начинают сливаться друг с другом или когда возникает слишком много дифференцированных колоний. Как правило, расщепление необходимо проводить в течение 5-7 дней после первого прохода.
   2. Оживите пузырек кормушек за сутки до разделения.
   3. Дайте одну промывку кормушкам с 1 мл теплого DMEM/F12 и добавьте 2 мл теплой среды hiPSCs с добавлением 25 нг/мл bFGF. Оставьте планшет внутри инкубатора с_CO2 при температуре 37 °C не менее чем на 2 часа перед нанесением гиПСК.
   4. Наблюдайте за планшетом с ИПСК на предмет дифференцированных колоний и удалите дифференцированную колонию с помощью пипетки объемом 200 мкл под стереомикроскопом.
   5. Дайте одну полоску для ИПСК с 1 мл / хорошо теплой DMEM/F12.
   6. Влейте 1 мл/лунку 1 мг/мл раствора коллагеназы. Подержите планшет внутри инкубатора в течение 8-10 минут, а затем понаблюдайте под перевернутым микроскопом на предмет рыхлых краев колоний.
   7. Аспирируйте коллагеназу и сделайте 2 промывки DMEM/F12. Затем добавьте 1 мл на лунку hiPSC Medium.
   8. Аккуратно разрежьте колонии по горизонтали и вертикали 8-10 раз в лунке с помощью кончика шприца объемом 2 мл. Понаблюдайте за колониями под перевернутым микроскопом, чтобы проверить, была ли большая часть колоний обрезана до соответствующего размера.
   9. Если колонии достаточно обрезаны, аккуратно приподнимите колонии с помощью подъемника для клеток.
   10. Аккуратно пипетируйте колонии в лунке с помощью наконечника объемом 1 мл 5-8 раз, в зависимости от размера колоний.
   11. Соберите все клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 2 минут при плотности 100 x g.
   12. Осторожно отсадите надосадочную жидкость с помощью пипетки, вытесните клеточную гранулу, осторожно постукивая по пробирке, и добавьте 200 мкл среды hiPSC с 25 нг/мл bFGF и 10 мкМ RI. Пипетку 2-3 раза с помощью пипетки объемом 200 мкл и добавьте еще 300 мкл среды hiPSC с концентрацией 25 нг/мл bFGF и 10 мкМ RI.
   13. Теперь аккуратно нанесите эти клетки на питатели, содержащие среду hiPSC + 25 нг/мл bFGF. Одна скважина может быть разделена на 1:2 или 1:3, в зависимости от количества колоний, присутствующих после удаления дифференцированных колоний. Пометьте табличку названием ячейки, номером прохода, именем исследователя и датой.
   14. Удерживая планшет внутри инкубатора CO₂ , встряхните планшет спереди-назад и вбок 2-3 раза, чтобы добиться равномерного распределения клеток.
   15. На следующий день дайте одно осторожное полоскание теплым DMEM/F12 и добавьте 2,5 мл среды hiPSC с 25 нг/мл bFGF.
4. ИПСК с синдромом Фризинга Дауна и изогенные эуплоидные ИПСК из фидеров
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать чрезмерного пипетирования человеческих ИПСК во время процедуры замораживания.
   1. Расщепляйте ИПСК еще в фазе логарифма, т.е. через 4-5 дней после пассажа.
   2. Наблюдайте за планшетом с ИПСК на предмет дифференцированных колоний и удаляйте дифференцированные колонии с помощью пипетки объемом 200 мкл под стереомикроскопом.
   3. Дайте одну полоску для ИПСК с 1 мл / хорошо теплой DMEM/F12.
   4. Добавьте 1 мл/лунку 1 мг/мл раствора коллагеназы. Подержите планшет внутри инкубатора в течение 8-10 минут, а затем понаблюдайте под перевернутым микроскопом на предмет поднятия краев колоний.
   5. Аспирируйте коллагеназу и сделайте 2 промывки DMEM/F12. Затем добавьте 1 мл на лунку hiPSC Medium.
   6. Аккуратно приподнимите колонии с помощью клеточного подъемника.
   7. Аккуратно пипетируйте колонии в лунке с помощью наконечника объемом 1 мл 5-8 раз, в зависимости от размера колоний.
   8. Соберите все клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 2 минут при плотности 100 x g.
   9. Осторожно отсадите надосадочную жидкость с помощью пипетки, вытесните клеточную гранулу, осторожно постукивая по трубке, и добавьте 1 мл среды hiPSC без антибиотика с добавлением 25 нг/мл bFGF в зависимости от количества лунок. Диспенсируйте клетки в криовиалы.
   10. Добавьте hiPSC Medium без антибиотика с добавлением 25 нг/мл bFGF и 20% ДМСО в криовиалы для достижения 10% конечной концентрации ДМСО.
   11. Поместите криовалиал в морозную ванну с изопропанолом для обеспечения медленного замораживания.
   12. Держите морозную температуру при -80 °C в течение ночи. На следующий день переложите флаконы в резервуар LN2.

2. Дифференцировка нейронов

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление питательной среды, кондиционированной (FCM): Используйте колбу T-75 и тарелку 4 x 10^{по 6} ячеек питателя в колбе. На следующий день добавьте 40 мл среды hiPSC с 4 нг/мл bFGF. Собирают за 7 дней. Хранить каждый день в тюбике при температуре -20 °C до 1 месяца. Покройте чашку размером 15 см 10 мл 0,1% желатина при температуре 37 °C не менее чем за 2 ч до диссоциации клеток. Покрытие 6-луночного планшета матрицей базальной мембраны, квалифицированной hESC (далее именуемой «квалифицированной матрицей») за 1 день до диссоциации клеток. При диссоциации клеток по всему протоколу добавьте 10 мкМ RI в раствор для отсоединения клеток (см. Таблицу материалов), DPBS и гальванические среды (FCM с добавлением 25 нг/мл bFGF). Подготовьте свежую кондиционированную среду (FCM) для каждой дифференциации. Избегайте чрезмерного пипетирования ИПСК

1. Day in vitro (DIV) 2: Получение одиночных клеток и посев ИПСК для нейродифференцировки
   1. Добавьте 10 мкМ RI в среду hiPSC с добавлением 25 нг/мл bFGF, DPBS, раствором для отслоения клеток и питательную среду с добавлением 25 нг/мл bFGF. Прогрейте все эти реагенты до 37 °C.
   2. Возьмите 6-луночный планшет с iPSCs на кормушках, удалите дифференцированные колонии и добавьте свежие среды hiPSC с добавлением 25 нг/мл bFGF и 10 μМ RI. Подержите тарелку в течение 2 ч в инкубаторе.
   3. Выньте пластину с iPSCs через 2 часа и дайте одну промывку DPBS без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺.
   4. Добавьте 1 мл раствора для отделения клеток на лунку (+ 10 мкМ RI) и подержите планшет внутри инкубатора CO₂ в течение 12-14 минут.
   5. Через 12-14 мин понаблюдайте за клетками под инвертированным микроскопом; Большая часть ячеек начинает отделяться от пластины. Если некоторые ячейки все же прилипают, аккуратно постучите по пластине с боков.
   6. Раствор для отслойки клеток разбавляют добавлением 3 мл/лунка DPBS с Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺ (+ 10 мкМ RI). С помощью пипетки объемом 5 мл проведите 2-3 раза щадящее пипетирование, избегая образования пузырьков.
   7. Пропустите ячейки через сетчатое фильтр 40 μM.
   8. Соберите клетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   9. Центрифугируйте при комнатной температуре в течение 5 минут при 200 x g и осторожно отсасывайте среду с помощью VAS.
   10. Ресуспендируйте клетки в 10 мл среды hiPSC (+ 25 нг/мл bFGF + 10 мкМ RI). Добавьте ячейки на 15-сантиметровую посуду диаметром 0,1% желатина на 1,5 часа, чтобы удалить кормушки, поскольку кормушки имеют преимущественную адгезию к поверхности, покрытой желатином, по сравнению с гиПСК.
   11. Через 1,5 ч аккуратно соберите среду с ячейками и центрифугируйте при комнатной температуре в течение 5 мин при 200 x g. Аспирация среды с помощью ВАШ.
   12. Ресуспендируйте клетки в 1 мл FCM (+ 25 нг/мл bFGF + 10 μМ RI) и отсчитайте количество клеток.
   13. Используя FCM (+ 25 нг/мл bFGF + 10 μМ RI), сделайте клеточную суспензию 30 000-50 000 клеток/мл и затравите 5 мл клеточной суспензии / 60 мм планшет или 2 мл / лунку 6-луночного планшета или 500 мкл / лунку 24-луночного планшета. Пластины должны быть покрыты квалифицированной матрицей (см. Таблицу материалов).
2. DIV 0: (~48 ч спустя): Замените питательную среду на среду NPC (DDM + B27 без витамина A + N2) (см. Таблицу материалов).
3. DIV 2: Добавляйте NPC-среду с 0,125 μM дорсоморфина через день до DIV 18.
4. DIV 18: Добавьте NPC медиа без дорсоморфина и пополняйте каждый день до DIV 28.
5. DIV 28-30: Создание одиночных клеток и посев NPC для этапа 2
   1. На DIV 28 извлеките пластину (содержащую NPC) и замените носитель на NPC media (+ 10 μM RI). Поставьте тарелку в инкубатор СО₂ на 2 ч.
   2. Через 2 ч аспирируйте среду и дайте одну промывку DPBS (без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺).
   3. Добавьте 1 мл раствора для отделения клеток на лунку (+ 10 мкМ RI) и подержите планшет внутри инкубатора в течение 14 минут.
   4. Через 14 мин наблюдайте за клетками под инвертированным микроскопом с кратностью 4x. Большая часть ячеек начинает отделяться от пластины. Если некоторые ячейки все же прилипают, аккуратно постучите по пластине с боков.
   5. Раствор для отслойки клеток разбавляют добавлением 3 мл/лунка DPBS с Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺ (+ 10 мкМ RI). С помощью пипетки объемом 5 мл проведите 2-3 раза щадящее пипетирование, избегая образования пузырьков.
   6. Пропустите через ситечко 40 мкМ, помещенное в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   7. Центрифуга при комнатной температуре в течение 5 мин при 200 x g. Мягко отсаживайте среду с помощью ВАШ.
   8. Ресуспендируйте клетки в ДДМ + В27 витамином А (+ 10 мкМ RI).
   9. Посчитайте живые клетки с помощью трипана синего с гемоцитометром.
   10. Засейте 50 000 клеток/лунку на квалифицированную матричную пластину (1x) из 48-луночной пластины.
6. DIV 33: Изменение среды на среду нейронной дифференцировки (см. Таблицу материалов). Меняйте среду каждые 5 дней. Продолжайте пополнять носитель до DIV 85/90.

3. Иммуноцитохимия (ИКХ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте достаточное количество буфера на всех этапах, чтобы покрыть ячейки и избежать высыхания лунки во время аспирации на этапе промывки.

1. Выньте дифференцированную клеточную пластину за пределы области клеточной культуры.
2. Аспирируйте среду и промывайте DPBS.
3. Для фиксации добавьте в клетки 1 мл 4% параформальдегида (PFA). Накройте пластину алюминиевой фольгой и поместите ее на коромысло при температуре 37 °C на 30 минут.
4. Аспирируйте PFA и дайте три промывки по 15 мин DPBS (без Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺).
5. Добавьте блокирующий буфер (3% БСА + 5% сыворотку осляка (или сыворотку животного-хозяина вторичного антитела) + 0,2% Тритон-Х в DPBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
6. Добавьте 250 μл/лунку первичных антител [Ki67 (1: 100 разведение), TUBB3 (1: 500 разведение), PAX6 (1: 100)] и инкубируйте в течение ночи при 4 °C на коромысле. Разведение проводилось в блокирующем растворе.
7. Трижды промыть DPBS после первичной инкубации антител.
8. Добавьте 250 μл/лунку вторичного антитела (разбавленного 1:250 в 3% BSA + 0,2% Triton-X в DPBS) в течение 1 ч при комнатной температуре.
9. Промыть 3 раза DPBS после инкубации вторичных антител.
10. Добавьте DAPI (1:1000 разведение 5 мг/мл запаса в DPBS) в течение 15 минут при комнатной температуре. Трижды постирать с помощью DPBS. Последнюю промывку оставьте в культуральной тарелке и понаблюдайте под микроскопом.

4. Получение и анализ изображений

1. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа с 20-кратным разрешением.
2. Получение изображений Ki67, а также изображений окрашивания TUBB3 с помощью фильтра возбуждения 540 нм, PAX6 с помощью фильтра возбуждения 488 нм и изображений DAPI с использованием фильтра возбуждения 358 нм.
3. Захватывайте изображения из десяти различных случайных полей для анализа.
4. Анализируйте изображения ICC с помощью программного обеспечения ImageJ.
5. Для анализа TUBB3 и PAX6 выполните пороговое определение всех изображений для красного и зеленого сигналов соответственно, а также интенсивность синего сигнала для DAPI. Средняя интенсивность красных пикселей TUBB3 и зеленых пикселей PAX6 была нормализована по средней интенсивности синих пикселей DAPI.
6. Для анализа Ki67 подсчитайте ячейки с помощью функции автоматического счетчика клеток в программном обеспечении ImageJ. Нормализуйте количество Ki67-положительных клеток с количеством DAPI-положительных клеток.
7. Выполняйте статистический анализ с помощью статистического и графического программного обеспечения, сравнивая две группы с помощью непарных t-критериев. Данные должны быть выражены в виде среднего значения ± SEM из трех независимых экспериментов. p-значение менее 0,05 считается статистически значимым.

Отдельные человеческие ИПСК засеивали на чашки с квалифицированным матричным покрытием в виде суспензий одиночных клеток, а дифференцировку инициировали путем удаления bFGF. Для ингибирования неэктодермальной дифференцировки из DIV 2-18²¹ был добавлен дорсоморфин, ингибитор передачи сигналов BMP. Для дальнейшей дифференцировки клеток-предшественников из нейрогенной стадии суспензии одиночных клеток повторно помещали с низкой плотностью на квалифицированный матрикс (рис. 1) в течение дополнительных 6-10 недель для наблюдения за ранней нейронной дифференцировкой. После стадии нейронной дифференцировки (стадия 2) анализ на 85-й день показал значительное снижение количества нейронов TUBB3+ в культурах DS по сравнению с теми, которые были с изогенными эуплоидными клетками (рис. 2A). Количественное определение показало примерно двукратное уменьшение количества нейронов TUBB3+ в культурах DS (рис. 2B). Это указывает на то, что клетки DS демонстрируют сниженную дифференцировку нейронов, что согласуется с наблюдениями за срезами мозга плода DS, демонстрируя надежность модели нейрогенеза DS in vitro , использованной в этом исследовании.

Чтобы исследовать основную причину снижения количества нейронов при синдроме Дауна, было использовано иммуноокрашивание Ki67 для анализа клеточного цикла на нейрогенной стадии нейрогенеза. В ранней фазе этой стадии большинство изогенных эуплоидных клеток были Ki67+, что указывает на активную пролиферацию клеток. Напротив, значительно меньшая доля DS-клеток была Ki67+ (Рисунок 2C). Количественный анализ показал примерно четырехкратное снижение количества клеток Ki67+ при DS (рисунок 2D), что позволяет предположить, что клетки DS преимущественно оставались в фазе G0 на ранней нейрогенной стадии. Дальнейший анализ, проведенный в поздней фазе нейрогенной стадии, показал, что большинство изогенных эуплоидных клеток вышли из клеточного цикла, о чем свидетельствует отсутствие окрашивания Ki67 (рис. 2E). И наоборот, большинство DS-клеток оставались Ki67+ (рис. 2F), что указывает на персистенцию циклических клеток-предшественников. Количественные данные показали примерно пятикратное увеличение Ki67+ клеток при ДС по сравнению с изогенными эуплоидными клетками. Эти результаты по первой паре ДС и изогенных эуплоидных ИПСК были подтверждены с использованием второй пары ДС и изогенных эуплоидных ИПСК. Вторая пара также продемонстрировала сниженный нейрогенез на 85-й день в клетках DS по сравнению с изогенными эуплоидными клетками (рис. 2G). Количественный анализ показал двукратное уменьшение количества нейронов TUBB3+ (рис. 2H) в конце нейронной дифференцировки. Кроме того, наблюдалось более чем двукратное увеличение количества нейральных клеток-предшественников PAX6+ при ДС по сравнению с изогенными эуплоидными клетками на той же стадии (рис. 2G и рис. 2I). Эти результаты подтвердили, что нейральные клетки-предшественники DS не смогли выйти из клеточного цикла и дифференцироваться в постмитотические нейроны, что согласуется с дефектом двухфазного клеточного цикла.

Данное исследование, проведенное с использованием двух пар ИПСК ДС и их изогенных эуплоидных аналогов, демонстрирует, что нарушение нейрогенеза, наблюдаемое при ДС, обусловлено дисрегуляцией двухфазного клеточного цикла на нейрогенной стадии развития нейральных предшественников. Во время нейронной индукции DS-клетки демонстрировали сниженную пролиферацию на ранней стадии, за которой следовала повышенная пролиферация на поздней фазе по сравнению с контрольными клетками. Уменьшение пролиферации в ранней фазе ограничивает размер пула нейронных предшественников, в то время как повышенная пролиферация во время поздней фазы задерживает образование постмитотических нейронов при синдроме Дауна.

Рисунок 1: Иллюстрация нейрогенеза ИПСК человека с синдромом Дауна (СД). Из рисунков видно, что нейрогенез делится на две стадии: нейрогенную стадию и стадию нейронной дифференцировки. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток к стадии нейральных предшественников называется нейрогенной стадией, в то время как дифференцировка нейр-предшественников к клеткам нервной линии называется стадией нейронной дифференцировки. На рисунке показаны временные шкалы для каждого этапа, как указано в данном протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Двухфазный дефект клеточного цикла способствует нарушению нейрогенеза при синдроме Дауна (ДА). (A) Репрезентативные изображения TUBB3 (красные), изображения DAPI и соответствующее наложение из первой пары DS и изогенных эуплоидных ИПСК на 85-й день. (B) Количественная оценка экспрессии TUBB3, нормализованная к окрашиванию DAPI, с помощью иммуноцитохимии (ИКХ). (C) Репрезентативные изображения Ki67 (красный) на ранней фазе (DIV 18) стадии 1, с соответствующими изображениями DAPI и их наложением с первой пары DS и изогенных эуплоидных ИПСК. (D) Количественная оценка экспрессии Ki67 на ранней стадии. (E) Репрезентативные изображения Ki67 во время поздней фазы (DIV 28) стадии 1, с соответствующими изображениями DAPI и их наложением из первой пары DS и изогенных эуплоидных hiPSCs. (F) Количественная оценка экспрессии Ki67 на поздней стадии. (G) Репрезентативные изображения TUBB3 (красный), PAX6 (зеленый) и DAPI из второй пары DS и изогенных эуплоидных ИПСК. (H) Количественная оценка экспрессии TUBB3 на 85-й день. (I) Количественная оценка экспрессии PAX6 на 85-й день. Сравнения между группами проводились с использованием непарных t-критериев. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM из трех независимых экспериментов, статистическая значимость которых определена как p < 0,05. Масштабные линейки представляют собой 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В данной работе описан эффективный протокол ненаправленной монослойной корковой нейродифференцировки для изогенной пары эуплоидных ИПСК и ДС ИПСК. Поскольку клетки выращиваются в виде монослоев, они в большей степени подвергаются воздействию условий культивирования, что невозможно в той же степени, что и использование эмбриоидных тел для дифференцировки иПСК, которые обычно используются в других протоколах^14,16. В то время как полезность органоидных систем растет, монослойные нейронные системы дифференцировки сохраняют свои преимущества, обеспечивая клетки однородной средой для дифференцировки. В системах, основанных на органоидах, из-за их трехмерной природы, может формироваться локальная центрообразующая активность. Кроме того, не все клетки в органоидах имеют равный доступ к экзогенно добавленным факторам роста, что приводит к неконтролируемому градиенту морфогена, о чем свидетельствует гибель клеток в центре органоидов. Несмотря на то, что было предложено несколько усовершенствований в органоидных методах, существует необходимость в валидации органоидных методов по их способности повторять фенотипы, наблюдаемые в образцах человека. Как уже упоминалось, несколько предыдущих протоколов не смогли воспроизвести нейрогенез с нарушением DS. Таким образом, предпочтение отдавалось методу, основанному на монослое, что позволяло более контролируемые условия культивирования во время нейродифференцировки. Методы нейродифференцировки постоянно развиваются. В то время как некоторые методы обеспечивают более быструю нейродифференцировку²², другие обеспечивают более физиологически значимое время дифференцировки²³. Кроме того, использование нефизиологических соединений, таких как DAPT, цАМФ или аскорбиновая кислота, или нефизиологические концентрации факторов роста, таких как GDNF и BDNF, должны быть оценены пользователями перед их использованием для нейродифференцировки. Экзогенно добавленные соединения или факторы роста могут маскировать внутренние свойства больных клеток и предотвращать имитацию условий in vivo в чашке.

Успешность нейродифференцировки зависит от качества ИПСК до посева для дифференцировки. Дифференцированных колоний должно быть менее 10%. Одним из важнейших этапов экспериментальной процедуры является то, что иПСК следует засеивать при низкой плотности в диапазоне от 5000 до 10 000 клеток^/см2, а для достижения дорсализации клеток дорсоморфин следует добавлять в течение примерно 16 дней в низкой концентрации 0,125 мкМ. Обширная гибель клеток наблюдается при более высоких концентрациях дорсоморфина при использовании с пластинчатыми клетками низкой плотности. Ноггин также может быть добавлен вместо дорсоморфина для снижения гибели клеток, но дорсоморфин использовался для снижения высокой стоимости, связанной с ноггином. Осаждение клеток с высокой плотностью снижает нейронную дифференцировку и может также способствовать развитию нейронных популяций среднего и заднего мозга²⁴. Поскольку различные iPSC могут различаться по скорости пролиферации, первоначальная плотность покрытия должна быть проверена для каждой новой линии hiPSC. Кроме того, если плюрипотентные стволовые клетки демонстрируют обширную пролиферацию, клетки могут быть разделены примерно на 20-й день. Этот протокол будет полезен при изучении влияния генов хромосомы 21 на нейрогенез ДС и может быть использован для скрининга лекарственных препаратов.

Основным ограничением этого протокола является длительная продолжительность дифференцировки в нейроны (до 85-90 дней). Кроме того, было замечено, что временные рамки для ранней фазы, поздней фазы и конечной стадии могут различаться во время нейродифференцировки дополнительных линий ИПСК, но дефекты двухфазного клеточного цикла все еще могут наблюдаться во время нейродифференцировки ДС. Различия, наблюдаемые в разных ИПСК могут быть обусловлены внутренними различиями в ИПСК из-за стохастического характера процесса перепрограммирования или из-за различий в номерах пассажей.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Авторы благодарят профессора Стюарта Х. Оркина за предоставление нам пары синдрома Дауна и изогенных эуплоидных ИПСК. Авторы также благодарны Национальному центру клеточных наук (BRIC-NCCS) в Пуне за предоставление финансирования для проведения этой работы.