インビトロ ヒト人工多能性幹細胞を用いたダウン症の神経新生のモデリング

このプロトコルは、DSヒトiPS細胞を使用してダウン症(DS)の神経新生障害を再現するための方法論を概説しています。プロトコルは、ダウン症候群の神経新生障害の原因として二相性細胞周期の欠陥を特定しました。これは、DSに関連する異常なニューロン新生の根底にある細胞および分子メカニズムを理解するための堅牢なプラットフォームを提供します。

ダウン症(DS)は、21番染色体のコピーが余分にあることによって引き起こされ、知的障害の主な原因です。この知的障害の主な要因の1つは、胎児期以降に観察される神経新生の障害です。これらの神経発達異常を研究するために、DS患者から得られた細胞を使用して生成されたヒト誘発多能性幹細胞(hiPSC)は、貴重で関連性のあるモデルを提供します。ここでは、DS胎児期に観察されるDS障害ニューロン新生を再現するための包括的なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、21 番染色体の 3 つのコピーを持つ DS-iPSC のペアと、2 つの染色体 21 つのコピーを持つその同質正倍数体 iPSC を利用します。重要なことに、ここに記載されているプロトコルは、DS障害のあるニューロン新生を再現し、二相性細胞周期の欠陥、すなわち、神経原性段階の初期段階でのDS神経前駆細胞(NPC)の増殖の減少、続いて神経原性段階の後期段階でのDS NPCの増殖の増加がDS障害ニューロン新生の原因であることを発見しました。神経原性期の後期にDS NPCの増殖が増加すると、細胞周期からの退出が遅れ、DS NPCからの有糸分裂後ニューロンの生成が減少します。このプロトコルには、ヒトiPS細胞の維持、神経原性段階での二相性細胞周期欠損を示す神経系統への分化、およびその後のDS細胞における神経分化の減少の検証のための詳細な手順が含まれています。この方法論に従うことで、研究者はDSの神経発達状態を模倣した堅牢な実験システムを作成することができ、21トリソミーによって引き起こされる脳の発達の特定の変化を探求することができます。

ダウン症(DS)または21トリソミーは、最も一般的な染色体異常であり、知的障害(ID)の主な原因です¹。DS胎児発育中の神経新生障害は、^DS2の知的障害の原因の1つです。ヒトDS胎児研究では、脳の重量と体積の減少、ニューロンの減少、アストロサイト^の増加3,4、および第II層とIV層^のニューロンの異常な分布が示されています^5,6。さらに、皮質発達の第2段階、すなわちラミネーションの出現は、DS⁷では遅延し、無秩序である。

DSの神経発達障害は、主にTs65Dn、Ts1Rhr、Ts1cjeなどのDSのマウスモデルを使用して研究^{されています8。}しかし、これらのマウスモデルは、マウス^{とヒトとの間の}生理学的および発達的な違い9のために、DS研究で観察されたさまざまな表現型を完全に再現することができず^、臨床試験の失敗につながった¹⁰。人工多能性幹細胞^11,12の発明は、DS患者に直接由来する細胞を用いてダウン症の神経学的障害をモデル化する機会を提供した。しかし、ヒトiPS細胞を用いてDSの神経発達障害をモデル化する以前の試みでは、一貫性のない結果が得られ、DS胎児の脳切片^13,14,15,16で観察された神経発達障害を完全に説明することはできませんでした。例えば、Shiらが発表した報告では、DS関連のアルツハイマー病の表現型が見つかりましたが、正倍数体対照と比較してDSの神経新生に差はなかったと報告されています¹⁵。同様に、Weickらは、正倍数体対照と比較して、DSのシナプス活性の低下が正常な神経新生を報告した¹⁶。しかし、これらの論文で報告されたDSの正常な神経新生は、DS胎児の脳切片からの観察と一致しませんでした。その後、Hibaouiらによる報告により、DSの神経新生の減少が報告されましたが、これはDSの胎児脳セクション¹⁴からの観察と一致していました。しかし、この報告と別の最近の報告では、DS NPCの増殖の減少がDSの神経新生の減少の原因として説明されています¹⁷。しかし、DS NPCの増殖の減少だけでは、DS胎児の脳の発達中にアストログリア細胞の増加とラミネーションの出現の遅延を説明できませんでした。

最近発表された研究では、ヒトiPS細胞を用いたDS欠損型ニューロン新生モデルが開発され、ニューロン新生の減少が示されました。このモデルでは、DSの神経新生障害は、神経原性(多能性幹細胞から神経前駆細胞が生成される段階)の二相性細胞周期の欠陥によるものであることがわかりました。神経原性段階の最初の段階では、DS NPCは同質正倍数体神経細胞と比較して増殖が減少し、続いて神経原性病期¹⁸の後期に同質正倍数体細胞と比較してDS NPCの増殖が増加します。

この原稿では、ダウン症の iPSC とその同質正倍数体 iPSC を皮質ニューロンに分化するための段階的な詳細なプロトコルについて説明しました。この方法の全体的な目標は、DS に関連するニューロン新生欠損のモデル化に焦点を当てて、DS hiPSC のペアとその同質正倍数体 iPSC を皮質ニューロンに区別するための詳細な段階的なプロトコルを提供することです。このプロトコルは、DS 障害の神経新生を引き起こす異常の根底にある細胞および分子メカニズムを調査するための堅牢で再現性の高いシステムを提供するように設計されています。

このプロトコルの開発の背後にある理論的根拠は、発生神経生物学の原則を利用して多能性幹細胞の皮質ニューロンへの分化を可能にし、それによって疾患/障害によって生じる表現型の同定を可能にすることです。これは、cAMPやDAPTのような化合物を避けることにより、iPS細胞の神経分化に最小限のアプローチを取ることを目指しました。これは、それぞれCa⁺⁺ チャネルまたはNOTCH経路の欠陥によって生じる疾患の表現型を隠す可能性があります。同様に、アスコルビン酸、BDNF、およびGDNFの使用も避けられ、神経新生を増強することにより他の神経疾患関連の表現型を隠す可能性があります。

この手法が他の方法よりも優れているのは、DS胎児の脳切片で観察された神経学的表現型の堅牢な再現を提供することにあります。注目すべきは、マウスモデルと比較して、ヒトiPS細胞ベースのシステムは異種間の違いを排除し、ヒト特異的な神経^{発達過程を研究する} ためのより適切なモデルを提供している9が、これまでDS胎児期以降に観察されるDS障害のニューロン新生を再現することができなかった。さらに、iPS細胞の同遺伝子ペアの使用により、観察された表現型の違いのばらつきが減少し、信頼性が向上します。このプロトコルは、神経発達障害とヒトの神経新生を研究する研究者にとって特に興味深いものとなるでしょう。これは、DSのヒト特異的な側面をモデル化しようとしている人や、21トリソミーに関連する神経新生欠損を標的とする治療的介入の開発に関心のある人に特に関連します。

次のプロトコルに続いて、2組のダウン症候群とその同質正倍数体ヒトiPS細胞を使用しました。1組は、レトロウイルス媒介送達法であるリプログラミング¹⁹を用いて作製し、もう一組(NSi003-AおよびNSi003-B)は^、非統合型仙台ウイルス送達法を用いて作製した²⁰。プロトコルは、大きく分けて 2 つの段階で構成されています: 神経原性段階 (ステージ 1) と神経分化段階 (ステージ 2)。さらに、ダウン症候群と同質正倍数系細胞株の増殖の違いに基づく2つの段階、すなわち、初期期と後期期が神経原性段階で観察されます。この研究で使用した試薬、培地、および機器の詳細は、材料表に記載されています。

1. ダウン症のヒトiPS細胞と同質正倍数系ヒトヒトPS細胞の培養と維持

1. hiPSC用フィーダーめっき
   注:フィーダーの品質と密度は、ヒトiPS細胞の培養を高品質にするために非常に重要です。
   1. フィーダーセルを播種する前に、2 mLの0.1%ゼラチンを加えて、6ウェルプレートを37°Cで少なくとも1〜2時間コーティングします。
   2. ゼラチンでコーティングしたプレートを細胞培養フード内で室温で少なくとも30分間保持してから、細胞をプレーティングします。
   3. ビーズ浴/水浴での蘇生に使用される温熱マウス胚性線維芽細胞(MEF)培地。
   4. 5 mLのMEF培地を15 mLの遠心チューブに分注します。
   5. 液体窒素タンク(LN2タンク)からフィーダーセルのバイアルを取り出します。
      注:フィーダー細胞は、E13.5マウス胚性線維芽細胞を10μg / mLマイトマイシンCで3時間処理した後、DPBS¹⁸で2〜3回洗浄することによって得られました。フィーダーセルは、直接使用することも、将来の使用のためにLN2タンクで凍結することもできます。すべてのマウスは、動物倫理委員会の承認後に使用されました。
   6. バイアルをフローティングラックを使用してウォーターバスで37°Cに保ち、氷の小片が残るまで待ちます。
   7. バイアルをバイオセーフティキャビネットに入れ、アルコールで滅菌してからバイオセーフティキャビネットに入れます。
   8. 1 mLの温かいMEF培地( 材料の表を参照)を一滴ずつ加えます。
   9. バイアルから培地を静かに取り出し、MEF培地が入った15mLの遠心チューブに一滴ずつ注ぎます。
   10. 室温で200 x gで5分間遠心分離します。
   11. 真空吸引システム(VAS)を使用して上清を吸引します。
   12. MEF培地1mLを加え、3〜4回ピペットで静かに上下させます。
   13. 血球計算盤を使用して細胞数を取ります。死細胞はTrypan Blueを使用して除外しました。
   14. プレート 3.1-3.3 x 10 MEF 培地中の 6 ウェルプレートのウェルあたり⁵ 個の生フィーダー細胞、または 6 ウェルプレートあたり 2 x 10⁶ 細胞。
   15. プレートを_CO2 インキュベーター内に37°C、湿度85%で一晩保管します。CO₂ インキュベーター内のプレートを前後および横に2〜3回振って、フィーダー細胞の均一な分布を実現します。
2. ダウン症のhiPSCと同質正倍数性hiPSCの復活
   注:必要な量のhiPSC培地を37°Cビーズ浴で温めます。
   ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)リバイバル培地:25 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)と10 μMの岩石阻害剤(RI)(Y-27632 2HCl)をhiPSC培地に新たに加えます。
   1. フィーダーウェルからMEF培地を取り出し、ウェルの側面から温かいDMEM/F12を1 mL/ウェルで穏やかに加えて、フィーダーに1回洗浄します。培地を吸引し、2 mL/ウェルウォームの hiPSC リバイバル培地を加えます。プレートをインキュベーター内に少なくとも2時間放置してから、hiPSCをプレーティングします。
   2. hiPSCのバイアルを取り出します。
   3. バイアルを37°Cのウォーターバスのフローティングラックに置き、小さな氷片が残るまで保管します。
   4. バイアルをバイオセーフティキャビネット内に取り込む前に、70%アルコールで滅菌してください。
   5. 温かいhiPSCリバイバル培地1mLを加えます。
   6. バイアルから培地を静かに取り出し、5 mLのhiPSCsリバイバル培地が入った15 mLの遠心チューブに一滴ずつ注ぎます。
   7. 100 x gで室温で2分間遠心分離します。
   8. VASを使用して上清を吸引し、チューブを軽くたたいてペレットを取り除きます。
   9. 500 μL の hiPSC 培地と 10 μM の RI を注ぎ、hiPSC リバイバル培地が入ったフィーダープレートに注ぎます。プレートにセル名、継代番号、研究者名、日付をラベル付けします。
   10. 倒立顕微鏡でhiPSCコロニーを4倍の倍率で観察します。細胞の塊があるはずです。
   11. プレートを_CO2 インキュベーター内に保持しながら、プレートを前後および横に2〜3回振って、細胞の均一な分布を実現します。プレートを24時間邪魔しないでください。
   12. 翌日、一部のコロニーはフィーダーに付着しているように見えるかもしれませんし、一部のコロニーは浮いているかもしれません。培地を吸引せずに、25 ng/mL bFGFと10 μMのRIを添加した新鮮なhiPSC培地を添加します。
   13. 復活後2日目には、ほとんどのコロニーが地表にくっついてしまう。完全培地を 25 ng/mL bFGF の hiPSC 培地に交換します。数日後には、hiPSCコロニーが見えるようになります。
       注:hiPSCが蘇生し、滑らかで明確な境界、均一な細胞形態、密集したコロニー中心を持つコロニーを作るには、少なくとも1週間かかります。
3. フィーダー上のダウン症候群の継代性hiPSCおよび同質性正倍数体hiPSCの作製
   注:開始する前に、すべての試薬を温めておく必要があります。細胞の過剰ピペッティングを避けてください。細胞を非常に優しく扱います。
   1. ほとんどのコロニーが互いに融合し始めたとき、または分化したコロニーが多すぎるときに、通過性iPSCs。一般的に、分割は最初の通過後5〜7日以内に行う必要があります。
   2. 分割の1日前にフィーダーのバイアルを復活させます。
   3. 1 mL/ウェルの温かいDMEM/F12をフィーダーに1回洗浄し、25 ng/mLのbFGFを添加した2 mL/ウェルの温かいiPS細胞培地を加えます。プレートを_CO2 インキュベーター内に37°Cで少なくとも2時間放置してから、hiPSCをプレーティングします。
   4. 分化したコロニーについてhiPSCを含むプレートを観察し、実体顕微鏡下で200μLのピペットを使用してスクラップすることにより、分化したコロニーを除去します。
   5. hiPSCを1 mL/well warm DMEM/F12で1回洗浄します。
   6. 1 mL/ウェルに1 mg/mlのコラゲナーゼ溶液を注ぎます。プレートをインキュベーター内に8〜10分間保持し、倒立顕微鏡でコロニーの緩いエッジを観察します。
   7. コラゲナーゼを吸引し、DMEM/F12を2回洗浄します。次に、1 mL/well hiPSC Mediumを添加します。
   8. 2mLシリンジの先端を使用して、ウェル内でコロニーを水平および垂直に8〜10回穏やかに切断します。倒立顕微鏡でコロニーを観察し、ほとんどのコロニーが適切なサイズにカットされているかどうかを確認します。
   9. コロニーが十分に切断されている場合は、セルリフターを使用してコロニーを静かに持ち上げます。
   10. コロニーのサイズに応じて、1mLチップを使用してウェル内のコロニーを5〜8回静かにピペットで動かします。
   11. すべての細胞を15 mLの遠心チューブに集め、100 x gで室温で2分間遠心分離します。
   12. ピペットで上清を静かに吸引し、チューブを軽くたたいて細胞ペレットを取り除き、200 μL の hiPSC 培地に 25 ng/mL の bFGF と 10 μM の RI を加えます。200 μLのピペットで2〜3回ピペットを動かし、さらに300 μLのhiPSC培地に25 ng/mL bFGFと10 μMのRIを加えます。
   13. 次に、これらの細胞をhiPSC培地+ 25 ng/mL bFGFを含むフィーダーに優しく播種します。1つのウェルは、差別化されたコロニーを除去した後に存在するコロニーの数に応じて、1:2または1:3に分割できます。プレートにセル名、継代番号、研究者名、日付をラベル付けします。
   14. プレートを_CO2 インキュベーター内に保持しながら、プレートを前後および横に2〜3回振って、細胞の均一な分布を実現します。
   15. 翌日、温かいDMEM/F12で1回優しく洗い、2.5 mLのhiPSC培地と25 ng/mLのbFGFを加えます。
4. フィーダーからの凍結ダウン症候群 hiPSC および同遺伝子ユーロイド iPSC
   注:凍結手順では、ヒトiPS細胞の過剰ピペッティングは避けてください。
   1. iPSCは、まだ対数期にあるとき、つまり継代後4〜5日後に分割します。
   2. ヒトiPS細胞を含むプレートで分化したコロニーを観察し、実体顕微鏡で200μLのピペットを使用して分化したコロニーを除去します。
   3. hiPSCを1 mL/well warm DMEM/F12で1回洗浄します。
   4. 1 mL/ウェルの1 mg/mLコラゲナーゼ溶液を加えます。プレートをインキュベーター内に8〜10分間保持し、倒立顕微鏡でコロニーの端を持ち上げて観察します。
   5. コラゲナーゼを吸引し、DMEM/F12を2回洗浄します。次に、1 mL/well hiPSC Mediumを添加します。
   6. セルリフターを使用してコロニーを静かに持ち上げます。
   7. コロニーのサイズに応じて、1mLチップを使用してウェル内のコロニーを5〜8回静かにピペットで動かします。
   8. すべての細胞を15 mLの遠心チューブに集め、100 x gで室温で2分間遠心分離します。
   9. ピペットで上清を静かに吸引し、チューブを軽くたたいて細胞ペレットを取り除き、ウェル数に応じて25 ng/mL bFGFを添加した抗生物質を含まないhiPSC培地1 mLを加えます。細胞をクライオバイアルに分注します。
   10. 25 ng/mL bFGF と 20% DMSO を添加した抗生物質を含まない hiPSC 培地をクライオバイアルに添加すると、DMSO の最終濃度が 10% になります。
   11. クライオバイアルをイソプロパノール浴のある冷ややかな場所に入れて、ゆっくりと凍結します。
   12. 霜が降りるような状態を-80°Cで一晩保ちます。翌日、バイアルをLN2タンクに移します。

2. 神経細胞の分化

注:フィーダーコンディショニング培地(FCM)の調製:T-75フラスコを使用し、フラスコごとに4 x 10⁶ フィーダーセルをプレートします。翌日、40 mLのhiPSC培地と4 ng/mLのbFGFを加えます。7日間集めます。各デイチューブは-20°Cで最大1か月間保管してください。15 cmのディッシュに10 mLの0.1%ゼラチンを37°Cで少なくとも2時間コーティングしてから、細胞を解離します。細胞を解離する1日前に、hESC修飾基底膜マトリックス(以下「適格マトリックス」という)で6ウェルプレートをコーティングします。プロトコール全体で細胞を解離する場合は、細胞剥離溶液( 材料表を参照)、DPBS、およびプレーティング培地(FCMに25 ng/mL bFGFを添加)に10 μMのRIを添加します。あらゆる差別化に対応するフレッシュフィーダーコンディショニング培地(FCM)を調製します。hiPSCの過剰ピペッティングは避けてください。

1. Day In vitro (DIV) 2:神経分化のための単一細胞の作製とhiPSCの播種
   1. 25 ng/mL bFGFを添加したhiPSC培地、DPBS、細胞剥離溶液、および25 ng/mL bFGFを添加したフィーダーコンディショニング培地に10 μMのRIを添加します。これらすべての試薬を37°Cで温めます。
   2. フィーダー上にiPS細胞の6ウェルプレートを載せ、分化したコロニーを除去し、25ng/mLのbFGFと10μMのRIを添加した新鮮なhiPSC培地を加えます。プレートをインキュベーターに2時間保管します。
   3. 2時間後にiPS細胞プレートを取り出し、Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺を含まないDPBSで1回洗浄します。
   4. 1 mL/ウェル細胞剥離溶液(+10 μMのRI)を加え、プレートを_CO2 インキュベーター内に12〜14分間保持します。
   5. 12〜14分後、倒立顕微鏡で細胞を観察します。ほとんどの細胞はプレートから剥離し始めます。まだ一部の細胞が付着している場合は、プレートを側面から軽くたたいてください。
   6. 3 mL/well DPBSをCa⁺⁺ およびMg⁺⁺ (+10 μMのRI)を加えて細胞剥離溶液を希釈します。5mLのピペットを使用して、2〜3回穏やかにピペッティングを行い、泡が塊を壊さないようにします。
   7. 細胞を40 μMのストレーナに通します。
   8. 細胞を50 mLの遠心チューブに集めます。
   9. 室温で200 x g で5分間遠心分離し、VASを使用して培地を穏やかに吸引します。
   10. 細胞を10 mLのhiPSC培地(+25 ng/mL bFGF + 10 μMのRI)に再懸濁します。0.1%ゼラチンでコーティングした15cmディッシュに細胞を1.5時間加えると、フィーダーはhiPSCに比べてゼラチンコーティング表面に優先的に接着するため、フィーダーを取り出します。
   11. 1.5時間後、培地を細胞とともに静かに回収し、室温で200 x gで5分間遠心分離します。VASを使用して培地を吸引します。
   12. 細胞を1 mLのFCM(+25 ng/mL bFGF + 10 μMのRI)に再懸濁し、細胞数を測定します。
   13. FCM(+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM of RI)を使用して、30,000-50,000細胞/mLの細胞懸濁液を作製し、5 mLの細胞懸濁液/60 mmプレートまたは2 mL/ウェルの6ウェルプレートまたは500 μL/ウェルの24ウェルプレートを播種します。プレートは、適格なマトリックスでコーティングする必要があります( 材料の表を参照)。
2. DIV 0: (~48 時間後): フィーダーコンディショニング培地を NPC 培地 (ビタミン A + N2 を含まない DDM + B27) に変更します ( 材料の表を参照)。
3. DIV 2: DIV 18 まで隔日で 0.125 μM のドルソモルフィンを含む NPC 培地を追加します。
4. DIV 18: ドルソモルフィンを含まないNPC培地を追加し、DIV 28まで隔日で補充します。
5. DIV 28-30: ステージ2の単一細胞の作成とNPCの播種
   1. DIV 28で、プレート(NPCを含む)を取り出し、メディアをNPCメディア(+10μMのRI)と交換します。プレートをCO₂ インキュベーターに2時間入れます。
   2. 2時間後、培地を吸引し、DPBS(Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺なし)で1回洗浄します。
   3. 1 mL/ウェル細胞剥離溶液(+10 μMのRI)を加え、プレートをインキュベーター内に14分間保持します。
   4. 14分後、倒立顕微鏡で細胞を4倍で観察します。ほとんどの細胞がプレートから剥離し始めます。まだ一部の細胞が付着している場合は、プレートを側面から軽くたたいてください。
   5. 3 mL/well DPBSをCa⁺⁺ およびMg⁺⁺ (+10 μMのRI)で添加して、細胞剥離溶液を希釈します。5mLのピペットを使用して、2〜3回穏やかにピペッティングを行い、泡が塊を壊さないようにします。
   6. 50 mLの遠心分離チューブに40 μMのストレーナを通します。
   7. 室温で200 x gで5分間遠心分離します。VASを使用してメディアをやさしく吸引します。
   8. DDM + B27中の細胞をビタミンA(+10μMのRI)で再懸濁します。
   9. トリパンブルーと血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。
   10. 50,000細胞/ウェルを、48ウェルプレートの適格なマトリックスコーティングプレート(1x)に播種します。
6. DIV 33:培地を神経分化培地に変更します( 材料の表を参照)。媒体は5日ごとに交換します。DIV 85/90までメディアの補充を続けます。

3. 免疫細胞化学(ICC)

注:細胞を覆い、洗浄段階での吸引中にウェルが乾燥するのを防ぐのに十分なバッファーをすべての段階で追加します。

1. 分化した細胞プレートを細胞培養領域の外側に取り出します。
2. メディアを吸引し、DPBS洗浄を行います。
3. 固定するには、4%パラホルムアルデヒド(PFA)1 mLを細胞に加えます。プレートをアルミホイルで覆い、ロッカーシェーカーに37°Cで30分間置きます。
4. PFAを吸引し、DPBS(Ca⁺⁺ およびMg⁺⁺なし)で15分間ごとに3回洗浄します。
5. ブロッキングバッファー(3% BSA + 5% Donkey Serum(または二次抗体の宿主動物由来の血清)+ 0.2% Triton-X in DPBS)を室温で1時間添加します。
6. 一次抗体[Ki67(1:100希釈)、TUBB3(1:500希釈)、PAX6(1:100)]を250 μL/ウェル添加し、ロッカーシェーカーで4°Cで一晩インキュベートします。希釈はブロッキング溶液中で行いました。
7. 一次抗体のインキュベーション後、DPBSで3回洗浄します。
8. 二次抗体(1:250を3% BSA + 0.2% Triton-X溶液DPBSで希釈)を250 μL/ウェルで室温で1時間加えます。
9. 二次抗体インキュベーション後、DPBSで3回洗浄します。
10. DAPI(DPBS中の5 mg/mLストックの1:1000希釈)を室温で15分間加えます。DPBSで3回洗浄します。最後の洗浄を培養プレートに残し、顕微鏡で観察します。

4. 画像の取得と解析

1. 蛍光顕微鏡を使用して20倍の解像度で画像をキャプチャします。
2. Ki67の画像、540 nmの励起フィルターを使用したTUBB3染色画像、488 nmの励起フィルターを使用したPAX6、358 nmの励起フィルターを使用したDAPI画像の撮影が可能です。
3. 分析のために10の異なるランダムフィールドから画像をキャプチャします。
4. ImageJソフトウェアを使用してICC画像を解析します。
5. TUBB3 解析と PAX6 解析では、赤信号と緑の信号、および DAPI の青信号強度について、すべてのイメージのしきい値処理を実行します。TUBB3 の赤ピクセルと PAX6 の緑ピクセルの平均強度は、DAPI の青ピクセルの平均強度で正規化されました。
6. Ki67解析では、ImageJソフトウェアの自動セルカウンター機能を使用して細胞をカウントします。Ki67陽性セルの数をDAPI陽性セルの数で正規化します。
7. 統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用して、対応のない t検定を使用して2つのグループを比較することにより、統計分析を実行します。データは、3つの独立した実験からの平均±SEMとして表されるべきです。0.05未満の p値は、統計的に有意であると見なされます。

特異化したヒトiPS細胞を、シングルセル懸濁液として適格なマトリックスコーティング皿に播種し、bFGFを除去することで分化を開始しました。非外胚葉分化を阻害するために、BMPシグナル伝達阻害剤であるドルソモルフィンをDIV 2-18²¹から添加した。神経原性段階から前駆細胞をさらに分化させるために、単一細胞懸濁液を適格なマトリックス(図1)上に低密度で再播種し、さらに6〜10週間、早期の神経分化を観察しました。神経分化段階(ステージ2)の後、85日目の分析では、DS培養におけるTUBB3+ニューロンの有意な減少が、同質正倍数体細胞を持つニューロンと比較して明らかになりました(図2A)。定量では、DS培養におけるTUBB3+ニューロンの約2倍の減少が示されました(図2B)。このことは、DS細胞が神経細胞の分化が減少していることを示しており、これはDS胎児の脳切片からの観察と一致しており、この研究で使用された in vitro DS神経新生モデルの信頼性を実証しています。

DSにおけるニューロン数の減少の根本的な原因を調べるために、Ki67免疫染色を用いて、神経新生の神経原性段階における細胞周期を解析しました。この段階の初期段階では、同質正倍数体細胞の大部分はKi67+であり、活発な細胞増殖を示しています。対照的に、DS細胞のうちKi67+の割合は有意に低かった(図2C)。定量分析により、DSのKi67+細胞は約4倍に減少したことが明らかになり(図2D)、DS細胞は主に神経原性の初期段階でG0期に留まっていたことが示唆されています。神経原性段階の後期におけるさらなる分析により、Ki67染色の欠如によって証明されるように、ほとんどの同質正倍数体細胞が細胞周期から退出していたことが明らかになった(図2E)。逆に、DS細胞の大部分はKi67+のままであり(図2F)、サイクリング前駆細胞の持続性を示しています。定量的データでは、DSのKi67+細胞は、同質正倍数体細胞と比較して約5倍に増加することが示されました。最初の DS ペアと同正倍数体 iPSC のペアから得られたこれらの知見は、2 番目のペアの DS と同正倍数体 iPSC を使用して検証されました。2番目のペアは、同質正倍数体細胞と比較して、DS細胞で85日目に神経新生の減少も示しました(図2G)。定量解析では、神経分化の終了時にTUBB3+ニューロンが2倍に減少することが示されました(図2H)。さらに、DSでは、同じステージの同質正倍数体細胞と比較して、PAX6+神経前駆細胞が2倍以上増加しました(図2G および 図2I)。これらの知見により、DS神経前駆細胞が細胞周期を抜け出せず、有糸分裂後ニューロンに分化できなかったことが確認され、二相性細胞周期の欠損と一致しました。

この研究は、2組のDS hiPSCとそれらに対応する同質の正倍数体を用いて実施され、DSで観察される神経新生の障害は、神経前駆細胞発生の神経原性段階における二相性細胞周期の調節不全に由来することを示しています。神経誘導中、DS細胞は、対照細胞と比較して、初期段階での増殖の減少を示し、その後、後期段階での増殖の増加を示しました。初期段階での増殖の減少は神経前駆細胞プールのサイズを制限し、後期期の増殖の増加はDSでの有糸分裂後ニューロンの形成を遅らせます。

図1:ダウン症(DS)ヒトiPS細胞の神経新生の図解。 図は、ニューロン新生が神経原性段階と神経分化段階の2つの段階に分けられることを示しています。多能性幹細胞が神経前駆細胞期に分化することを神経原性期と呼び、神経前駆細胞が神経系譜細胞に分化することを神経分化期と呼びます。この図は、このプロトコルで観察される各ステージのタイムラインを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:二相性細胞周期の欠損は、ダウン症候群(DS)の神経新生障害に寄与する。 (A)代表的なTUBB3(赤)画像、DAPI画像、および85日目のDSと同正な正倍体hiPSCの最初のペアからの対応するオーバーレイ。(B)免疫細胞化学(ICC) による DAPI染色に正規化されたTUBB3発現の定量。(C)ステージ1の初期段階(DIV 18)におけるKi67(赤)の代表的な画像と、DSおよび同正な倍数系iPS細胞の最初のペアからの対応するDAPI画像とそのオーバーレイ。(D)初期段階でのKi67発現の定量化。(E)ステージ1の後期(DIV 28)におけるKi67の代表的な画像、および対応するDAPI画像と、DSおよび同正な倍数体hiPSCの最初のペアからのそれらのオーバーレイ。(F)後期期のKi67発現の定量化。(G)DSおよび同正倍数系hiPSCの2番目のペアからのTUBB3(赤)、PAX6(緑)、およびDAPIの代表的な画像。(H)85日目のTUBB3発現の定量化。(I)85日目のPAX6発現の定量化。グループ間の比較は、対応のない t検定を用いて行った。データは、3つの独立した実験からの平均±SEMとして表され、統計的有意性は p < 0.05と定義されます。スケールバーは100μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

この研究では、Euploid hiPSCsとDS hiPSCsの同遺伝子ペアに対する効率的な非指向性単層皮質神経分化プロトコルについて説明します。細胞は単層として増殖するため、培養条件によりさらされやすく、これは、他のプロトコル^14,16で一般的に使用されるiPS細胞の分化に胚様体を使用するのと同じ程度には不可能です。オルガノイドシステムの有用性が増大する一方で、単層ベースの神経分化システムは、細胞に均質な分化環境を提供するという利点を持っています。オルガノイドベースのシステムでは、その3次元的な性質により、局所的なパターニング中心のような活性が形成される可能性があります。さらに、オルガノイド内のすべての細胞は、外因的に添加された成長因子に平等にアクセスできるわけではなく、オルガノイドの中心での細胞死から明らかなように、制御不能なモルフォゲン勾配につながります。オルガノイド法にはいくつかの改良が提案されていますが、ヒトサンプルで観察された表現型を再現する能力によってオルガノイド法を検証する必要があります。前述のように、以前のいくつかのプロトコルでは、DS障害の神経新生を再現できませんでした。したがって、単分子膜ベースの方法が好まれ、神経分化中の培養条件をより制御することができました。ニューロ分化の方法は常に進化しています。一部の方法はより速い神経分化²²を提供するが、他の方法はより生理学的に関連性のある分化タイミング^{を提供する23}。さらに、DAPT、cAMP、アスコルビン酸などの非生理学的化合物の使用、またはGDNFやBDNFなどの成長因子の非生理学的濃度は、神経分化に使用する前にユーザーが評価する必要があります。外因的に添加された化合物または成長因子は、疾患細胞の内因性特性を覆い隠し、皿内の生体内条件の模倣を防ぐ可能性があります。

ニューロ分化の成功率は、分化のための播種前のiPS細胞の品質に依存します。分化したコロニーは10%未満である必要があります。実験手順の重要なステップの1つは、iPS細胞を5000〜10,000細胞/cm 2の低密度で播種し^、 細胞の背部化を達成するために、ドルソモルフィンを0.125μMの低濃度で約16日間添加することです。細胞死を減らすために、ドルソモルフィンの代わりにノギンを添加することもできるが、ノギンに関連する高コストを低減するためにドルソモルフィンが使用された。高密度で細胞をプレーティングすると、神経分化が減少し、中脳および後脳の神経集団も促進される可能性があります²⁴。iPS細胞によって増殖速度が異なるため、新しいiPS細胞株ごとに初期めっき密度を試験する必要があります。さらに、多能性幹細胞が広範な増殖を示す場合、細胞は20日目頃に分裂する可能性があります。このプロトコルは、DSニューロン新生に対する21番染色体遺伝子の影響を研究するのに役立ち、薬物スクリーニングに使用できます。

このプロトコルの主な制限は、ニューロンに分化するための最大85〜90日間の長い期間です。さらに、追加の hiPSC 株の神経分化中には、初期段階、後期段階、および末期のタイムラインが異なる可能性があることが観察されましたが、DS 神経分化中にも二相性細胞周期の欠陥が観察される可能性があります。異なるiPS細胞で観察される違いは、リプログラミングプロセスの確率的性質によるhiPS細胞の固有の違い、または通過数の違いによるものである可能性があります。

著者には、開示すべき利益相反はありません。

著者らは、ダウン症と同質正倍数系のiPSCを提供してくださったStuart H. Orkin教授に感謝します。また、著者らは、この研究を実施するための資金を提供してくれたプネーの国立細胞科学センター(BRIC-NCCS)にも感謝しています。