In vitro Modelagem da Neurogênese da Síndrome de Down Usando Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Este protocolo descreve uma metodologia para recapitular a neurogênese prejudicada pela síndrome de Down (SD) usando iPSCs humanas com SD. O protocolo identificou o defeito do ciclo celular bifásico como a causa da neurogênese prejudicada na síndrome de Down. Ele fornece uma plataforma robusta para a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes à neurogênese anormal associada à SD.

A síndrome de Down (SD), causada por uma cópia extra do cromossomo 21, é uma das principais causas de deficiência intelectual. Um dos principais fatores que contribuem para essa deficiência intelectual é a neurogênese prejudicada observada a partir dos estágios fetais. Para estudar essas anormalidades do neurodesenvolvimento, as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) geradas usando células obtidas de pacientes com SD fornecem um modelo valioso e relevante. Aqui, um protocolo abrangente é descrito para recapitular a neurogênese prejudicada pela SD observada durante os estágios fetais da SD. Este protocolo utiliza um par de DS-hiPSCs com três cópias do cromossomo 21 e seus hiPSCs euplóides isogênicos com duas cópias do cromossomo 21. É importante ressaltar que o protocolo descrito aqui recapitula a neurogênese prejudicada pela SD e descobriu que o defeito do ciclo celular bifásico, ou seja, a proliferação reduzida de células progenitoras neurais (NPC) da SD durante a fase inicial do estágio neurogênico, seguida pelo aumento da proliferação de NPC da SD durante a fase tardia do estágio neurogênico, é a causa da neurogênese prejudicada pela SD. O aumento da proliferação de NPC de DS durante a fase tardia do estágio neurogênico leva a uma saída retardada do ciclo celular, causando redução da geração de neurônios pós-mitóticos de NPCs de DS. Este protocolo inclui etapas detalhadas para a manutenção de hiPSCs, sua diferenciação em linhagens neurais exibindo defeito do ciclo celular bifásico durante o estágio neurogênico e a subsequente validação da diferenciação neural reduzida em células DS. Seguindo essa metodologia, os pesquisadores podem criar um sistema experimental robusto que imita as condições de neurodesenvolvimento da SD, permitindo-lhes explorar as alterações específicas no desenvolvimento do cérebro causadas pela trissomia do cromossomo 21.

A síndrome de Down (SD), ou trissomia do cromossomo 21, é a anormalidade cromossômica mais comum e a principal causa de deficiência intelectual (DI)¹. A neurogênese prejudicada durante o desenvolvimento fetal da SD é uma das causas de deficiência intelectual na SD². Estudos fetais com SD humana mostram redução do peso e volume do cérebro, redução de neurônios, aumento de astrócitos ^3,4 e distribuição anormal de neurônios nas camadas II e IV ^5,6. Além disso, a segunda fase do desenvolvimento cortical, ou seja, o surgimento da laminação, é atrasada e desorganizada no DS⁷.

Os defeitos de neurodesenvolvimento na SD têm sido estudados principalmente usando modelos de camundongos com SD, como Ts65Dn, Ts1Rhr e Ts1cje⁸. No entanto, esses modelos de camundongos não foram capazes de recapitular completamente vários fenótipos observados em estudos de SD devido a diferenças fisiológicas e de desenvolvimento entre camundongos e humanos^9, o que levou a ensaios clínicos fracassados¹⁰. A invenção das células-tronco pluripotentes induzidas^11,12 proporcionou uma oportunidade de modelar o comprometimento neurológico da síndrome de Down usando células derivadas diretamente de indivíduos com SD. No entanto, tentativas anteriores de modelar defeitos de neurodesenvolvimento de SD usando iPSCs humanas encontraram resultados inconsistentes e não conseguiram explicar completamente os defeitos de neurodesenvolvimento observados em seções cerebrais fetais de SD 13,14,15,16. Por exemplo, um relatório publicado por Shi et al. encontrou fenótipos de Alzheimer relacionados à SD, mas não relatou diferença na neurogênese da SD em comparação com controles euploides¹⁵. Da mesma forma, Weick et al. relataram atividade sináptica reduzida, mas neurogênese normal na SD em comparação com controles euploides¹⁶. No entanto, a neurogênese normal na SD relatada nessas publicações não foi consistente com a observação de seções cerebrais fetais da SD. Mais tarde, um relatório de Hibaoui et al. relatou neurogênese reduzida na SD, o que foi consistente com a observação da seção¹⁴ do cérebro fetal da SD. No entanto, este relatório e outro relatório recente descreveram a proliferação reduzida de NPCs de SD como a causa da neurogênese reduzida na SD ^14,17. No entanto, apenas a proliferação reduzida de NPCs de SD não poderia explicar o aumento das células astrogliais e o atraso no surgimento da laminação durante o desenvolvimento do cérebro fetal da SD.

Em um trabalho publicado recentemente, foi desenvolvido um modelo de neurogênese com deficiência de DS baseado em iPSC humano mostrando neurogênese reduzida. Este modelo descobriu que a neurogênese prejudicada na SD é devido a defeitos do ciclo celular bifásico durante o estágio neurogênico (o estágio durante o qual as células progenitoras neurais são geradas a partir de células-tronco pluripotentes). Durante a primeira fase do estágio neurogênico, os NPCs de SD exibem proliferação reduzida em comparação com células neurais euplóides isogênicas, seguida por aumento da proliferação de NPCs de DS em comparação com células euplóides isogênicas na fase final do estágio neurogênico¹⁸.

Neste manuscrito, foi descrito um protocolo detalhado passo a passo para a diferenciação de hiPSCs da síndrome de Down e suas hiPSCs euplóides isogênicas em neurônios corticais. O objetivo geral deste método é fornecer um protocolo detalhado e passo a passo para diferenciar um par de hiPSCs de DS e seus hiPSCs euplóides isogênicos em neurônios corticais com foco na modelagem dos defeitos de neurogênese associados à SD. Este protocolo foi projetado para oferecer um sistema robusto e reprodutível para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes às anormalidades que causam a neurogênese prejudicada pela SD.

A lógica por trás do desenvolvimento deste protocolo é permitir a diferenciação de células-tronco pluripotentes em neurônios corticais, utilizando princípios da neurobiologia do desenvolvimento, permitindo assim a identificação de fenótipos que surgem devido a doenças / distúrbios. O objetivo era adotar uma abordagem minimalista para a diferenciação neural de iPSCs, evitando compostos como cAMP ou DAPT, que podem mascarar fenótipos de doenças decorrentes de defeitos no canal Ca⁺⁺ ou na via NOTCH, respectivamente. Da mesma forma, o uso de ácido ascórbico, BDNF e GDNF também foi evitado, o que pode mascarar outros fenótipos relacionados a doenças neurológicas, potencializando a neurogênese.

As vantagens dessa técnica sobre os métodos alternativos residem em fornecer uma recapitulação robusta dos fenótipos neurológicos observados em seções cerebrais fetais de SD. É importante notar que, em comparação com os modelos de camundongos, o sistema baseado em iPSC humano elimina as diferenças entre espécies, fornecendo um modelo mais relevante para o estudo de processos de neurodesenvolvimento específicos de humanos⁹ , mas até agora não conseguiu recapitular a neurogênese prejudicada pela SD observada nos estágios fetais da SD em diante. Além disso, o uso de pares isogênicos de hiPSCs reduz a variabilidade e aumenta a confiabilidade das diferenças fenotípicas observadas. Este protocolo será de particular interesse para pesquisadores que estudam distúrbios do neurodesenvolvimento e neurogênese humana. É especialmente relevante para aqueles que buscam modelar aspectos específicos humanos da SD ou para aqueles interessados em desenvolver intervenções terapêuticas direcionadas aos defeitos da neurogênese associados à trissomia do cromossomo 21.

O protocolo a seguir foi seguido com dois pares de síndrome de Down e suas iPSCs humanas euplóides isogênicas. Um par foi gerado usando o método de entrega mediada por retroviral de reprogramação^19, e um segundo par (NSi003-A e NSi003-B) foi gerado usando o método de entrega do vírus Sendai não integrador²⁰. O protocolo consiste amplamente em dois estágios: o estágio neurogênico (Estágio 1) e o estágio de diferenciação neural (Estágio 2). Além disso, duas fases baseadas nas diferenças na proliferação da síndrome de Down e linhagens celulares euplóides isogênicas, ou seja, as fases inicial e tardia, são observadas no estágio neurogênico. Os detalhes dos reagentes, meios e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. HiPSCs com síndrome de Down e cultura e manutenção de hiPSCs euplóides isogênicos

1. Revestimento de alimentador para hiPSCs
   NOTA: A qualidade e a densidade do alimentador são extremamente importantes para a boa qualidade da cultura de iPSCs humanas.
   1. Adicione 2 mL de gelatina a 0,1% para revestir uma placa de 6 poços por pelo menos 1-2 h a 37 ° C antes de semear com células alimentadoras.
   2. Mantenha a placa revestida de gelatina à temperatura ambiente na capa de cultura de células por pelo menos 30 minutos antes de plaquear as células.
   3. Meio quente de fibroblastos embrionários de camundongo (MEF) para ser usado para revitalização em banho-maria/banho de esferas.
   4. Alíquota de 5 mL de meio MEF em um tubo de centrífuga de 15 mL.
   5. Retire um frasco de células alimentadoras do tanque de nitrogênio líquido (tanque LN2).
      NOTA: As células alimentadoras foram derivadas do tratamento de fibroblastos embrionários de camundongos E13.5 com 10 μg / mL de mitomicina C por 3 h, seguido de 2-3 vezes de lavagem com DPBS¹⁸. As células alimentadoras podem ser usadas diretamente ou congeladas em um tanque LN2 para uso futuro. Todos os camundongos foram utilizados após aprovação do Comitê Institucional de Ética Animal.
   6. Manter o frasco para injetáveis a 37 °C em banho-maria utilizando um suporte flutuante até restar um pequeno pedaço de gelo.
   7. Leve o frasco para dentro do gabinete de biossegurança e esterilize-o com álcool antes de colocá-lo dentro do gabinete de biossegurança.
   8. Adicione 1 mL de meio MEF quente (consulte a Tabela de Materiais) gota a gota.
   9. Retire o meio do frasco com cuidado e despeje gota a gota em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo meio MEF.
   10. Centrifugue em temperatura ambiente por 5 min a 200 x g.
   11. Aspirar o sobrenadante utilizando um sistema de aspiração intrauterina (EVA).
   12. Adicione 1 mL de meio MEF e pipete suavemente para cima e para baixo 3-4 vezes.
   13. Faça a contagem de células usando um hemocitômetro. As células mortas foram excluídas usando Trypan Blue.
   14. Placa 3,1-3,3 x 10⁵ células alimentadoras vivas por poço de uma placa de 6 poços ou 2 x 10⁶ células por placa de 6 poços em meio MEF.
   15. Mantenha a placa dentro da incubadora de CO₂ a 37 °C com 85% de umidade durante a noite. Agite a placa dentro da incubadora de CO₂ para frente, para trás e para os lados 2-3 vezes para obter uma distribuição homogênea das células alimentadoras.
2. Renascimento de hiPSCs com síndrome de Down e hiPSCs euplóides isogênicos
   NOTA: Aqueça o volume necessário de mídia hiPSC em um banho de esferas a 37 °C.
   Meio de renascimento de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC): Adicione recentemente 25 ng/mL de Fator de Crescimento Básico de Fibroblastos (bFGF) e 10 μM de inibidor de rocha (RI) (Y-27632 2HCl) em meio hiPSC.
   1. Remova bem o meio MEF dos alimentadores e lave os alimentadores adicionando suavemente 1 mL/poço de DMEM/F12 quente das laterais do poço. Aspire o meio e adicione 2 mL / meio de renascimento hiPSC quente bem. Deixe a placa dentro da incubadora por pelo menos 2 h antes de plaquear os hiPSCs.
   2. Retire um frasco de hiPSCs.
   3. Manter o frasco para injetáveis numa grelha flutuante num banho-maria a 37 °C até restar um pequeno pedaço de gelo.
   4. Antes de levar o frasco para dentro do gabinete de biossegurança, esterilize-o com álcool 70%.
   5. Adicione 1 mL de meio de renascimento hiPSC quente.
   6. Retire o meio do frasco com cuidado e despeje gota a gota em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5 mL de meios de renascimento hiPSCs.
   7. Centrifugue em temperatura ambiente por 2 min a 100 x g.
   8. Aspirar o sobrenadante com EVA e desalojar o sedimento batendo suavemente no tubo.
   9. Despeje 500 μL de meio hiPSC com 10 μM de RI e despeje sobre a placa de alimentação contendo o meio de renascimento hiPSC. Rotule a placa com o nome da célula, número da passagem, nome do pesquisador e data.
   10. Observe as colônias de hiPSC sob um microscópio invertido com ampliação de 4x; deve haver aglomerados de células.
   11. Enquanto mantém a placa dentro da incubadora de CO₂ , agite a placa para frente e para trás e para os lados 2-3 vezes para obter uma distribuição homogênea das células. Não mexa na placa por 24 h.
   12. No dia seguinte, algumas colônias podem parecer aderidas a alimentadores e outras estariam flutuando. Sem aspirar nenhum meio, adicione meio hiPSCs fresco suplementado com 25 ng/mL de bFGF e 10 μM de RI.
   13. No segundo dia após o renascimento, a maioria das colônias estaria presa à superfície. Troque o meio completo por meio hiPSC com 25 ng/mL bFGF. Nos dias seguintes, as colônias de hiPSC serão visíveis.
       NOTA: Leva pelo menos uma semana para os hiPSCs reviverem e formarem colônias com bordas lisas e bem definidas, morfologia celular uniforme e um centro de colônia denso.
3. HiPSCs da síndrome de Down de passagem e hiPSCs euplóides isogênicos em alimentadores
   NOTA: Todos os reagentes devem estar quentes antes de começar. Evite a pipetagem excessiva das células. Manuseie as células com muito cuidado.
   1. HiPSCs de passagem quando a maioria das colônias começa a se fundir umas com as outras ou quando há o surgimento de muitas colônias diferenciadas. Geralmente, a divisão precisa ser realizada dentro de 5 a 7 dias após a primeira passagem.
   2. Reviva um frasco de comedouros um dia antes de partir.
   3. Dê uma lavagem aos alimentadores com 1 mL / poço de DMEM / F12 quente e adicione 2 mL / poço de meio hiPSCs quente suplementado com 25 ng / mL de bFGF. Deixe a placa dentro da incubadora de CO₂ a 37 °C por pelo menos 2 h antes de plaquear hiPSCs.
   4. Observe a placa com hiPSCs para colônias diferenciadas e remova a colônia diferenciada por raspagem usando uma pipeta de 200 μL sob um estereomicroscópio.
   5. Dê uma lavagem aos hiPSCs com 1 mL / bem quente DMEM / F12.
   6. Despeje 1 mL / poço de solução de colagenase de 1 mg / ml. Mantenha a placa dentro da incubadora por 8 a 10 minutos e, em seguida, observe ao microscópio invertido as bordas soltas das colônias.
   7. Aspire a colagenase e dê 2 lavagens de DMEM/F12. Em seguida, adicione 1 mL / poço de meio hiPSC.
   8. Corte delicadamente as colônias horizontal e verticalmente 8 a 10 vezes em um poço usando a ponta de uma seringa de 2 mL. Observe as colônias sob um microscópio invertido para verificar se a maioria das colônias foi cortada no tamanho apropriado.
   9. Se as colônias forem cortadas o suficiente, levante-as suavemente usando um levantador de células.
   10. Pipete suavemente as colônias no poço usando uma ponta de 1 mL, 5-8 vezes, dependendo do tamanho das colônias.
   11. Recolher todas as células num tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar à temperatura ambiente durante 2 min a 100 x g.
   12. Aspire o sobrenadante suavemente usando uma pipeta, desaloje o pellet celular batendo suavemente no tubo e adicione 200 μL de meio hiPSC com 25 ng/mL de bFGF e 10 μM de RI. Pipete 2-3 vezes com a pipeta de 200 μL e adicione 300 μL a mais de meio hiPSC com 25 ng/mL de bFGF e 10 μM de IR.
   13. Agora, coloque suavemente essas células sobre os alimentadores contendo meio hiPSC + 25 ng/mL de bFGF. Um poço pode ser dividido em 1:2 ou 1:3, dependendo do número de colônias presentes após a remoção de colônias diferenciadas. Rotule a placa com o nome da célula, número da passagem, nome do pesquisador e data.
   14. Enquanto mantém a placa dentro da incubadora de CO₂ , agite a placa para frente e para trás e para os lados 2-3 vezes para obter uma distribuição homogênea das células.
   15. No dia seguinte, lave suavemente com DMEM/F12 quente e adicione 2,5 mL de meio hiPSC com 25 ng/mL de bFGF.
4. HiPSCs da síndrome de Down congelante e hiPSCs euplóides isogênicos de comedouros
   NOTA: A pipetagem excessiva de iPSCs humanas deve ser evitada durante o procedimento de congelamento.
   1. Divida os hiPSCs quando ainda estão em sua fase logarítmica, ou seja, 4-5 dias após a passagem.
   2. Observar a placa com hiPSCs para colónias diferenciadas e remover as colónias diferenciadas utilizando uma pipeta de 200 μL sob um estereomicroscópio.
   3. Dê uma lavagem aos hiPSCs com 1 mL / bem quente DMEM / F12.
   4. Adicione 1 mL / poço de solução de colagenase de 1 mg / mL. Mantenha a placa dentro da incubadora por 8 a 10 minutos e, em seguida, observe sob um microscópio invertido para levantar as bordas das colônias.
   5. Aspire a colagenase e dê 2 lavagens de DMEM/F12. Em seguida, adicione 1 mL / poço de meio hiPSC.
   6. Levante suavemente as colônias usando um elevador de células.
   7. Pipete suavemente as colônias no poço usando uma ponta de 1 mL 5-8 vezes, dependendo do tamanho das colônias.
   8. Recolher todas as células num tubo de centrifugação de 15 ml e centrifugar à temperatura ambiente durante 2 min a 100 x g.
   9. Aspire o sobrenadante suavemente usando uma pipeta, desaloje o pellet celular batendo suavemente no tubo e adicione 1 mL de meio hiPSC sem antibiótico suplementado com 25 ng/mL de bFGF de acordo com o número de poços. Dispense células em criogeniais.
   10. Adicione o meio hiPSC sem antibiótico suplementado com 25 ng/mL de bFGF e 20% de DMSO nos criogenianos para atingir uma concentração final de 10% de DMSO.
   11. Coloque os criotubos em um banho gelado com isopropanol para fornecer congelamento lento.
   12. Mantenha o gelo a -80 °C durante a noite. Transfira os frascos no dia seguinte para o tanque LN2.

2. Diferenciação neuronal

NOTA: Preparação do meio condicionado pelo alimentador (FCM): Use um frasco T-75 e uma placa 4 x 10⁶ células alimentadoras por frasco. No dia seguinte, adicione 40 mL de meio hiPSC com 4 ng/mL de bFGF. Colete por 7 dias. Armazene cada tubo diário a -20 °C por até 1 mês. Cubra uma placa de 15 cm com 10 mL de gelatina a 0,1% a 37 ° C por pelo menos 2 h antes de dissociar as células. Cubra uma placa de 6 poços com matriz de membrana basal qualificada para hESC (doravante chamada de "matriz qualificada") 1 dia antes de dissociar as células. Ao dissociar células em todo o protocolo, adicione 10 μM de RI à solução de descolamento de células (consulte a Tabela de Materiais), DPBS e meios de plaqueamento (FCM suplementado com 25 ng/mL de bFGF). Prepare um meio fresco condicionado pelo alimentador (FCM) para cada diferenciação. Evite a pipetagem excessiva de hiPSCs.

1. Dia In vitro (DIV) 2: Fabricação de células únicas e semeadura de hiPSCs para neurodiferenciação
   1. Adicione 10 μM de RI ao meio hiPSC suplementado com 25 ng/mL de bFGF, DPBS, solução de descolamento celular e meio condicionado de alimentador suplementado com 25 ng/mL de bFGF. Aquecer todos estes reagentes a 37 °C.
   2. Pegue uma placa de 6 poços de iPSCs nos alimentadores, remova as colônias diferenciadas e adicione meio hiPSC fresco suplementado com 25ng/mL de bFGF e 10 μM de RI. Mantenha a placa por 2 h na incubadora.
   3. Retire a placa de iPSCs após 2 h e lave uma com DPBS sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺.
   4. Adicione 1 mL / solução de descolamento de células de poço (+ 10 μM de RI) e mantenha a placa dentro da incubadora de CO₂ por 12-14 min.
   5. Após 12-14 min, observe as células sob um microscópio invertido; A maioria das células começa a se desprender da placa. Se algumas células ainda aderirem, bata suavemente na placa pelas laterais.
   6. Dilua a solução de descolamento celular adicionando 3 mL/poço de DPBS com Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺ (+ 10 μM de RI). Usando uma pipeta de 5 mL, faça uma pipetagem suave de 2 a 3 vezes, evitando bolhas para quebrar grumos.
   7. Passe as células por um filtro de 40 μM.
   8. Colete as células em um tubo de centrífuga de 50 mL.
   9. Centrifugue em temperatura ambiente por 5 min a 200 x g e aspire o meio suavemente usando VAS.
   10. Ressuspenda as células em 10 mL de meio hiPSC (+ 25 ng/mL de bFGF + 10 μM de RI). Adicione as células a um prato de 15 cm revestido com gelatina a 0,1% por 1,5 h para remover os comedouros, pois os alimentadores têm adesão preferencial à superfície revestida de gelatina em comparação com os hiPSCs.
   11. Após 1,5 h, colete suavemente o meio com células e centrifugue em temperatura ambiente por 5 min a 200 x g. Aspirar meios usando VAS.
   12. Ressuspenda as células em 1 mL de FCM (+ 25 ng/mL de bFGF + 10 μM de RI) e faça a contagem de células.
   13. Usando FCM (+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM de RI), faça uma suspensão celular de 30.000-50.000 células/mL e semeie 5 mL de suspensão celular/placa de 60 mm ou 2 mL/poço de placa de 6 poços ou 500 μL/poço de placa de 24 poços. As placas devem ser revestidas com uma matriz qualificada (consulte a Tabela de Materiais).
2. DIV 0: (~48 h depois): Troque o meio condicionado pelo alimentador para meio NPC (DDM + B27 sem vitamina A + N2) (consulte a Tabela de Materiais).
3. DIV 2: Adicione meio NPC com 0,125 μM de Dorsomorfina a cada dia alternado até DIV 18.
4. DIV 18: Adicione mídia NPC sem Dorsomorphin e reabasteça a cada dia alternado até DIV 28.
5. DIV 28-30: Fazendo células únicas e semeadura de NPCs para o Estágio 2
   1. No DIV 28, retire a placa (contendo NPCs) e substitua a mídia por mídia NPC (+ 10 μM de RI). Coloque a placa na incubadora de CO₂ por 2 h.
   2. Após 2 h, aspirar o meio e dar uma lavagem com DPBS (sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺).
   3. Adicione 1 mL/solução de descolamento de células de poço (+ 10 μM de IR) e mantenha a placa dentro da incubadora por 14 min.
   4. Após 14 min, observe as células ao microscópio invertido a 4x. A maioria das células começa a se desprender da placa. Se algumas células ainda aderirem, bata suavemente na placa pelas laterais.
   5. Diluir a solução de descolamento celular adicionando 3 mL/poço de DPBS com Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺ (+ 10 μM de IR). Usando uma pipeta de 5 mL, faça uma pipetagem suave de 2 a 3 vezes, evitando bolhas para quebrar grumos.
   6. Passe por um filtro de 40 μM colocado em um tubo de centrífuga de 50 mL.
   7. Centrifugue em temperatura ambiente por 5 min a 200 x g. Aspire o meio suavemente usando VAS.
   8. Ressuspenda as células em DDM + B27 com vitamina A (+ 10 μM de IR).
   9. Conte as células vivas usando azul de tripano com um hemocitômetro.
   10. Semeie 50.000 células/poço em uma placa revestida com matriz qualificada (1x) da placa de 48 poços.
6. DIV 33: Alterar meio para meio de diferenciação neural (consulte a Tabela de Materiais). Troque o meio a cada 5 dias. Continue reabastecendo a mídia até DIV 85/90.

3. Imunocitoquímica (ICC)

NOTA: Adicione tampão suficiente em todos os estágios para cobrir as células e evitar a secagem do poço durante a aspiração durante a fase de lavagem.

1. Retire a placa celular diferenciada fora da área de cultura celular.
2. Aspire a mídia e lave o DPBS.
3. Para fixação, adicione 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) às células. Cubra a placa com papel alumínio e coloque-a em um agitador a 37 °C por 30 min.
4. Aspire PFA e dê três lavagens cada de 15 min com DPBS (sem Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺).
5. Adicione tampão de bloqueio (3% de BSA + 5% de soro de burro (ou soro do animal hospedeiro do anticorpo secundário) + 0,2% de Triton-X em DPBS) por 1 h em temperatura ambiente.
6. Adicionar 250 μL/alvéolo de anticorpos primários [Ki67 (diluição 1:100), TUBB3 (diluição 1:500), PAX6 (1:100)] e incubar durante a noite a 4 °C num agitador basculante. A diluição foi feita em uma solução de bloqueio.
7. Lave três vezes com DPBS após a incubação primária de anticorpos.
8. Adicione 250 μL / poço de anticorpo secundário (diluído 1: 250 em 3% BSA + 0,2% Triton-X em DPBS) por 1 h em temperatura ambiente.
9. Lave 3 vezes com DPBS após incubação secundária de anticorpos.
10. Adicione DAPI (diluição 1: 1000 de 5 mg / mL em DPBS) por 15 min à temperatura ambiente. Lave três vezes com DPBS. Deixe a última lavagem na placa de cultura e observe ao microscópio.

4. Aquisição e análise de imagens

1. Capture imagens usando o microscópio de fluorescência com resolução de 20x.
2. Capture imagens de Ki67, bem como imagens de coloração TUBB3 usando um filtro de excitação de 540 nm, PAX6 usando um filtro de excitação de 488 nm e imagens DAPI usando um filtro de excitação de 358 nm.
3. Capture imagens de dez campos aleatórios diferentes para análise.
4. Analise imagens ICC usando o software ImageJ.
5. Para análise TUBB3 e PAX6, execute o limite de todas as imagens para os sinais vermelho e verde, respectivamente, e a intensidade do sinal azul para DAPI. A intensidade média dos pixels vermelhos de TUBB3 e pixels verdes de PAX6 foi normalizada com a intensidade média dos pixels azuis de DAPI.
6. Para análise Ki67, conte as células usando o recurso contador de células automatizado no software ImageJ. Normalize o número de células positivas para Ki67 com o número de células positivas para DAPI.
7. Realize análises estatísticas usando estatísticas e software gráfico comparando os dois grupos usando testes t não pareados. Os dados devem ser expressos como média ± SEM de três experimentos independentes. Um valor de p menor que 0,05 é considerado estatisticamente significativo.

As iPSCs humanas singularizadas foram semeadas em placas revestidas com matriz qualificada como suspensões unicelulares, e a diferenciação foi iniciada com a remoção do bFGF. Para inibir a diferenciação não ectodérmica, a dorsomorfina, um inibidor da sinalização BMP, foi adicionada do DIV 2-18²¹. Para maior diferenciação das células progenitoras do estágio neurogênico, as suspensões unicelulares foram replaqueadas em baixa densidade na matriz qualificada (Figura 1) por mais 6 a 10 semanas para observar a diferenciação neural precoce. Após o estágio de diferenciação neural (Estágio 2), a análise no Dia 85 revelou uma redução significativa de neurônios TUBB3+ em culturas de SD em comparação com aquelas com células euplóides isogênicas (Figura 2A). A quantificação mostrou uma diminuição de aproximadamente duas vezes nos neurônios TUBB3+ em culturas de SD (Figura 2B). Isso indica que as células SD exibem diferenciação neuronal reduzida, consistente com observações de seções cerebrais fetais de SD, demonstrando a confiabilidade do modelo de neurogênese SD in vitro usado neste estudo.

Para investigar a causa subjacente do número reduzido de neurônios na SD, a imunocoloração Ki67 foi usada para analisar o ciclo celular durante o estágio neurogênico da neurogênese. Durante a fase inicial deste estágio, a maioria das células euplóides isogênicas eram Ki67+, indicando proliferação celular ativa. Em contraste, uma proporção significativamente menor de células DS era Ki67+ (Figura 2C). A análise quantitativa revelou uma redução de aproximadamente quatro vezes nas células Ki67+ na SD (Figura 2D), sugerindo que as células da SD permaneceram predominantemente na fase G0 durante o estágio neurogênico inicial. Uma análise mais aprofundada durante a fase tardia do estágio neurogênico revelou que a maioria das células euplóides isogênicas havia saído do ciclo celular, como evidenciado pela ausência de coloração Ki67 (Figura 2E). Por outro lado, a maioria das células DS permaneceu Ki67+ (Figura 2F), indicando a persistência de células progenitoras cíclicas. Os dados quantitativos demonstraram um aumento de aproximadamente cinco vezes nas células Ki67+ em DS em comparação com as células euplóides isogênicas. Esses achados do primeiro par de DS e hiPSCs euplóides isogênicos foram validados usando um segundo par de hiPSCs SD e euplóides isogênicos. O segundo par também exibiu neurogênese reduzida no dia 85 em células DS em comparação com células euplóides isogênicas ( Figura 2G ). A análise quantitativa mostrou uma redução de duas vezes nos neurônios TUBB3+ (Figura 2H) na conclusão da diferenciação neural. Além disso, houve um aumento de mais de duas vezes nas células progenitoras neurais PAX6+ na SD em comparação com as células euplóides isogênicas no mesmo estágio (Figura 2G e Figura 2I). Esses achados confirmaram que as células progenitoras neurais da SD não conseguiram sair do ciclo celular e se diferenciar em neurônios pós-mitóticos, consistente com um defeito do ciclo celular bifásico.

Este estudo, conduzido usando dois pares de hiPSCs de SD e suas contrapartes euplóides isogênicas, demonstra que a neurogênese prejudicada observada na SD decorre da desregulação do ciclo celular bifásico no estágio neurogênico do desenvolvimento do progenitor neural. Durante a indução neural, as células DS exibiram proliferação reduzida na fase inicial, seguida por proliferação aumentada durante a fase tardia em comparação com as células controle. A proliferação diminuída durante a fase inicial restringe o tamanho do pool de progenitores neurais, enquanto o aumento da proliferação durante a fase tardia retarda a formação de neurônios pós-mitóticos na SD.

Figura 1: Ilustração da neurogênese de iPSCs humanas com síndrome de Down (SD). As ilustrações mostram que a neurogênese é dividida em dois estágios: o estágio neurogênico e o estágio de diferenciação neural. A diferenciação de células-tronco pluripotentes em direção ao estágio de progenitor neural é chamada de estágio neurogênico, enquanto a diferenciação de progenitores neurais em direção às células da linhagem neural é chamada de estágio de diferenciação neural. A ilustração mostra cronogramas para cada estágio, conforme observado neste protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O defeito do ciclo celular bifásico contribui para a neurogênese da síndrome de Down (DS) prejudicada. (A) Imagens representativas de TUBB3 (vermelho), imagens DAPI e a sobreposição correspondente do primeiro par de DS e hiPSCs euplóides isogênicos no dia 85. (B) Quantificação da expressão de TUBB3 normalizada para coloração DAPI via imunocitoquímica (ICC). (C) Imagens representativas de Ki67 (vermelho) durante a fase inicial (DIV 18) do Estágio 1, com imagens DAPI correspondentes e sua sobreposição do primeiro par de DS e hiPSCs euplóides isogênicos. (D) Quantificação da expressão de Ki67 durante a fase inicial. (E) Imagens representativas de Ki67 durante a fase tardia (DIV 28) do Estágio 1, com imagens DAPI correspondentes e sua sobreposição do primeiro par de DS e hiPSCs euplóides isogênicos. (F) Quantificação da expressão de Ki67 durante a fase tardia. (G) Imagens representativas de TUBB3 (vermelho), PAX6 (verde) e DAPI do segundo par de DS e hiPSCs euplóides isogênicos. (H) Quantificação da expressão de TUBB3 no dia 85. (I) Quantificação da expressão de PAX6 no dia 85. As comparações entre os grupos foram realizadas por meio de testes t não pareados. Os dados são apresentados como média ± EPM de três experimentos independentes, com significância estatística definida como p < 0,05. As barras de escala representam 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Neste trabalho, é descrito um protocolo eficiente de neurodiferenciação cortical monocamada não direcionada para um par isogênico de hiPSCs euplóides e hiPSCs DS. Como as células são cultivadas em monocamadas, elas estão mais expostas às condições de cultivo, o que não é possível na mesma medida que o uso de corpos embrióides para diferenciação de iPSCs, que geralmente são usados em outros protocolos^14,16. Enquanto a utilidade dos sistemas organoides está crescendo, o sistema de diferenciação neural baseado em monocamada tem suas vantagens em fornecer às células um ambiente de diferenciação homogêneo. Em sistemas baseados em organoides, devido à sua natureza tridimensional, pode se formar uma atividade semelhante a um centro de padronização local. Além disso, todas as células nos organoides não têm acesso igual a fatores de crescimento adicionados exogenamente, levando a um gradiente morfogênico descontrolado, conforme evidenciado pela morte celular no centro dos organoides. Embora várias melhorias tenham sido propostas em métodos organoides, há uma necessidade de validar métodos organoides por sua capacidade de recapitular fenótipos observados em amostras humanas. Como mencionado, vários protocolos anteriores falharam em recapitular a neurogênese prejudicada pela SD. Assim, o método baseado em monocamada foi preferido, permitindo condições de cultura mais controladas durante a neurodiferenciação. Os métodos de neurodiferenciação estão em constante evolução. Enquanto alguns métodos fornecem neurodiferenciação mais rápida²², outros fornecem um tempo de diferenciação fisiologicamente mais relevante²³. Além disso, o uso de compostos não fisiológicos, por exemplo, DAPT, cAMP ou ácido ascórbico, ou concentração não fisiológica de fatores de crescimento, como GDNF e BDNF, deve ser avaliado pelos usuários antes de usá-los para neurodiferenciação. Compostos ou fatores de crescimento adicionados exogenamente podem mascarar as propriedades intrínsecas das células doentes e impedir a imitação das condições in vivo em um prato.

A taxa de sucesso da neurodiferenciação depende da qualidade das iPSCs antes da semeadura para diferenciação. Deve haver menos de 10% de colônias diferenciadas. Uma etapa crítica do procedimento experimental é que as iPSCs devem ser semeadas em baixa densidade variando de 5000 a 10.000 células/^{cm2 e,} para atingir a dorsalização das células, a dorsomorfina deve ser adicionada por cerca de 16 dias a uma baixa concentração de 0,125 μM. A morte celular extensa é observada em concentrações mais altas de dorsomorfina quando usadas com células plaqueadas de baixa densidade. Noggin também pode ser adicionado no lugar de Dorsomorphin para reduzir a morte celular, mas Dorsomorphin foi usado para reduzir o alto custo associado ao Noggin. O revestimento de células em alta densidade reduz a diferenciação neural e também pode promover populações neurais do mesencéfalo e do rombencéfalo²⁴. Como diferentes iPSCs podem variar em sua taxa de proliferação, a densidade inicial de plaqueamento deve ser testada para cada nova linha hiPSC. Além disso, se as células-tronco pluripotentes exibirem proliferação extensa, as células podem ser divididas por volta do dia 20. Este protocolo será útil no estudo do efeito dos genes do cromossomo 21 na neurogênese da SD e pode ser usado para triagem de drogas.

A principal limitação deste protocolo é uma longa duração de até 85-90 dias para se diferenciar em neurônios. Além disso, observou-se que os cronogramas para a fase inicial, fase tardia e estágio final podem diferir durante a neurodiferenciação de linhas adicionais de hiPSCs, mas defeitos do ciclo celular bifásico ainda podem ser observados durante a neurodiferenciação da SD. As diferenças observadas em diferentes iPSCs podem ser devidas a diferenças inerentes em hiPSCs devido à natureza estocástica do processo de reprogramação ou devido a diferenças no número de passagens.

Os autores não têm conflito de interesses a divulgar.

Os autores agradecem ao Prof. Stuart H. Orkin por nos fornecer um par de síndrome de Down e hiPSCs euplóides isogênicos. Os autores também agradecem ao Centro Nacional de Ciência Celular (BRIC-NCCS), Pune, por fornecer o financiamento para realizar este trabalho.