In vitro Modélisation de la neurogenèse trisomique à l’aide de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Ce protocole décrit une méthodologie pour récapituler la neurogenèse altérée du syndrome de Down (SD) à l’aide d’iPSC humaines SD. Le protocole a identifié une anomalie du cycle cellulaire biphasique comme la cause de l’altération de la neurogenèse dans le syndrome de Down. Il fournit une plate-forme solide pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la neurogenèse anormale associée au SD.

Le syndrome de Down (SD), causé par une copie supplémentaire du chromosome 21, est l’une des principales causes de déficience intellectuelle. L’un des principaux facteurs contribuant à cette déficience intellectuelle est l’altération de la neurogenèse observée à partir des stades fœtaux. Pour étudier ces anomalies neurodéveloppementales, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) générées à partir de cellules obtenues chez des patients atteints de SD fournissent un modèle précieux et pertinent. Ici, un protocole complet est décrit pour récapituler la neurogenèse altérée par le SD observée au cours des stades fœtaux du SD. Ce protocole utilise une paire de DS-hiPSC ayant trois copies du chromosome 21 et ses hiPSC euploïdes isogéniques ayant deux copies du chromosome 21. Il est important de noter que le protocole décrit ici récapitule la neurogenèse altérée par le SD et a révélé que le défaut du cycle cellulaire biphasique, c’est-à-dire la réduction de la prolifération des cellules progénitrices neurales (NPC) du SD au cours de la phase précoce du stade neurogène suivie d’une prolifération accrue de NPC du SD au cours de la phase tardive du stade neurogène, est la cause de la neurogenèse altérée du SD. La prolifération accrue des NPC SD au cours de la phase tardive du stade neurogène entraîne une sortie retardée du cycle cellulaire, entraînant une réduction de la génération de neurones post-mitotiques à partir des NPC DS. Ce protocole comprend des étapes détaillées pour le maintien des hiPSC, leur différenciation en lignées neurales présentant un défaut du cycle cellulaire biphasique au cours de la phase neurogène, et la validation ultérieure de la différenciation neurale réduite dans les cellules SD. En suivant cette méthodologie, les chercheurs peuvent créer un système expérimental robuste qui imite les conditions neurodéveloppementales du SD, ce qui leur permet d’explorer les altérations spécifiques du développement du cerveau causées par la trisomie 21.

Le syndrome de Down (SD), ou trisomie 21, est l’anomalie chromosomique la plus courante et la principale cause de déficience intellectuelle (DI)¹. L’altération de la neurogenèse au cours du développement fœtal du SD est l’une des causes de la déficience intellectuelle dans le SD². Les études fœtales humaines du SD montrent une réduction du poids et du volume du cerveau, une réduction des neurones, une augmentation des astrocytes ^3,4 et une distribution anormale des neurones dans les couches II et IV ^5,6. De plus, la deuxième phase du développement cortical, c’est-à-dire l’émergence de la lamination, est à la fois retardée et désorganisée dans le DS⁷.

Les défauts de développement neurologique dans le SD ont été étudiés principalement à l’aide de modèles murins de SD tels que Ts65Dn, Ts1Rhr et Ts1cje⁸. Cependant, ces modèles de souris n’ont pas été en mesure de récapituler entièrement les divers phénotypes observés dans les études de SD en raison de différences physiologiques et développementales entre les souris et les humains^9, ce qui a conduit à l’échec des essais cliniques¹⁰. L’invention des cellules souches pluripotentes induites^11,12 a permis de modéliser les troubles neurologiques du syndrome de Down à l’aide de cellules dérivées directement d’individus atteints de SD. Cependant, des tentatives antérieures de modélisation des anomalies neurodéveloppementales du SD à l’aide d’iPSC humaines ont donné des résultats incohérents et n’ont pas pu expliquer entièrement les anomalies neurodéveloppementales observées dans les sections du cerveau fœtal du SD 13,14,15,16. Par exemple, un rapport publié par Shi et al. a révélé des phénotypes de la maladie d’Alzheimer liés au SD, mais n’a signalé aucune différence dans la neurogenèse du SD par rapport aux témoins euploïdes¹⁵. De même, Weick et al. ont signalé une activité synaptique réduite mais une neurogenèse normale dans le SD par rapport aux témoins euploïdes¹⁶. Cependant, la neurogenèse normale dans le SD rapportée dans ces publications n’était pas cohérente avec l’observation de coupes cérébrales fœtales du SD. Plus tard, un rapport de Hibaoui et al. a rapporté une neurogenèse réduite dans le SD, ce qui était cohérent avec l’observation de la section¹⁴ du cerveau fœtal du SD. Cependant, ce rapport et un autre rapport récent ont décrit la réduction de la prolifération des NPC SD comme la cause de la neurogenèse réduite dans les DS^14,17. Cependant, seule une prolifération réduite des NPC du SD ne pourrait pas expliquer l’augmentation des cellules astrogliales et l’émergence retardée de la lamination au cours du développement du cerveau fœtal du SD.

Dans des travaux récemment publiés, un modèle de neurogenèse humaine altérée par le SD basé sur l’iPSC montrant une neurogenèse réduite a été développé. Ce modèle a révélé que l’altération de la neurogenèse dans le SD est due à des défauts du cycle cellulaire biphasique au cours de la phase neurogène (l’étape au cours de laquelle les cellules progénitrices neurales sont générées à partir de cellules souches pluripotentes). Au cours de la première phase du stade neurogène, les NPC SD présentent une prolifération réduite par rapport aux cellules neurales euploïdes isogéniques, suivie d’une prolifération accrue des NPC SD par rapport aux cellules euploïdes isogéniques dans la phase tardive du stade neurogène¹⁸.

Dans ce manuscrit, un protocole détaillé étape par étape pour la différenciation des hiPSC du syndrome de Down et de ses hiPSC euploïdes isogéniques en neurones corticaux a été décrit. L’objectif global de cette méthode est de fournir un protocole détaillé, étape par étape, pour différencier une paire de hiPSC SD et ses hiPSC euploïdes isogéniques en neurones corticaux, en mettant l’accent sur la modélisation des défauts de neurogenèse associés aux DS. Ce protocole est conçu pour offrir un système robuste et reproductible pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents aux anomalies à l’origine de la neurogenèse altérée par le SD.

La raison d’être du développement de ce protocole est de permettre la différenciation des cellules souches pluripotentes en neurones corticaux en utilisant les principes de la neurobiologie du développement, permettant ainsi l’identification des phénotypes qui apparaissent en raison d’une maladie ou d’un trouble. Il visait à adopter une approche minimaliste de la différenciation neuronale des iPSC en évitant des composés tels que l’AMPc ou le DAPT, qui peuvent masquer les phénotypes de maladies dus à des défauts dans le canal Ca⁺⁺ ou la voie NOTCH, respectivement. De même, l’utilisation de l’acide ascorbique, du BDNF et du GDNF a également été évitée, ce qui peut masquer d’autres phénotypes liés aux maladies neurologiques en potentialisant la neurogenèse.

Les avantages de cette technique par rapport aux autres méthodes résident dans la fourniture d’une récapitulation robuste des phénotypes neurologiques observés dans les coupes de cerveau fœtal SD. Il convient de noter que, par rapport aux modèles murins, le système basé sur les iPSC humaines élimine les différences entre les espèces, fournissant un modèle plus pertinent pour l’étude des processus neurodéveloppementaux spécifiques à l’homme⁹ , mais jusqu’à présent, il n’a pas réussi à récapituler la neurogenèse altérée par le SD observée à partir des stades fœtaux du SD. De plus, l’utilisation de paires isogéniques de hiPSC réduit la variabilité et améliore la fiabilité des différences phénotypiques observées. Ce protocole intéressera particulièrement les chercheurs qui étudient les troubles neurodéveloppementaux et la neurogenèse humaine. Il est particulièrement pertinent pour ceux qui cherchent à modéliser des aspects spécifiques de la SD chez l’homme ou ceux qui souhaitent développer des interventions thérapeutiques ciblant les défauts de neurogenèse associés à la trisomie 21.

Le protocole suivant a été suivi avec deux paires de trisomie 21 et ses iPSC humaines euploïdes isogéniques. Une paire a été générée à l’aide de la méthode d’administration par voie rétrovirale de reprogrammation^19, et une deuxième paire (NSi003-A et NSi003-B) a été générée à l’aide de la méthode d’administration non intégratrice du virus Sendai²⁰. Le protocole se compose généralement de deux étapes : l’étape neurogène (étape 1) et l’étape de différenciation neuronale (étape 2). De plus, deux phases basées sur les différences de prolifération du syndrome de Down et des lignées cellulaires euploïdes isogéniques, c’est-à-dire les phases précoce et tardive, sont observées au stade neurogène. Les détails des réactifs, des milieux et de l’équipement utilisés dans cette étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Culture et entretien des hiPSCs trisomiques et des hiPSC euploïdes isogéniques

1. Placage d’alimentation pour hiPSC
   REMARQUE : La qualité et la densité de la mangeoire sont extrêmement importantes pour une bonne qualité de la culture humaine d’iPSC.
   1. Ajouter 2 mL de gélatine à 0,1 % pour enrober une plaque à 6 puits pendant au moins 1 à 2 h à 37 °C avant d’ensemencer avec des cellules nourricières.
   2. Conservez la plaque recouverte de gélatine à température ambiante dans le capot de culture cellulaire pendant au moins 30 minutes avant de plaquer les cellules.
   3. Média chaud de fibroblaste embryonnaire de souris (MEF) à utiliser pour la renaissance dans un bain de billes/un bain d’eau.
   4. Aliquote 5 mL de milieu MEF dans un tube à centrifuger de 15 mL.
   5. Sortez un flacon de cellules d’alimentation du réservoir d’azote liquide (réservoir LN2).
      REMARQUE : Les cellules nourricières ont été obtenues en traitant des fibroblastes embryonnaires de souris E13.5 avec 10 μg/mL de mitomycine C pendant 3 h, suivi d’un lavage 2 à 3 fois avec du DPBS¹⁸. Les cellules d’alimentation peuvent être utilisées directement ou congelées dans un réservoir de LN2 pour une utilisation future. Toutes les souris ont été utilisées après l’approbation du Comité d’éthique animale de l’établissement.
   6. Maintenez le flacon à 37 °C dans le bain-marie à l’aide d’une grille flottante jusqu’à ce qu’il reste un petit morceau de glace.
   7. Prenez le flacon à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique et stérilisez-le avec de l’alcool avant de le mettre dans l’enceinte de sécurité biologique.
   8. Ajouter 1 mL de média MEF chaud (voir le tableau des matériaux) goutte à goutte.
   9. Retirez délicatement le média du flacon et versez-le goutte à goutte dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant un média MEF.
   10. Centrifuger à température ambiante pendant 5 min à 200 x g.
   11. Aspirer le surnageant à l’aide d’un système d’aspiration intra-utérine (EVA).
   12. Ajouter 1 ml de MEF medium et pipeter doucement de haut en bas 3 à 4 fois.
   13. Faites le numération cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Les cellules mortes ont été exclues à l’aide du Trypan Blue.
   14. Plaque 3,1-3,3 x 10⁵ cellules d’alimentation vivante par puits d’une plaque à 6 puits ou 2 x 10^{cellules à 6} cellules par plaque à 6 puits dans un milieu MEF.
   15. Maintenez la plaque à l’intérieur de l’incubateur de CO₂ à 37 °C avec 85 % d’humidité pendant la nuit. Secouez la plaque à l’intérieur de l’incubateur de CO₂ à l’avant, à l’arrière et sur les côtés 2 à 3 fois pour obtenir une répartition homogène des cellules nourricières.
2. Renaissance des hiPSC trisomiques et des hiPSC euploïdes isogéniques
   REMARQUE : Réchauffez le volume requis de média hiPSC dans un bain de billes à 37 °C.
   Milieu de revitalisation des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) : Ajoutez récemment 25 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) et 10 μM d’inhibiteur de roche (IR) (Y-27632 2HCl) dans le milieu hiPSC.
   1. Retirez bien le média MEF des mangeoires et rincez les mangeoires en ajoutant doucement 1 ml/puits de DMEM/F12 chaud sur les côtés du puits. Aspirez le milieu et ajoutez-y 2 ml/bien de milieu de revitalisation hiPSC chaud. Laissez la plaque à l’intérieur de l’incubateur pendant au moins 2 h avant de plaquer les hiPSC.
   2. Sortez un flacon de hiPSC.
   3. Conservez le flacon sur une grille flottante dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il reste un petit morceau de glace.
   4. Avant de placer le flacon à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique, stérilisez-le avec de l’alcool à 70 %.
   5. Ajouter 1 mL de milieu de revitalisation hiPSC chaud.
   6. Retirez délicatement le milieu du flacon et versez-le goutte à goutte dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 5 ml de milieu de revitalisation hiPSC.
   7. Centrifuger à température ambiante pendant 2 min à 100 x g.
   8. Aspirez le surnageant à l’aide d’un EVA et délogez la pastille en tapotant doucement le tube.
   9. Versez 500 μL de milieu hiPSC avec 10 μM d’IR et versez sur la plaque d’alimentation contenant le milieu de revitalisation hiPSC. Étiquetez la plaque avec le nom de la cellule, le numéro de passage, le nom du chercheur et la date.
   10. Observez les colonies hiPSC sous un microscope inversé à un grossissement de 4x ; Il devrait y avoir des amas de cellules.
   11. Tout en gardant la plaque à l’intérieur de l’incubateur de CO₂ , secouez la plaque d’avant en arrière et sur le côté 2 à 3 fois pour obtenir une répartition homogène des cellules. Ne pas déranger la plaque pendant 24 h.
   12. Le lendemain, certaines colonies peuvent sembler collées aux mangeoires, et d’autres flottent. Sans aspirer de milieu, ajouter un milieu hiPSCs frais complété par 25 ng/mL de bFGF et 10 μM d’AR.
   13. Le deuxième jour après la renaissance, la plupart des colonies seraient attachées à la surface. Changer le milieu complet avec un milieu hiPSC avec 25 ng/mL de bFGF. Dans les jours qui suivent, les colonies de hiPSC seront visibles.
       REMARQUE : Il faut au moins une semaine pour que les hiPSCs revivent et forment des colonies avec des bordures lisses et bien définies, une morphologie cellulaire uniforme et un centre de colonie dense.
3. HiPSC du syndrome de Down et hiPSC euploïdes isogéniques sur les mangeoires
   REMARQUE : Tous les réactifs doivent être chauds avant de commencer. Évitez le pipetage excessif des cellules. Manipulez les cellules avec beaucoup de douceur.
   1. Passage des hiPSC lorsque la plupart des colonies commencent à fusionner les unes dans les autres ou lorsqu’il y a l’émergence d’un trop grand nombre de colonies différenciées. Généralement, le fendage doit être effectué dans les 5 à 7 jours suivant le premier passage.
   2. Ranimez une fiole de mangeoires un jour avant de la séparer.
   3. Laver une fois les mangeoires avec 1 mL/puits de DMEM/F12 chaud et ajouter 2 mL/puits de hiPSCs tièdes complétés par 25 ng/mL de bFGF. Laissez la plaque à l’intérieur de l’incubateur de CO₂ à 37 °C pendant au moins 2 h avant de plaquer les hiPSC.
   4. Observer la plaque avec des hiPSC pour les colonies différenciées et retirer la colonie différenciée en la grattant à l’aide d’une pipette de 200 μL sous un stéréomicroscope.
   5. Laver un seul contenant du DMEM/F12 bien chaud.
   6. Verser 1 mL/puits de solution de collagénase 1 mg/ml. Gardez la plaque à l’intérieur de l’incubateur pendant 8 à 10 minutes, puis observez au microscope inversé les bords lâches des colonies.
   7. Aspirez la collagénase et faites 2 lavages de DMEM/F12. Ajouter ensuite 1 ml/puits de milieu hiPSC.
   8. Coupez délicatement les colonies horizontalement et verticalement 8 à 10 fois dans un puits à l’aide de l’extrémité d’une seringue de 2 ml. Observez les colonies au microscope inversé pour vérifier si la plupart des colonies ont été coupées à la bonne taille.
   9. Si les colonies sont suffisamment coupées, soulevez doucement les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules.
   10. Pipeter doucement les colonies dans le puits à l’aide d’une pointe de 1 ml, 5 à 8 fois, selon la taille des colonies.
   11. Rassembler toutes les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à température ambiante pendant 2 min à 100 x g.
   12. Aspirez doucement le surnageant à l’aide d’une pipette, délogez la pastille cellulaire en tapotant doucement le tube et ajoutez 200 μL de milieu hiPSC avec 25 ng/mL de bFGF et 10 μM d’AR. Pipetez 2 à 3 fois avec la pipette de 200 μL et ajoutez 300 μL de milieu hiPSC supplémentaire avec 25 ng/mL de bFGF et 10 μM d’IR.
   13. Maintenant, placez doucement ces cellules sur les mangeoires contenant du milieu hiPSC + 25 ng/mL bFGF. Un puits peut être divisé en 1:2 ou 1:3, selon le nombre de colonies présentes après avoir éliminé les colonies différenciées. Étiquetez la plaque avec le nom de la cellule, le numéro de passage, le nom du chercheur et la date.
   14. Tout en gardant la plaque à l’intérieur de l’incubateur de CO₂ , secouez la plaque d’avant en arrière et sur le côté 2 à 3 fois pour obtenir une répartition homogène des cellules.
   15. Le lendemain, laver doucement avec du DMEM/F12 chaud et ajouter 2,5 ml de milieu hiPSC avec 25 ng/mL de bFGF.
4. HiPSC du syndrome de Down et hiPSC euploïdes isogéniques des mangeoires
   REMARQUE : Le surpipetage des iPSC humaines doit être évité pendant la procédure de congélation.
   1. Divisez les hiPSC lorsqu’ils sont encore dans leur phase logarithmique, c’est-à-dire 4 à 5 jours après le passage.
   2. Observez la plaque avec des hiPSC pour les colonies différenciées et retirez les colonies différenciées à l’aide d’une pipette de 200 μL sous un stéréomicroscope.
   3. Laver un seul contenant du DMEM/F12 bien chaud.
   4. Ajouter 1 ml/puits de solution de collagénase 1 mg/mL. Gardez la plaque à l’intérieur de l’incubateur pendant 8 à 10 minutes, puis observez au microscope inversé pour soulever les bords des colonies.
   5. Aspirez la collagénase et faites 2 lavages de DMEM/F12. Ajouter ensuite 1 ml/puits de milieu hiPSC.
   6. Soulevez doucement les colonies à l’aide d’un élévateur de cellules.
   7. Pipeter doucement les colonies dans le puits à l’aide d’une pointe de 1 mL 5 à 8 fois, selon la taille des colonies.
   8. Rassembler toutes les cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et centrifuger à température ambiante pendant 2 min à 100 x g.
   9. Aspirez doucement le surnageant à l’aide d’une pipette, délogez la pastille cellulaire en tapotant doucement sur le tube et ajoutez 1 mL de milieu hiPSC sans antibiotique complété par 25 ng/mL de bFGF selon le nombre de puits. Distribuez les cellules dans des cryoflacons.
   10. Ajouter le milieu hiPSC sans antibiotique complété par 25 ng/mL de bFGF et 20 % de DMSO dans les cryoflacons pour obtenir une concentration finale de 10 % de DMSO.
   11. Mettez les cryoflacons dans un récipient givré avec un bain d’isopropanol pour favoriser une congélation lente.
   12. Conservez le givre à -80 °C pendant la nuit. Transférez les flacons le lendemain dans le réservoir de LN2.

2. Différenciation neuronale

REMARQUE : Préparation du milieu conditionné par l’alimentateur (FCM) : Utiliser une fiole T-75 et une plaque de 4 x 10⁶ cellules d’alimentation par fiole. Le lendemain, ajouter 40 mL de milieu hiPSC avec 4 ng/mL de bFGF. Collecte pendant 7 jours. Conserver chaque tube de jour à -20 °C jusqu’à 1 mois. Enduire un plat de 15 cm de 10 ml de gélatine à 0,1 % à 37 °C pendant au moins 2 h avant de dissocier les cellules. Enduire une plaque à 6 puits d’une matrice de membrane basale qualifiée CSEh (ci-après appelée « matrice qualifiée ») 1 jour avant de dissocier les cellules. Lors de la dissociation des cellules dans l’ensemble du protocole, ajoutez 10 μM d’IR à la solution de détachement cellulaire (voir le tableau des matériaux), au DPBS et au milieu de placage (FCM complété par 25 ng/mL de bFGF). Préparez un milieu conditionné à l’alimentation fraîche (FCM) pour chaque différenciation. Évitez le surfaçage des hiPSC.

1. Jour in vitro (DIV) 2 : Fabrication de cellules uniques et ensemencement de hiPSC pour la neurodifférenciation
   1. Ajouter 10 μM d’AR dans un milieu hiPSC complété par 25 ng/mL de bFGF, DPBS, solution de détachement cellulaire et milieu conditionné par l’alimentation complété par 25 ng/mL de bFGF. Réchauffez tous ces réactifs à 37 °C.
   2. Prélever une plaque de CSPi à 6 puits sur les mangeoires, retirer les colonies différenciées et ajouter un milieu de CSPi frais complété par 25 ng/mL de bFGF et 10 μM d’AR. Conservez la plaque pendant 2 h dans l’incubateur.
   3. Sortez la plaque iPSCs au bout de 2 h et rincez-la une fois avec du DPBS sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺.
   4. Ajouter 1 mL/puits de solution de détachement de cellules (+ 10 μM d’IR) et maintenir la plaque à l’intérieur de l’incubateur de CO₂ pendant 12 à 14 min.
   5. Après 12-14 min, observez les cellules sous un microscope inversé ; La plupart des cellules commencent à se détacher de la plaque. Si certaines cellules adhèrent encore, tapotez doucement la plaque sur les côtés.
   6. Diluer la solution de détachement cellulaire en ajoutant 3 mL/puits de DPBS avec du Ca⁺⁺ et du Mg⁺⁺ (+ 10 μM d’AR). À l’aide d’une pipette de 5 ml, faites 2 à 3 pipetages doux, en évitant les bulles pour briser les grumeaux.
   7. Faites passer les cellules à travers une crépine de 40 μM.
   8. Recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 50 ml.
   9. Centrifuger à température ambiante pendant 5 min à 200 x g et aspirer doucement le milieu à l’aide d’un SAV.
   10. Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de milieu hiPSC (+ 25 ng/mL de bFGF + 10 μM d’AR). Ajouter les cellules dans une boîte de 15 cm recouverte de gélatine à 0,1 % pendant 1,5 h pour éliminer les mangeoires, car les mangeoires ont une adhérence préférentielle à la surface recouverte de gélatine par rapport aux hiPSC.
   11. Après 1,5 h, prélever délicatement le milieu à l’aide de cellules et centrifuger à température ambiante pendant 5 min à 200 x g. Aspirez le support à l’aide de VAS.
   12. Réintroduisez les cellules dans 1 mL de FCM (+ 25 ng/mL de bFGF + 10 μM d’AR) et numérisez les cellules.
   13. À l’aide de FCM (+ 25 ng/mL de bFGF + 10 μM d’AR), produire une suspension cellulaire de 30 000 à 50 000 cellules/mL et semer une suspension cellulaire de 5 mL/plaque de 60 mm ou 2 mL/puits de plaque à 6 puits ou 500 μL/puits de plaque à 24 puits. Les plaques doivent être recouvertes d’une matrice qualifiée (voir le tableau des matériaux).
2. DIV 0 : (~48 h plus tard) : Changer le milieu conditionné à l’alimentation en milieu NPC (DDM + B27 sans vitamine A + N2) (voir le tableau des matières).
3. DIV 2 : Ajouter un milieu NPC avec 0,125 μM de Dorsomorphine tous les deux jours jusqu’à DIV 18.
4. DIV 18 : Ajoutez des médias PNJ sans Dorsomorphine et réapprovisionnez-les tous les deux jours jusqu’à DIV 28.
5. DIV 28-30 : Fabrication de cellules uniques et ensemencement de PNJ pour l’étape 2
   1. Sur la DIV 28, retirez la plaque (contenant les NPC), et remplacez le média par un média NPC (+ 10 μM d’IR). Mettez la plaque dans l’incubateur de CO₂ pendant 2 h.
   2. Après 2 h, aspirez le média et rincez-le un avec du DPBS (sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺).
   3. Ajouter 1 mL/puits de solution de détachement de cellule (+ 10 μM d’IR) et maintenir la plaque à l’intérieur de l’incubateur pendant 14 min.
   4. Après 14 min, observez les cellules sous un microscope inversé à 4x. La plupart des cellules commencent à se détacher de la plaque. Si certaines cellules adhèrent encore, tapotez doucement la plaque sur les côtés.
   5. Diluer la solution de décollement cellulaire en ajoutant 3 mL/puits de DPBS avec du Ca⁺⁺ et du Mg⁺⁺ (+ 10 μM d’AR). À l’aide d’une pipette de 5 ml, faites 2 à 3 pipetages doux, en évitant les bulles pour briser les grumeaux.
   6. Passer à travers une passoire de 40 μM placée sur un tube à centrifuger de 50 mL.
   7. Centrifuger à température ambiante pendant 5 min à 200 x g. Aspirez doucement le support à l’aide d’un SAV.
   8. Remettre en suspension les cellules en DDM + B27 avec de la vitamine A (+ 10 μM d’AR).
   9. Comptez les cellules vivantes à l’aide de bleu trypan avec un hémocytomètre.
   10. Ensemencez 50 000 cellules/puits sur une plaque qualifiée revêtue d’une matrice (1x) de la plaque de 48 puits.
6. DIV 33 : Changer le milieu en milieu de différenciation neurale (voir le Tableau des matériaux). Changez de support tous les 5 jours. Continuez à réapprovisionner le support jusqu’à DIV 85/90.

3. Immunocytochimie (ICC)

REMARQUE : Ajoutez suffisamment de tampon à toutes les étapes pour couvrir les cellules et éviter le dessèchement du puits lors de l’aspiration pendant l’étape de lavage.

1. Retirez la plaque cellulaire différenciée à l’extérieur de la zone de culture cellulaire.
2. Aspirez le support et donnez un lavage DPBS.
3. Pour la fixation, ajoutez 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % aux cellules. Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium et placez-la sur un agitateur à bascule à 37 °C pendant 30 min.
4. Aspirez le PFA et effectuez trois lavages de 15 min chacun avec du DPBS (sans Ca⁺⁺ et Mg⁺⁺).
5. Ajouter un tampon bloquant (3 % de BSA + 5 % de sérum d’âne (ou sérum d’anticorps secondaire de l’animal hôte) + 0,2 % de Triton-X dans le DPBS) pendant 1 h à température ambiante.
6. Ajouter 250 μL/puits d’anticorps primaires [Ki67 (dilution 1:100), TUBB3 (dilution 1:500), PAX6 (1:100)] et incuber toute la nuit à 4 °C sur un agitateur à bascule. La dilution a été faite dans une solution bloquante.
7. Laver trois fois avec du DPBS après l’incubation primaire des anticorps.
8. Ajouter 250 μL/puits d’anticorps secondaire (dilué 1:250 dans 3 % BSA + 0,2 % Triton-X dans DPBS) pendant 1 h à température ambiante.
9. Laver 3 fois avec du DPBS après l’incubation secondaire des anticorps.
10. Ajouter le DAPI (dilution 1:1000 de 5 mg/mL dans du DPBS) pendant 15 min à température ambiante. Lavez trois fois avec DPBS. Laissez le dernier lavage dans la plaque de culture et observez au microscope.

4. Acquisition et analyse d’images

1. Capturez des images à l’aide du microscope à fluorescence à une résolution de 20x.
2. Capturez des images de Ki67, ainsi que des images de coloration TUBB3 à l’aide d’un filtre d’excitation de 540 nm, PAX6 à l’aide d’un filtre d’excitation de 488 nm et des images DAPI à l’aide d’un filtre d’excitation de 358 nm.
3. Capturez des images à partir de dix champs aléatoires différents pour l’analyse.
4. Analysez les images ICC à l’aide du logiciel ImageJ.
5. Pour l’analyse TUBB3 et PAX6, effectuez le seuillage de toutes les images pour les signaux rouge et vert, respectivement, et de l’intensité du signal bleu pour DAPI. L’intensité moyenne des pixels rouges de TUBB3 et des pixels verts de PAX6 a été normalisée avec l’intensité moyenne des pixels bleus de DAPI.
6. Pour l’analyse Ki67, comptez les cellules à l’aide de la fonction de comptage automatisé des cellules du logiciel ImageJ. Normalisez le nombre de cellules Ki67 positives avec le nombre de cellules DAPI positives.
7. Effectuez une analyse statistique à l’aide d’un logiciel de statistiques et de graphiques en comparant les deux groupes à l’aide de tests t non appariés. Les données doivent être exprimées en moyenne ± MEB provenant de trois expériences indépendantes. Une valeur p inférieure à 0,05 est considérée comme statistiquement significative.

Des iPSC humaines singularisées ont été ensemencées sur des boîtes enrobées de matrice qualifiées sous forme de suspensions unicellulaires, et la différenciation a été initiée en supprimant le bFGF. Pour inhiber la différenciation non ectodermique, la dorsomorphine, un inhibiteur de la signalisation BMP, a été ajoutée à partir de la DIV 2-18²¹. Pour une différenciation plus poussée des cellules progénitrices à partir du stade neurogène, des suspensions unicellulaires ont été replaquées à faible densité sur la matrice qualifiée (Figure 1) pendant 6 à 10 semaines supplémentaires pour observer une différenciation neurale précoce. Après l’étape de différenciation neurale (stade 2), l’analyse du jour 85 a révélé une réduction significative des neurones TUBB3+ dans les cultures de SD par rapport à celles avec des cellules euploïdes isogéniques (Figure 2A). La quantification a montré une diminution d’environ deux fois des neurones TUBB3+ dans les cultures SD (Figure 2B). Cela indique que les cellules SD présentent une différenciation neuronale réduite, ce qui correspond aux observations faites sur des coupes de cerveau fœtal SD, démontrant la fiabilité du modèle de neurogenèse in vitro utilisé dans cette étude.

Pour étudier la cause sous-jacente de la réduction du nombre de neurones dans le SD, l’immunocoloration Ki67 a été utilisée pour analyser le cycle cellulaire pendant la phase neurogène de la neurogenèse. Au cours de la phase précoce de ce stade, la majorité des cellules euploïdes isogéniques étaient Ki67+, indiquant une prolifération cellulaire active. En revanche, une proportion significativement plus faible de cellules SD étaient Ki67+ (Figure 2C). L’analyse quantitative a révélé une réduction d’environ quatre fois des cellules Ki67+ dans le SD (Figure 2D), ce qui suggère que les cellules SD sont principalement restées en phase G0 au cours du stade neurogène précoce. Une analyse plus poussée au cours de la phase tardive du stade neurogène a révélé que la plupart des cellules euploïdes isogéniques étaient sorties du cycle cellulaire, comme en témoigne l’absence de coloration Ki67 (Figure 2E). À l’inverse, la majorité des cellules SD sont restées Ki67+ (Figure 2F), ce qui indique la persistance des cellules progénitrices cycliques. Les données quantitatives ont démontré une augmentation d’environ cinq fois des cellules Ki67+ dans le SD par rapport aux cellules euploïdes isogéniques. Ces résultats de la première paire de cellules hiPSC DS et euploïdes isogéniques ont été validés à l’aide d’une deuxième paire de cellules hiPSC DS et euploïdes isogéniques. La deuxième paire a également montré une neurogenèse réduite au jour 85 dans les cellules SD par rapport aux cellules euploïdes isogéniques (Figure 2G). L’analyse quantitative a montré une réduction de deux fois des neurones TUBB3+ (Figure 2H) à la fin de la différenciation neuronale. De plus, il y avait une augmentation de plus de deux fois des cellules progénitrices neurales PAX6+ dans le SD par rapport aux cellules euploïdes isogéniques au même stade (Figure 2G et Figure 2I). Ces résultats ont confirmé que les cellules progénitrices neurales du SD n’ont pas réussi à sortir du cycle cellulaire et à se différencier en neurones post-mitotiques, ce qui correspond à une anomalie du cycle cellulaire biphasique.

Cette étude, menée à l’aide de deux paires d’hiPSC SD et de leurs homologues euploïdes isogéniques, démontre que la neurogenèse altérée observée dans les SD provient d’une dérégulation du cycle cellulaire biphasique au stade neurogène du développement des progéniteurs neuraux. Au cours de l’induction neurale, les cellules SD ont montré une prolifération réduite dans la phase précoce, suivie d’une prolifération accrue pendant la phase tardive par rapport aux cellules témoins. La diminution de la prolifération au cours de la phase précoce limite la taille du pool de progéniteurs neuronaux, tandis que la prolifération accrue au cours de la phase tardive retarde la formation de neurones post-mitotiques dans le SD.

Figure 1 : Illustration de la neurogenèse des iPSC humaines atteintes du syndrome de Down (SD). Les illustrations montrent que la neurogenèse est divisée en deux étapes : l’étape neurogène et l’étape de différenciation neuronale. La différenciation des cellules souches pluripotentes vers le stade de progéniteur neural est appelée stade neurogène, tandis que la différenciation des progéniteurs neuraux vers les cellules de la lignée neurale est appelée stade de différenciation neurale. L’illustration montre les chronologies de chaque étape, comme observé dans ce protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’anomalie du cycle cellulaire biphasique contribue à l’altération de la neurogenèse du syndrome de Down (SD). (A) Images représentatives de TUBB3 (rouge), images DAPI et la superposition correspondante de la première paire de DS et de hiPSC euploïdes isogéniques au jour 85. (B) Quantification de l’expression de TUBB3 normalisée par coloration DAPI par immunocytochimie (ICC). (C) Images représentatives de Ki67 (rouge) pendant la phase précoce (DIV 18) de l’étape 1, avec les images DAPI correspondantes et leur superposition de la première paire de DS et de hiPSC euploïdes isogéniques. (D) Quantification de l’expression de Ki67 au cours de la phase précoce. (E) Images représentatives de Ki67 pendant la phase tardive (DIV 28) de l’étape 1, avec les images DAPI correspondantes et leur superposition de la première paire de DS et de hiPSC euploïdes isogéniques. (F) Quantification de l’expression de Ki67 au cours de la phase tardive. (G) Images représentatives de TUBB3 (rouge), PAX6 (vert) et DAPI de la deuxième paire de DS et de hiPSC euploïdes isogéniques. (H) Quantification de l’expression de TUBB3 au jour 85. (I) Quantification de l’expression de PAX6 au jour 85. Des comparaisons entre les groupes ont été effectuées à l’aide de tests t non appariés. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± MEB à partir de trois expériences indépendantes, la signification statistique étant définie comme p < 0,05. Les barres d’échelle représentent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans ce travail, un protocole efficace de neurodifférenciation corticale monocouche non dirigée pour une paire isogénique de hiPSC euploïdes et de hiPSC SD est décrit. Étant donné que les cellules sont cultivées en monocouches, elles sont plus exposées aux conditions de culture, ce qui n’est pas possible dans la même mesure que l’utilisation de corps embryoïdes pour différencier les iPSC, qui sont généralement utilisés dans d’autres protocoles^14,16. Alors que l’utilité des systèmes organoïdes augmente, le système de différenciation neuronale basé sur une monocouche conserve ses avantages en fournissant aux cellules un environnement de différenciation homogène. Dans les systèmes à base d’organoïdes, en raison de leur nature tridimensionnelle, une activité locale de type centre peut se former. De plus, toutes les cellules des organoïdes n’ont pas un accès égal aux facteurs de croissance ajoutés de manière exogène, ce qui entraîne un gradient morphogénique incontrôlé, comme en témoigne la mort cellulaire au centre des organoïdes. Bien que plusieurs améliorations aient été proposées dans les méthodes organoïdes, il est nécessaire de valider les méthodes organoïdes par leur capacité à récapituler les phénotypes observés dans les échantillons humains. Comme nous l’avons mentionné, plusieurs protocoles précédents n’ont pas réussi à récapituler la neurogenèse altérée par le SD. Ainsi, la méthode basée sur la monocouche a été préférée, permettant des conditions de culture plus contrôlées pendant la neurodifférenciation. Les méthodes de neurodifférenciation évoluent constamment. Alors que certaines méthodes offrent une neurodifférenciation plus rapide²², d’autres fournissent un moment de différenciation plus pertinent sur le plan physiologique²³. De plus, l’utilisation de composés non physiologiques, par exemple le DAPT, l’AMPc ou l’acide ascorbique, ou la concentration non physiologique de facteurs de croissance tels que le GDNF et le BDNF doit être évaluée par les utilisateurs avant de les utiliser pour la neurodifférenciation. Les composés ou facteurs de croissance ajoutés de manière exogène peuvent masquer les propriétés intrinsèques des cellules malades et empêcher d’imiter les conditions in vivo d’une boîte.

Le taux de réussite de la neurodifférenciation dépend de la qualité des iPSC avant l’ensemencement pour la différenciation. Il devrait y avoir moins de 10 % de colonies différenciées. Une étape critique de la procédure expérimentale est que les iPSC doivent être ensemencées à une faible densité allant de 5000 à 10 000 cellules/cm^2, et pour obtenir la dorsalisation des cellules, la dorsomorphine doit être ajoutée pendant environ 16 jours à une faible concentration de 0,125 μM. Une mort cellulaire étendue est observée à des concentrations plus élevées de Dorsomorphine lorsqu’elle est utilisée avec des cellules en plaques de faible densité. Noggin peut également être ajouté à la place de la dorsomorphine pour réduire la mort cellulaire, mais la dorsomorphine a été utilisée pour réduire le coût élevé associé à la noggine. Le placage de cellules à haute densité réduit la différenciation neurale et peut également favoriser les populations neuronales du mésencéphale et du mésencéphale²⁴. Étant donné que le taux de prolifération peut varier d’une iPSC, la densité initiale de placage doit être testée pour chaque nouvelle ligne de hiPSC. De plus, si les cellules souches pluripotentes présentent une prolifération étendue, les cellules peuvent être divisées vers le jour 20. Ce protocole sera utile pour étudier l’effet des gènes du chromosome 21 sur la neurogenèse du SD et pourra être utilisé pour le dépistage de drogues.

La principale limitation de ce protocole est une longue durée allant jusqu’à 85-90 jours pour se différencier en neurones. De plus, il a été observé que les chronologies de la phase précoce, de la phase tardive et de la phase finale peuvent différer pendant la neurodifférenciation de lignées hiPSC supplémentaires, mais que des défauts du cycle cellulaire biphasique peuvent toujours être observés pendant la neurodifférenciation du SD. Les différences observées dans les différentes CSPi pourraient être dues à des différences inhérentes aux CSPhi, à la nature stochastique du processus de reprogrammation ou à des différences dans les nombres de passages.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les auteurs remercient le professeur Stuart H. Orkin de nous avoir fourni une paire de hiPSC euploïdes isogéniques du syndrome de Down. Les auteurs sont également reconnaissants au Centre national des sciences cellulaires (BRIC-NCCS) de Pune d’avoir fourni le financement nécessaire à la réalisation de ce travail.