In vitro Modellazione della neurogenesi della sindrome di Down utilizzando cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Questo protocollo delinea una metodologia per ricapitolare la neurogenesi compromessa dalla sindrome di Down (DS) utilizzando iPSC umane DS. Il protocollo ha identificato il difetto del ciclo cellulare bifasico come causa di una neurogenesi compromessa nella sindrome di Down. Fornisce una solida piattaforma per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari alla base della neurogenesi anomala associata alla DS.

La sindrome di Down (DS), causata da una copia in più del cromosoma 21, è una delle principali cause di disabilità intellettiva. Uno dei fattori chiave che contribuiscono a questa disabilità intellettiva è la neurogenesi compromessa osservata fin dalle fasi fetali. Per studiare queste anomalie dello sviluppo neurologico, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) generate utilizzando cellule ottenute da pazienti con DS forniscono un modello prezioso e rilevante. Qui, viene descritto un protocollo completo per ricapitolare la neurogenesi compromessa dalla DS osservata durante gli stadi fetali della DS. Questo protocollo utilizza una coppia di DS-hiPSC con tre copie del cromosoma 21 e le sue hiPSC euploidi isogeniche con due copie del cromosoma 21. È importante sottolineare che il protocollo qui descritto ricapitola la neurogenesi compromessa dalla DS e ha scoperto che il difetto del ciclo cellulare bifasico, cioè la ridotta proliferazione delle cellule progenitrici neurali (NPC) della DS durante la fase iniziale dello stadio neurogenico, seguita da un aumento della proliferazione delle NPC della DS durante la fase avanzata dello stadio neurogenico, è la causa della neurogenesi compromessa della DS. L'aumento della proliferazione delle NPC DS durante la fase avanzata dello stadio neurogeno porta a un'uscita ritardata dal ciclo cellulare, causando una ridotta generazione di neuroni post-mitotici dalle NPC DS. Questo protocollo include passaggi dettagliati per il mantenimento delle hiPSC, la loro differenziazione in linee neurali che mostrano un difetto del ciclo cellulare bifasico durante la fase neurogenica e la successiva convalida della ridotta differenziazione neurale nelle cellule DS. Seguendo questa metodologia, i ricercatori possono creare un robusto sistema sperimentale che imita le condizioni di sviluppo neurologico della DS, consentendo loro di esplorare le alterazioni specifiche nello sviluppo cerebrale causate dalla trisomia 21.

La sindrome di Down (DS), o trisomia 21, è l'anomalia cromosomica più comune e la principale causa di disabilità intellettiva (ID)¹. La neurogenesi compromessa durante lo sviluppo fetale della DS è una delle cause della disabilità intellettiva nella DS². Gli studi fetali sulla DS umana mostrano una riduzione del peso e del volume del cervello, una riduzione dei neuroni, un aumento degli astrociti ^3,4 e una distribuzione anomala dei neuroni negli strati II e IV ^5,6. Inoltre, la seconda fase dello sviluppo corticale, cioè l'emergere della laminazione, è sia ritardata che disorganizzata in DS⁷.

I difetti di neurosviluppo nella DS sono stati studiati principalmente utilizzando modelli murini di DS come Ts65Dn, Ts1Rhr e Ts1cje⁸. Tuttavia, questi modelli murini non sono stati in grado di ricapitolare completamente i vari fenotipi osservati negli studi sulla DS a causa delle differenze fisiologiche e di sviluppo tra topi e esseri umani^9, che hanno portato al fallimento degli studi clinici¹⁰. L'invenzione delle cellule staminali pluripotenti indotte^11,12 ha fornito l'opportunità di modellare la compromissione neurologica della sindrome di Down utilizzando cellule derivate direttamente da individui con DS. Tuttavia, i precedenti tentativi di modellare i difetti dello sviluppo neurologico della DS utilizzando iPSC umane hanno ottenuto risultati incoerenti e non sono stati in grado di spiegare completamente i difetti dello sviluppo neurologico osservati nelle sezioni cerebrali fetali 13,14,15,16 della DS. Ad esempio, un rapporto pubblicato da Shi et al. ha trovato fenotipi di Alzheimer correlati alla DS, ma non ha riportato alcuna differenza nella neurogenesi della DS rispetto ai controlli euploidi¹⁵. Allo stesso modo, Weick et al. hanno riportato una ridotta attività sinaptica ma una neurogenesi normale nella DS rispetto ai controlli euploidi¹⁶. Tuttavia, la neurogenesi normale nella DS riportata in queste pubblicazioni non era coerente con l'osservazione delle sezioni cerebrali fetali della DS. Successivamente, un rapporto di Hibaoui et al. ha riportato una ridotta neurogenesi nella DS, che era coerente con l'osservazione della sezione¹⁴ del cervello fetale DS. Tuttavia, questo rapporto e un altro recente rapporto hanno descritto la ridotta proliferazione di NPC DS come la causa della ridotta neurogenesi in DS^14,17. Tuttavia, solo la ridotta proliferazione delle NPC DS non poteva spiegare l'aumento delle cellule astrogliali e il ritardo dell'emergere della laminazione durante lo sviluppo del cervello fetale DS.

In un lavoro pubblicato di recente, è stato sviluppato un modello di neurogenesi umana con DS compromessa che mostra una neurogenesi ridotta. Questo modello ha scoperto che la neurogenesi compromessa nella DS è dovuta a difetti del ciclo cellulare bifasico durante la fase neurogenica (la fase durante la quale le cellule progenitrici neurali sono generate da cellule staminali pluripotenti). Durante la prima fase dello stadio neurogenico, le NPC DS mostrano una proliferazione ridotta rispetto alle cellule neurali euploidi isogeniche, seguita da un aumento della proliferazione delle NPC DS rispetto alle cellule euploidi isogeniche nella fase avanzata dello stadio neurogenico¹⁸.

In questo manoscritto, è stato descritto un protocollo dettagliato passo dopo passo per la differenziazione delle hiPSC della sindrome di Down e delle sue hiPSC euploidi isogeniche nei neuroni corticali. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo dettagliato e passo-passo per differenziare una coppia di hiPSC DS e le sue hiPSC euploidi isogeniche in neuroni corticali, con particolare attenzione alla modellazione dei difetti di neurogenesi associati alla DS. Questo protocollo è progettato per offrire un sistema robusto e riproducibile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base delle anomalie che causano la neurogenesi con DS-compromessa.

Il razionale alla base dello sviluppo di questo protocollo è quello di consentire la differenziazione di cellule staminali pluripotenti in neuroni corticali utilizzando i principi della neurobiologia dello sviluppo, consentendo così l'identificazione di fenotipi che insorgono a causa di malattie/disturbi. L'obiettivo era quello di adottare un approccio minimalista alla differenziazione neurale delle iPSC, evitando composti come cAMP o DAPT, che possono mascherare i fenotipi della malattia che insorgono a causa di difetti nel canale del Ca⁺⁺ o nella via NOTCH, rispettivamente. Allo stesso modo, è stato evitato anche l'uso di acido ascorbico, BDNF e GDNF, che possono mascherare altri fenotipi neurologici correlati alla malattia potenziando la neurogenesi.

I vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi alternativi risiedono nel fornire una solida ricapitolazione dei fenotipi neurologici osservati nelle sezioni cerebrali fetali DS. Da notare che, rispetto ai modelli murini, il sistema umano basato su iPSC elimina le differenze tra le specie, fornendo un modello più rilevante per lo studio dei processi di sviluppo neurologico specifici per l'uomo⁹ , ma fino ad ora non è riuscito a ricapitolare la neurogenesi compromessa dalla DS osservata negli stadi fetali della DS in poi. Inoltre, l'uso di coppie isogeniche di hiPSC riduce la variabilità e migliora l'affidabilità delle differenze fenotipiche osservate. Questo protocollo sarà di particolare interesse per i ricercatori che studiano i disturbi del neurosviluppo e la neurogenesi umana. È particolarmente rilevante per coloro che cercano di modellare aspetti specifici dell'uomo della DS o per coloro che sono interessati a sviluppare interventi terapeutici mirati ai difetti di neurogenesi associati alla trisomia 21.

Il seguente protocollo è stato seguito con due coppie di sindrome di Down e le sue iPSC umane euploidi isogeniche. Una coppia è stata generata utilizzando il metodo di somministrazione mediata retrovirale della riprogrammazione^{19 e una} seconda coppia (NSi003-A e NSi003-B) è stata generata utilizzando il metodo di somministrazione del virus Sendai non integrato²⁰. Il protocollo consiste in generale di due fasi: la fase neurogena (Fase 1) e la fase di differenziazione neurale (Fase 2). Inoltre, due fasi basate sulle differenze nella proliferazione della sindrome di Down e delle linee cellulari euploidi isogeniche, cioè le fasi precoci e tardive, sono osservate nella fase neurogenica. I dettagli dei reagenti, dei terreni e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Sindrome di Down: hiPSCs e hiPSCs euploidi isogene, coltura e mantenimento

1. Placcatura dell'alimentatore per hiPSC
   NOTA: La qualità e la densità dell'alimentatore sono estremamente importanti per una buona qualità della coltura di iPSC umane.
   1. Aggiungere 2 mL di gelatina allo 0,1% per rivestire una piastra a 6 pozzetti per almeno 1-2 ore a 37 °C prima di seminare con le cellule di alimentazione.
   2. Conservare la piastra gelatinizzata a temperatura ambiente nella cappa di coltura cellulare per almeno 30 minuti prima di placcare le cellule.
   3. Terreno caldo di fibroblasti embrionali di topo (MEF) da utilizzare per la rianimazione in bagno di perline/bagno d'acqua.
   4. Aliquotare 5 mL di terreno MEF in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   5. Estrarre una fiala di celle di alimentazione dal serbatoio dell'azoto liquido (serbatoio LN2).
      NOTA: Le cellule feeder sono state derivate trattando fibroblasti embrionali di topo E13.5 con 10 μg/mL di mitomicina C per 3 ore, seguito da 2-3 lavaggi con DPBS¹⁸. Le celle di alimentazione possono essere utilizzate direttamente o congelate in un serbatoio LN2 per un uso futuro. Tutti i topi sono stati utilizzati dopo l'approvazione del Comitato Etico Istituzionale per gli Animali.
   6. Conservare il flaconcino a 37 °C nel bagnomaria utilizzando una griglia galleggiante fino a quando non rimane un piccolo pezzo di ghiaccio.
   7. Prendi la fiala all'interno della cabina di biosicurezza e sterilizzala con alcool prima di metterla all'interno della cappa di biosicurezza.
   8. Aggiungere 1 mL di terreno MEF caldo (vedere la Tabella dei materiali) goccia a goccia.
   9. Estrarre delicatamente il terreno dal flaconcino e versarlo goccia a goccia in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente terreno MEF.
   10. Centrifugare a temperatura ambiente per 5 min a 200 x g.
   11. Aspirare il surnatante utilizzando un sistema di aspirazione a vuoto (VAS).
   12. Aggiungere 1 mL di terreno MEF e pipettare delicatamente su e giù 3-4 volte.
   13. Effettuare la conta delle cellule utilizzando un emocitometro. Le cellule morte sono state escluse utilizzando il blu di tripano.
   14. Piastra 3,1-3,3 x 10⁵ celle di alimentazione viva per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti o 2 x 10^{6 celle} per piastra a 6 pozzetti in terreno MEF.
   15. Mantenere la piastra all'interno dell'incubatore a CO₂ a 37 °C con l'85% di umidità per una notte. Agitare la piastra all'interno dell'incubatore di CO₂ fronte-retro e lateralmente 2-3 volte per ottenere una distribuzione omogenea delle cellule di alimentazione.
2. Rinascita delle hiPSC della sindrome di Down e delle hiPSC euploidi isogene
   NOTA: Riscaldare il volume richiesto di terreno hiPSC in un bagno di microsfere a 37 °C.
   Terreno di rianimazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC): aggiungere appena 25 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) e 10 μM di inibitore della roccia (RI) (Y-27632 2HCl) in terreno hiPSC.
   1. Rimuovere bene i terreni MEF dagli alimentatori e lavare gli alimentatori aggiungendo delicatamente 1 mL/pozzetto di DMEM/F12 caldo dai lati del pozzetto. Aspirare il terreno e aggiungere 2 mL/pozzetto di terreno di coltura rianimante hiPSC caldo. Lasciare la piastra all'interno dell'incubatore per almeno 2 ore prima di placcare le hiPSC.
   2. Estrarre una fiala di hiPSC.
   3. Tenere il flaconcino su una griglia galleggiante a bagnomaria a 37 °C fino a quando rimane un piccolo pezzo di ghiaccio.
   4. Prima di assumere la fiala all'interno della cabina di biosicurezza, sterilizzarla con alcol al 70%.
   5. Aggiungere 1 mL di terreno rianimatore hiPSC caldo.
   6. Estrarre delicatamente il terreno dal flaconcino e versarlo goccia a goccia in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di terreno di rianimazione hiPSCs.
   7. Centrifugare a temperatura ambiente per 2 minuti a 100 x g.
   8. Aspirare il surnatante utilizzando VAS e rimuovere il pellet picchiettando delicatamente il tubo.
   9. Versare 500 μl di terreno hiPSC con 10 μM di RI e versare sulla piastra di alimentazione contenente il terreno di ravvivazione hiPSC. Etichetta la targa con il nome della cella, il numero di passaggio, il nome del ricercatore e la data.
   10. Osservare le colonie di hiPSC al microscopio invertito con ingrandimento 4x; Dovrebbero esserci grumi di cellule.
   11. Mantenendo la piastra all'interno dell'incubatore di CO₂ , agitare la piastra fronte-retro e lateralmente 2-3 volte per ottenere una distribuzione omogenea delle cellule. Non disturbare la piastra per 24 ore.
   12. Il giorno seguente, alcune colonie potrebbero sembrare aderenti alle mangiatoie e alcune sarebbero galleggianti. Senza aspirare alcun terreno, aggiungere un terreno hiPSC fresco integrato con 25 ng/mL di bFGF e 10 μM di RI.
   13. Il secondo giorno dopo la rinascita, la maggior parte delle colonie sarebbe stata attaccata alla superficie. Sostituire il terreno completo con terreno hiPSC con 25 ng/mL di bFGF. Nei prossimi giorni, le colonie di hiPSC saranno visibili.
       NOTA: Ci vuole almeno una settimana perché le hiPSC si risveglino e creino colonie con bordi lisci e ben definiti, morfologia cellulare uniforme e un centro di colonia denso.
3. HiPSCs della sindrome di Down passaging e hiPSCs euploidi isogene sulle mangiatoie
   NOTA: Tutti i reagenti devono essere caldi prima di iniziare. Evitare il pipettaggio eccessivo delle cellule. Maneggiare le celle con molta delicatezza.
   1. HiPSC di passaggio quando la maggior parte delle colonie inizia a fondersi l'una nell'altra o quando c'è l'emergere di troppe colonie differenziate. Generalmente, la scissione deve essere eseguita entro 5-7 giorni dal primo passaggio.
   2. Rianima una fiala di mangiatoie un giorno prima di dividerla.
   3. Lavare gli alimentatori con 1 mL/pozzetto di DMEM/F12 caldo e aggiungere 2 mL/pozzetto di terreno hiPSCs caldo integrato con 25 ng/mL di bFGF. Lasciare la piastra all'interno dell'incubatore di CO₂ a 37 °C per almeno 2 ore prima di placcare le hiPSC.
   4. Osservare la piastra con le hiPSC per le colonie differenziate e rimuovere la colonia differenziata mediante raschiatura utilizzando una pipetta da 200 μl al microscopio stereomicroscopio.
   5. Lavare le hiPSC con DMEM/F12 caldo da 1 ml.
   6. Versare 1 mL/pozzetto di soluzione di collagenasi da 1 mg/ml. Tenere la piastra all'interno dell'incubatrice per 8-10 minuti, quindi osservare al microscopio invertito i bordi allentati delle colonie.
   7. Aspirare la collagenasi e somministrare 2 lavaggi di DMEM/F12. Quindi aggiungere 1 mL/pozzetto di terreno hiPSC.
   8. Tagliare delicatamente le colonie orizzontalmente e verticalmente 8-10 volte in un pozzetto utilizzando la punta di una siringa da 2 ml. Osserva le colonie al microscopio invertito per verificare se la maggior parte delle colonie è stata tagliata alla dimensione appropriata.
   9. Se le colonie sono tagliate a sufficienza, sollevarle delicatamente usando un sollevatore di cellule.
   10. Pipettare delicatamente le colonie nel pozzetto utilizzando un puntale da 1 mL, 5-8 volte, a seconda delle dimensioni delle colonie.
   11. Raccogliere tutte le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a temperatura ambiente per 2 minuti a 100 x g.
   12. Aspirare delicatamente il surnatante utilizzando una pipetta, rimuovere il pellet cellulare picchiettando delicatamente la provetta e aggiungere 200 μL di terreno hiPSC con 25 ng/mL di bFGF e 10 μM di RI. Pipettare 2-3 volte con la pipetta da 200 μL e aggiungere altri 300 μl di terreno hiPSC con 25 ng/mL di bFGF e 10 μM di RI.
   13. Ora placcare delicatamente queste cellule sugli alimentatori contenenti terreno hiPSC + 25 ng/mL di bFGF. Un pozzetto può essere diviso in 1:2 o 1:3, a seconda del numero di colonie presenti dopo aver rimosso le colonie differenziate. Etichetta la targa con il nome della cella, il numero di passaggio, il nome del ricercatore e la data.
   14. Mantenendo la piastra all'interno dell'incubatore di CO₂ , agitare la piastra fronte-retro e lateralmente 2-3 volte per ottenere una distribuzione omogenea delle cellule.
   15. Il giorno successivo, effettuare un lavaggio delicato con DMEM/F12 caldo e aggiungere 2,5 ml di terreno hiPSC con 25 ng/mL di bFGF.
4. HiPSC della sindrome di Down da congelamento e hiPSC euploidi isogene da alimentatori
   NOTA: Durante la procedura di congelamento si deve evitare di eseguire un pipettaggio eccessivo di iPSC umane.
   1. Dividere le hiPSC quando sono ancora nella loro fase logaritmica, cioè 4-5 giorni dopo il passaggio.
   2. Osservare la piastra con le hiPSC per le colonie differenziate e rimuovere le colonie differenziate utilizzando una pipetta da 200 μl sotto uno stereomicroscopio.
   3. Lavare le hiPSC con DMEM/F12 caldo da 1 ml.
   4. Aggiungere 1 mL/pozzetto di soluzione di collagenasi da 1 mg/mL. Tenere la piastra all'interno dell'incubatrice per 8-10 minuti, quindi osservare al microscopio invertito per rilevare eventuali bordi di sollevamento delle colonie.
   5. Aspirare la collagenasi e somministrare 2 lavaggi di DMEM/F12. Quindi aggiungere 1 mL/pozzetto di terreno hiPSC.
   6. Sollevare delicatamente le colonie utilizzando un sollevatore di cellule.
   7. Pipettare delicatamente le colonie nel pozzetto utilizzando un puntale da 1 mL 5-8 volte, a seconda delle dimensioni delle colonie.
   8. Raccogliere tutte le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a temperatura ambiente per 2 minuti a 100 x g.
   9. Aspirare delicatamente il surnatante utilizzando una pipetta, rimuovere il pellet cellulare picchiettando delicatamente sulla provetta e aggiungere 1 mL di terreno hiPSC senza antibiotico integrato con 25 ng/mL di bFGF in base al numero di pozzetti. Erogare le celle nei crioviali.
   10. Aggiungere hiPSC Medium senza antibiotici addizionato con 25 ng/mL di bFGF e 20% di DMSO nei crioviali per ottenere una concentrazione finale del 10% di DMSO.
   11. Metti i crioviali in un bagno gelido con isopropanolo per fornire un congelamento lento.
   12. Mantenere il gelido a -80 °C per una notte. Trasferire le fiale il giorno successivo nel serbatoio LN2.

2. Differenziazione neuronale

NOTA: Preparazione del terreno condizionato con alimentatore (FCM): utilizzare un pallone T-75 e piattare 4 x 10⁶ celle di alimentazione per pallone. Il giorno successivo, aggiungere 40 mL di terreno hiPSC con 4 ng/mL di bFGF. Raccogli per 7 giorni. Conservare la provetta ogni giorno a -20 °C per un massimo di 1 mese. Rivestire una pirofila da 15 cm con 10 mL di gelatina allo 0,1% a 37 °C per almeno 2 ore prima di dissociare le cellule. Rivestire una piastra a 6 pozzetti con matrice di membrana basale qualificata hESC (di seguito denominata "matrice qualificata") 1 giorno prima di dissociare le cellule. Quando si dissociano le cellule nell'intero protocollo, aggiungere 10 μM di RI alla soluzione di distacco cellulare (vedere la Tabella dei materiali), al DPBS e ai terreni di placcatura (FCM integrato con 25 ng/mL di bFGF). Preparare un terreno fresco condizionato con l'alimentatore (FCM) per ogni differenziazione. Evitare il sovrapipettaggio delle hiPSC.

1. Giorno In vitro (DIV) 2: Produzione di singole cellule e semina di hiPSC per la neurodifferenziazione
   1. Aggiungere 10 μM di RI in terreni hiPSC integrati con 25 ng/mL di bFGF, DPBS, soluzione di distacco cellulare e terreno condizionato con alimentatore integrato con 25 ng/mL di bFGF. Scaldare tutti questi reagenti a 37 °C.
   2. Prelevare una piastra a 6 pozzetti di iPSC sugli alimentatori, rimuovere le colonie differenziate e aggiungere terreni hiPSC freschi integrati con 25 ng/mL di bFGF e 10 μM di RI. Conservare la piastra per 2 ore nell'incubatrice.
   3. Estrarre la piastra iPSCs dopo 2 ore e fare un lavaggio con DPBS senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺.
   4. Aggiungere 1 mL/pozzetto di soluzione di distacco cellulare (+ 10 μM di RI) e mantenere la piastra all'interno dell'incubatore di CO₂ per 12-14 minuti.
   5. Dopo 12-14 minuti, osservare le cellule al microscopio invertito; La maggior parte delle cellule inizia a staccarsi dalla piastra. Se alcune cellule aderiscono ancora, picchiettare delicatamente la piastra dai lati.
   6. Diluire la soluzione di distacco cellulare aggiungendo 3 mL/pozzetto di DPBS con Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺ (+ 10 μM di RI). Utilizzando una pipetta da 5 ml, eseguire un pipettaggio delicato 2-3 volte, evitando che le bolle rompano i grumi.
   7. Far passare le celle attraverso un colino da 40 μM.
   8. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 50 mL.
   9. Centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti a 200 x g e aspirare delicatamente il terreno utilizzando VAS.
   10. Risospendere le cellule in 10 mL di terreno hiPSC (+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM di RI). Aggiungere le cellule su un piatto da 15 cm rivestito di gelatina allo 0,1% per 1,5 ore per rimuovere gli alimentatori, poiché gli alimentatori hanno un'adesione preferenziale alla superficie rivestita di gelatina rispetto agli hiPSC.
   11. Dopo 1,5 ore, raccogliere delicatamente il terreno con le celle e centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti a 200 x g. Aspirare i fluidi utilizzando VAS.
   12. Risospendere le cellule in 1 mL di FCM (+ 25 ng/mL di bFGF + 10 μM di RI) e prelevare la conta cellulare.
   13. Utilizzando FCM (+ 25 ng/mL di bFGF + 10 μM di RI), effettuare una sospensione cellulare di 30.000-50.000 cellule/mL e seminare 5 mL di sospensione cellulare/piastra da 60 mm o 2 mL/pozzetto di piastra a 6 pozzetti o 500 μL/pozzetto di piastra a 24 pozzetti. Le piastre devono essere rivestite con una matrice qualificata (vedi Tabella dei materiali).
2. DIV 0: (~48 h dopo): Cambiare il terreno condizionato dall'alimentatore con il terreno NPC (DDM + B27 senza vitamina A + N2) (vedere la Tabella dei materiali).
3. DIV 2: Aggiungere un terreno NPC con 0,125 μM di Dorsomorfina a giorni alterni fino a DIV 18.
4. DIV 18: Aggiungi terreni NPC senza Dorsomorfina e rifornisci a giorni alterni fino a DIV 28.
5. DIV 28-30: Produzione di singole cellule e semina di NPC per la Fase 2
   1. Su DIV 28, estrarre la piastra (contenente NPC) e sostituire il supporto con un supporto NPC (+ 10 μM di RI). Mettere la piastra nell'incubatore CO₂ per 2 ore.
   2. Dopo 2 ore, aspirare il terreno e fare un lavaggio con DPBS (senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺).
   3. Aggiungere 1 mL/pozzetto di soluzione di distacco cellulare (+ 10 μM di RI) e mantenere la piastra all'interno dell'incubatore per 14 minuti.
   4. Dopo 14 minuti, osservare le cellule al microscopio invertito a 4x. La maggior parte delle cellule inizia a staccarsi dalla piastra. Se alcune cellule aderiscono ancora, picchiettare delicatamente la piastra dai lati.
   5. Diluire la soluzione di distacco cellulare aggiungendo 3 mL/pozzetto di DPBS con Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺ (+ 10 μM di RI). Utilizzando una pipetta da 5 ml, eseguire un pipettaggio delicato 2-3 volte, evitando che le bolle rompano i grumi.
   6. Passare attraverso un filtro da 40 μM posizionato su una provetta da centrifuga da 50 mL.
   7. Centrifugare a temperatura ambiente per 5 min a 200 x g. Aspirare delicatamente il terreno utilizzando VAS.
   8. Risospendere le cellule in DDM + B27 con la vitamina A (+ 10 μM di RI).
   9. Contare le cellule vive utilizzando il blu di tripano con un emocitometro.
   10. Seminare 50.000 cellule/pozzetto su una piastra rivestita a matrice qualificata (1x) della piastra a 48 pozzetti.
6. DIV 33: Cambiare il mezzo in mezzo di differenziazione neurale (vedere la Tabella dei Materiali). Cambia il mezzo ogni 5 giorni. Continuare a rifornire il terreno fino a DIV 85/90.

3. Immunocitochimica (ICC)

NOTA: Aggiungere abbastanza tampone in tutte le fasi per coprire le celle ed evitare l'asciugatura del pozzetto durante l'aspirazione durante la fase di lavaggio.

1. Estrarre la piastra cellulare differenziata al di fuori dell'area di coltura cellulare.
2. Aspirare il fluido e lavare con DPBS.
3. Per il fissaggio, aggiungere 1 ml di paraformaldeide al 4% (PFA) alle cellule. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e posizionarla su uno shaker a bilanciere a 37 °C per 30 min.
4. Aspirare il PFA e somministrare tre lavaggi ciascuno di 15 minuti con DPBS (senza Ca⁺⁺ e Mg⁺⁺).
5. Aggiungere tampone bloccante (3% BSA + 5% siero d'asino (o siero dell'animale ospite dell'anticorpo secondario) + 0,2% Triton-X in DPBS) per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Aggiungere 250 μL/pozzetto di anticorpi primari [Ki67 (diluizione 1:100), TUBB3 (diluizione 1:500), PAX6 (1:100)] e incubare per una notte a 4 °C su un agitatore a bilanciere. La diluizione è stata effettuata in una soluzione bloccante.
7. Lavare tre volte con DPBS dopo l'incubazione degli anticorpi primari.
8. Aggiungere 250 μL/pozzetto di anticorpo secondario (diluito 1:250 in 3% BSA + 0,2% Triton-X in DPBS) per 1 ora a temperatura ambiente.
9. Lavare 3 volte con DPBS dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi.
10. Aggiungere DAPI (1: diluizione 1000 di 5 mg/mL di stock in DPBS) per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare tre volte con DPBS. Lasciare l'ultimo lavaggio nella piastra di coltura e osservare al microscopio.

4. Acquisizione e analisi delle immagini

1. Acquisisci immagini utilizzando il microscopio a fluorescenza con risoluzione 20x.
2. Acquisisci immagini di Ki67 e immagini di colorazione TUBB3 utilizzando un filtro di eccitazione da 540 nm, PAX6 utilizzando un filtro di eccitazione da 488 nm e immagini DAPI utilizzando un filtro di eccitazione da 358 nm.
3. Acquisisci immagini da dieci diversi campi casuali per l'analisi.
4. Analizza le immagini ICC utilizzando il software ImageJ.
5. Per l'analisi TUBB3 e PAX6, eseguire la soglia di tutte le immagini per i segnali rosso e verde, rispettivamente, e l'intensità del segnale blu per DAPI. L'intensità media dei pixel rossi di TUBB3 e dei pixel verdi di PAX6 è stata normalizzata con l'intensità media dei pixel blu di DAPI.
6. Per l'analisi Ki67, contare le celle utilizzando la funzione di conteggio automatico delle celle nel software ImageJ. Normalizza il numero di celle Ki67-positive con il numero di celle DAPI-positive.
7. Esegui analisi statistiche utilizzando software statistici e grafici confrontando i due gruppi utilizzando test t spaiati. I dati devono essere espressi come media ± SEM da tre esperimenti indipendenti. Un valore p inferiore a 0,05 è considerato statisticamente significativo.

Le iPSC umane singolarizzate sono state seminate su piastre rivestite di matrice qualificata come sospensioni a singola cellula e la differenziazione è stata avviata rimuovendo il bFGF. Per inibire la differenziazione non ectodermica, la Dorsomorfina, un inibitore del segnale BMP, è stata aggiunta da DIV 2-18²¹. Per un'ulteriore differenziazione delle cellule progenitrici dallo stadio neurogenico, le sospensioni di singole cellule sono state ripiastrate a bassa densità sulla matrice qualificata (Figura 1) per ulteriori 6-10 settimane per osservare la differenziazione neurale precoce. Dopo la fase di differenziazione neurale (Stadio 2), l'analisi del giorno 85 ha rivelato una riduzione significativa dei neuroni TUBB3+ nelle colture di DS rispetto a quelle con cellule euploidi isogeniche (Figura 2A). La quantificazione ha mostrato una diminuzione di circa due volte dei neuroni TUBB3+ nelle colture DS (Figura 2B). Ciò indica che le cellule DS mostrano una ridotta differenziazione neuronale, in linea con le osservazioni delle sezioni cerebrali fetali DS, dimostrando l'affidabilità del modello di neurogenesi DS in vitro utilizzato in questo studio.

Per studiare la causa alla base della riduzione del numero di neuroni nella DS, l'immunocolorazione Ki67 è stata utilizzata per analizzare il ciclo cellulare durante la fase neurogena della neurogenesi. Durante la fase iniziale di questa fase, la maggior parte delle cellule euploidi isogeniche erano Ki67+, indicando una proliferazione cellulare attiva. Al contrario, una percentuale significativamente più bassa di cellule DS era Ki67+ (Figura 2C). L'analisi quantitativa ha rivelato una riduzione di circa quattro volte delle cellule Ki67+ nella DS (Figura 2D), suggerendo che le cellule DS sono rimaste prevalentemente nella fase G0 durante la fase neurogenica iniziale. Ulteriori analisi durante la fase avanzata dello stadio neurogenico hanno rivelato che la maggior parte delle cellule euploidi isogeniche era uscita dal ciclo cellulare, come evidenziato dall'assenza di colorazione Ki67 (Figura 2E). Al contrario, la maggior parte delle cellule DS è rimasta Ki67+ (Figura 2F), indicando la persistenza del ciclo delle cellule progenitrici. I dati quantitativi hanno dimostrato un aumento di circa cinque volte delle cellule Ki67+ nella DS rispetto alle cellule euploidi isogeniche. Questi risultati della prima coppia di DS e hiPSC euploidi isogeniche sono stati convalidati utilizzando una seconda coppia di DS e hiPSC euploidi isogeniche. La seconda coppia ha anche mostrato una ridotta neurogenesi al giorno 85 nelle cellule DS rispetto alle cellule euploidi isogeniche (Figura 2G). L'analisi quantitativa ha mostrato una riduzione di due volte dei neuroni TUBB3+ (Figura 2H) alla conclusione della differenziazione neurale. Inoltre, c'è stato un aumento di oltre due volte delle cellule progenitrici neurali PAX6+ nella DS rispetto alle cellule euploidi isogeniche allo stesso stadio (Figura 2G e Figura 2I). Questi risultati hanno confermato che le cellule progenitrici neurali DS non sono riuscite a uscire dal ciclo cellulare e a differenziarsi in neuroni post-mitotici, coerentemente con un difetto del ciclo cellulare bifasico.

Questo studio, condotto utilizzando due coppie di DS hiPSC e le loro controparti euploidi isogeniche, dimostra che la neurogenesi compromessa osservata nella DS deriva dalla disregolazione bifasica del ciclo cellulare allo stadio neurogenico dello sviluppo dei progenitori neurali. Durante l'induzione neurale, le cellule DS hanno mostrato una ridotta proliferazione nella fase iniziale, seguita da una maggiore proliferazione durante la fase tardiva rispetto alle cellule di controllo. La diminuzione della proliferazione durante la fase iniziale limita le dimensioni del pool neurale dei progenitori, mentre l'aumento della proliferazione durante la fase tardiva ritarda la formazione dei neuroni post-mitotici nella DS.

Figura 1: Illustrazione della neurogenesi delle iPSC umane con sindrome di Down (DS). Le illustrazioni mostrano che la neurogenesi è divisa in due fasi: la fase neurogena e la fase di differenziazione neurale. La differenziazione delle cellule staminali pluripotenti verso lo stadio di progenitore neurale è indicata come stadio neurogenico, mentre la differenziazione dei progenitori neurali verso le cellule del lignaggio neurale è indicata come stadio di differenziazione neurale. L'illustrazione mostra le tempistiche per ogni fase, come osservato in questo protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il difetto del ciclo cellulare bifasico contribuisce alla compromissione della neurogenesi della sindrome di Down (DS). (A) Immagini rappresentative di TUBB3 (rosso), immagini DAPI e la corrispondente sovrapposizione della prima coppia di DS e hiPSC euploidi isogeniche al giorno 85. (B) Quantificazione dell'espressione di TUBB3 normalizzata alla colorazione DAPI tramite immunocitochimica (ICC). (C) Immagini rappresentative di Ki67 (rosso) durante la fase iniziale (DIV 18) dello Stadio 1, con le corrispondenti immagini DAPI e la loro sovrapposizione dalla prima coppia di DS e hiPSC euploidi isogeniche. (D) Quantificazione dell'espressione di Ki67 durante la fase iniziale. (E) Immagini rappresentative di Ki67 durante la fase tardiva (DIV 28) dello Stadio 1, con le corrispondenti immagini DAPI e la loro sovrapposizione dalla prima coppia di DS e hiPSC euploidi isogeniche. (F) Quantificazione dell'espressione di Ki67 durante la fase tardiva. (G) Immagini rappresentative di TUBB3 (rosso), PAX6 (verde) e DAPI dalla seconda coppia di DS e hiPSC euploidi isogeniche. (H) Quantificazione dell'espressione di TUBB3 al giorno 85. (I) Quantificazione dell'espressione di PAX6 al giorno 85. I confronti tra i gruppi sono stati eseguiti utilizzando t-test non appaiati. I dati sono presentati come media ± SEM da tre esperimenti indipendenti, con significatività statistica definita come p < 0,05. Le barre della scala rappresentano 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo lavoro, viene descritto un efficiente protocollo di neurodifferenziazione corticale monostrato non diretto per una coppia isogenica di hiPSC euploidi e hiPSC DS. Poiché le cellule vengono coltivate come monostrati, sono più esposte alle condizioni di coltura, il che non è possibile nella stessa misura dell'utilizzo di corpi embrioidi per differenziare le iPSC, che sono generalmente utilizzate in altri protocolli^14,16. Mentre l'utilità dei sistemi di organoidi è in crescita, il sistema di differenziazione neurale basato su monostrato mantiene i suoi vantaggi nel fornire alle cellule un ambiente di differenziazione omogeneo. Nei sistemi basati su organoidi, a causa della loro natura tridimensionale, potrebbe formarsi un'attività simile a un centro di patterning locale. Inoltre, tutte le cellule degli organoidi non hanno uguale accesso ai fattori di crescita aggiunti esogenamente, portando a un gradiente morfogeno incontrollato, come evidenziato dalla morte cellulare al centro degli organoidi. Sebbene siano stati proposti diversi miglioramenti nei metodi degli organoidi, è necessario convalidare i metodi degli organoidi in base alla loro capacità di ricapitolare i fenotipi osservati nei campioni umani. Come accennato, diversi protocolli precedenti non sono riusciti a ricapitolare la neurogenesi compromessa dalla DS. Pertanto, è stato preferito il metodo basato sul monostrato, che consente condizioni di coltura più controllate durante la neurodifferenziazione. I metodi per la neurodifferenziazione sono in continua evoluzione. Mentre alcuni metodi forniscono una neurodifferenziazione più rapida²², altri forniscono tempi di differenziazione fisiologicamente più rilevanti²³. Inoltre, l'uso di composti non fisiologici, ad esempio DAPT, cAMP o acido ascorbico, o la concentrazione non fisiologica di fattori di crescita come GDNF e BDNF dovrebbero essere valutati dagli utenti prima di utilizzarli per la neurodifferenziazione. I composti o i fattori di crescita aggiunti esogenamente possono mascherare le proprietà intrinseche delle cellule malate e impedire di imitare le condizioni in vivo in un piatto.

Il tasso di successo della neurodifferenziazione dipende dalla qualità delle iPSC prima della semina per la differenziazione. Dovrebbero esserci meno del 10% di colonie differenziate. Una fase critica della procedura sperimentale è che le iPSC devono essere seminate a una bassa densità compresa tra 5000 e 10.000 cellule/cm^{2 e,} per ottenere la dorsalizzazione delle cellule, la dorsomorfina deve essere aggiunta per circa 16 giorni a una bassa concentrazione di 0,125 μM. Un'estesa morte cellulare è osservata a concentrazioni più elevate di Dorsomorfina quando utilizzata con cellule piastrate a bassa densità. La doggina può anche essere aggiunta al posto della dorsomorfina per ridurre la morte cellulare, ma la dorsofrina è stata utilizzata per ridurre l'alto costo associato alla noggina. La placcatura delle cellule ad alta densità riduce la differenziazione neurale e può anche promuovere le popolazioni neurali del mesencefalo e del rombencefalo²⁴. Poiché iPSC diverse possono variare nel loro tasso di proliferazione, la densità di placcatura iniziale deve essere testata per ogni nuova linea hiPSC. Inoltre, se le cellule staminali pluripotenti mostrano un'ampia proliferazione, le cellule possono essere scisse intorno al 20° giorno. Questo protocollo sarà utile nello studio dell'effetto dei geni del cromosoma 21 sulla neurogenesi della DS e può essere utilizzato per lo screening farmacologico.

Il limite principale di questo protocollo è una lunga durata fino a 85-90 giorni per differenziarsi in neuroni. Inoltre, è stato osservato che le tempistiche per la fase iniziale, la fase tardiva e lo stadio terminale possono differire durante la neurodifferenziazione di ulteriori linee di hiPSCs, ma si possono ancora osservare difetti del ciclo cellulare bifasico durante la neurodifferenziazione della DS. Le differenze osservate in diverse iPSC potrebbero essere dovute a differenze intrinseche nelle hiPSC dovute alla natura stocastica del processo di riprogrammazione o a differenze nel numero di passaggi.

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Gli autori ringraziano il Prof. Stuart H. Orkin per averci fornito un paio di hiPSC euploidi isogeniche con sindrome di Down. Gli autori sono anche grati al National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS) di Pune per aver fornito i finanziamenti necessari per svolgere questo lavoro.