Флуоресцентная визуализация в течение жизни NAD(P)H для метаболического анализа кишечника мышей и паразитов во время инфекции нематодами

В настоящем протоколе описана флуоресцентная визуализация NAD(P)H эксплантированного кишечника мышей, инфицированного природным паразитом Heligmosomoides polygyrus, что позволяет исследовать метаболические процессы как в тканях хозяина, так и в тканях паразита в пространственном разрешении.

Паразиты, как правило, оказывают негативное влияние на здоровье своего хозяина. Они представляют собой огромное бремя для здоровья, поскольку в глобальном масштабе влияют на здоровье инфицированного человека или животного в долгосрочной перспективе и, таким образом, влияют на сельскохозяйственные и социально-экономические результаты. Тем не менее, были описаны иммунорегуляторные эффекты, вызванные паразитами, с потенциальной терапевтической значимостью для аутоиммунных заболеваний. В то время как метаболизм как у хозяина, так и у паразитов способствует их защите и является основой выживания нематод в кишечнике, он остается в значительной степени малоизученным из-за отсутствия адекватных технологий. Мы разработали и применили флуоресцентную визуализацию NAD(P)H в течение жизни эксплантированной мышиной кишечной ткани во время заражения природной нематодой Heligmosomoides polygyrus для изучения метаболических процессов как у хозяина, так и у паразитов в пространственном разрешении. Использование времени жизни флуоресценции коферментов никотинамидадениндинуклеотида (NADH) и никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH), далее NAD(P)H, которые сохраняются у разных видов, зависит от их связывающего статуса и места связывания на ферментах, катализирующих метаболические процессы. Сосредоточив внимание на наиболее широко экспрессируемых NAD(P)H-зависимых ферментах, были выделены метаболические пути, связанные с анаэробным гликолизом, окислительным фосфорилированием/аэробным гликолизом и окислительным взрывом на основе NOX, в качестве основного защитного механизма, а также охарактеризованы метаболические перекрестные помехи между хозяином и паразитом во время инфекции.

Паразитарные инфекции ложатся огромной нагрузкой на здоровье человека ^1,2. Корреляция между ростом аутоиммунных заболеваний и снижением паразитарных инфекций наблюдается в промышленно развитых странах. Известно, что паразиты могут оказывать благотворное воздействие, подавляя чрезмерные иммунные реакции хозяина. H. polygyrus является природным паразитом, обнаруженным в кишечнике грызунов, и известно, что этот паразит индуцирует иммунорегуляторные механизмы, которые снижают антипаразитарный иммунный ответ хозяина посредством, среди прочего, индукции регуляторных Т-клеток (Treg) у инфицированного хозяина 3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Эти регуляторные механизмы особенно интересны при дегенеративных аутоиммунных заболеваниях.

Анализ метаболических взаимодействий между хозяином и кишечными нематодами остается широко игнорируемым, хотя метаболизм играет важную роль как в организме хозяина, так и в паразитах для защиты, выживания и функционирования. Мы предлагаем адаптировать и применять флуоресцентную визуализацию NADH и NADPH в течение жизни при двухфотонном возбуждении, технологию, уже широко используемую в различных физиологических и патофизиологических ситуациях в клетках и тканях млекопитающих12, для исследования корреляционного метаболизма хозяина и нематоды в живых тканях.

NADH и NADPH, называемые NAD(P)H, являются вездесущими молекулами, которые сохраняются во всех клеточных формах жизни и играют роль коферментов в различных метаболических путях. Например, они участвуют в производстве энергии, восстановительном биосинтезе и производстве активных форм кислорода (АФК), опосредованных NADPH-оксидазой, которые в основном связаны с защитой клеток и клеточной коммуникацией 13,14,15,16,17,20. Оба кофермента излучают флуоресценцию на длине волны ~450 нм при двухфотонном возбуждении на длине волны 750 нм, что позволяет проводить безмаркерную метаболическую визуализацию в клетках и тканях^19,21. Возбуждение как NADH, так и NADPH только одной длиной волны возможно благодаря их схожим и довольно широким спектрам двухфотонного возбуждения²¹.

Время жизни коэнзима NAD(P)H во флуоресценции напрямую зависит от фермента, с которым он связывается 18,21,22,23. Благодаря своей химической структуре, позволяющей осуществлять внутримолекулярный перенос энергии, возбужденная молекула NADH или NADPH теряет энергию в результате внутренних процессов преобразования, со скоростью, зависящей от ее связывающих свойств, ферментам (катализатору), прежде чем она расслабится и испустит флуоресцентный фотон. Это время жизни дает представление о сайте связывания NAD(P)H на ферменте и, таким образом, о преимущественной биохимической реакции, протекающей 19,21,22,23,24,25. Время жизни флуоресценции свободных молекул NADH и NADPH составляет ~450 пс, в то время как время их жизни флуоресценции при связывании с ферментом значительно больше (~2000 пс) и зависит от места их связывания на соответствующем ферменте²¹.

Существует более 370 ферментов, участвующих в процессах, связанных с NAD(P)H; однако только наиболее распространенные из них смогут внести свой вклад в результирующее время жизни флуоресценции NAD(P)H в диапазоне возбуждения микроскопа. Используя данные RNASeq из клеток млекопитающих, мы идентифицировали наиболее распространенные NAD(P)H-зависимые ферменты и сгенерировали ссылку на время жизни флуоресценции для интерпретации данных, полученных в образцах тканей и клеток¹⁸. Таким образом, в данной работе проводилось различие, например, между преимущественной активностью лактатдегидрогеназы (ЛДГ), которая связана с анаэробными гликолитическими метаболическими путями, и активностью изоцитратдегидрогеназы (ИДГ) и пируватдегидрогеназы (ПДГ), которые в основном участвуют в аэробных метаболических путях гликолиза/окислительного фосфорилирования^16,20. Кроме того, связывание NADPH с NADPH-оксидазами, которые являются ферментами, в основном ответственными за окислительный взрыв, может быть легко устранено благодаря характерному расположению этих ферментов в клетке (мембранно-связанному) и из-за особенно длительного времени жизни флуоресценции NADPH (3,650 пс)18,24,29,30,32. Данные RNASeq от H. polygyrus показывают, что эталон, полученный для клеток млекопитающих, также применим в адаптированной форме к этой нематоде²⁷.

Таким образом, в данной работе путем проведения флуоресцентной визуализации (FLIM) NAD(P)H в свежеэксплантированных образцах двенадцатиперстной кишки мышей, инфицированных H. polygyrus, была получена информация о соотношении между свободным и связанным с ферментом NAD(P)H, которая отражала общую метаболическую активность во всех тканях, а также преимущественно активный фермент в каждом пикселе изображения (т.е. фермент, с которым NAD(P)H преимущественно связывается в этом конкретном месте). Успех этих экспериментов зависит от точной подготовки образцов эксплантированной кишки, надежной визуализации времени жизни флуоресценции NAD(P)H в реальном времени с субклеточным разрешением и стандартизированной оценки данных, как описано в этом протоколе.

Все эксперименты проводились в соответствии с Национальным руководством по защите животных и одобрены Немецким комитетом по этике животных по защите животных (G0176/16 и G0207/19). Протокол описывает данные флуоресцентной визуализации NAD(P)H в течение жизни и оценку данных, которые позволяют оценить общую метаболическую активность и специфические метаболические пути как в кишечнике хозяина, так и у паразитов при заражении естественной мышиной кишечной нематодой, H. polygyrus. С этой целью самки мышей C57BL/6 в возрасте 10-12 недель были инфицированы 200 личинками 3 стадии (L3). В разные моменты инфекции инфицированных мышей умерщвляли, а двенадцатиперстную кишку вырезали и подготавливали к визуализации, как описано ранее³³. Двенадцатиперстная кишка неинфицированных мышей соответствующего возраста и пола была аналогичным образом подготовлена и визуализирована для целей контроля. Для поддержания свойств тканей, необходимых для дальнейшей визуализации и анализа, образцы должны быть обработаны сразу после эксплантации, а следующие шаги (шаги 1.1-1.7) должны быть выполнены быстро (рис. 1В).

1. Подготовка образцов

1. Отрежьте куски длиной ~1 см от первоначально иссеченной двенадцатиперстной кишки.
2. Склейте выпрямленную тканевую трубку в середину небольшой чашки Петри быстроотверждаемым тканевым клеем (диаметр 47 мм, высота обода 10 мм, см. Таблицу материалов) (Рисунок 1А2).
3. Нанесите тонкий слой дополнительного клея на дно чашки Петри на большую площадь вокруг ткани с помощью микрокисточки (рисунок 1А2).
4. Тупыми ножницами сделайте разрез по всей длине физически неподвижной кишки в районе дна чашки Петри (рисунок 1А3).
5. Разверните кишечник тупым пинцетом так, чтобы алюминальная сторона полностью соприкасалась с клеем. Таким образом, кишечник фиксируется клеем просветной стороной вверх (рис. 1А4).
   1. В случае инфицированной мыши подсчитайте червей под стереомикроскопом (увеличение 10x), чтобы убедиться, что заражение прошло успешно (рис. 1A5).
6. Запечатайте кишечник агарозой, чтобы защитить его от пересыхания. Здесь 0,5%-0,9% агарозы использовалась для защиты чувствительной кишечной ткани от ожога из-за ее низкой температуры плавления около 38 °C. Наберите 1 мл агарозы в пипетку и осторожно сбрызните кишечник так, чтобы кончик пипетки и ткань были полностью закрыты тонким слоем толщиной около 0,5 мм (рис. 1A6).
7. Заполните чашки Петри образцами, запечатанными в агарозу с PBS (10%) при комнатной температуре, а затем закройте их крышкой. Либо визуализируйте образцы напрямую, либо поместите их на лед в теплоизоляционный бокс, чтобы встать в очередь на измерение. Поместите первый подготовленный образец под объектив микроскопа на нагревательную пластину, установленную на 37 °C (Рисунок 1A8).

2. Визуализация

Микроскопическая система, используемая для проведения NAD(P)H-FLIM в инфицированных и здоровых образцах ткани двенадцатиперстной кишки, состоит из устройств, перечисленных и описанных на рисунке 2 и в таблице материалов. Используйте ImSpector 208 в качестве управляющего программного обеспечения для всех используемых модулей.

1. Чтобы изначально найти интересующую область (ROI), поместите образец в чашку Петри под объективом и двигайтесь вдоль плоскости x и y вручную, чтобы найти подходящий ROI путем визуального осмотра в режиме широкопольной флуоресцентной микроскопии.
2. Переключите систему формирования изображений на двухфотонное возбуждение с помощью детектирования ФЭУ или детектирования однофотонного подсчета с корреляцией по времени (TCSPC) путем переключения режимов в программном обеспечении. Обратите особое внимание на то, чтобы окружающая среда была темной и свободной от вибрации, закройте микроскоп светонепроницаемыми шторами и, по возможности, используйте пневматический подвесной оптический стол.
3. Погрузите линзу объектива в чашку Петри, содержащую образец, с помощью управляющего программного обеспечения, щелкнув значок системы линз и повернув колесико мыши, чтобы изменить положение Z.
4. Настройте лазер на 765 нм и установите максимальную мощность лазера на 10 %, что соответствует 30 мВт под объективом, введя желаемую длину волны на панели длин волн программного обеспечения. При необходимости отрегулируйте мощность лазера. Измерьте коэффициент усиления ниже 40% (от ~30 мВт до 100 мВт), чтобы избежать фотоповреждения тканей и нежелательных метаболических сдвигов.
5. В программном обеспечении установите размер шага z-ступени на 2 мкм, что соответствует осевому разрешению микроскопа при 765 нм в тканях.
6. Установите частоту сканирования линии на 400 Гц на панели гальванического зеркала, в результате чего время задержки пикселей составит 4,95 мкс.
7. Установите усреднение изображений по двум-четырем изображениям, выбрав усредненное число в раскрывающемся меню в программном обеспечении (т. е. отсканируйте ROI от двух до четырех раз, чтобы получить более плавные изображения). Таким образом, общее время задержки пикселей увеличивается до 9,9-19,8 мкс за счет более высокого отношения сигнал/шум (SNR) в процессе анализа.
8. Установите поле зрения изображения (FOV) на 505 x 505 пикселей (500 x 500 μm²), выбрав параметры на панели FOV в программном обеспечении.
9. Для каждого измерения заранее откалибруйте время модуля, чтобы обеспечить оптимальную работу электроники TCSPC, нажав кнопку «Инициализировать» в окне калибровки в меню оборудования TCSPC.
10. Отрегулируйте быстрый фотодиод внешне, чтобы обнаружить последовательность импульсов лазера Ti:Sa с помощью быстрого осциллографа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал фотодиода используется для запуска детектирования hPMT и подсчета фотонов TCSPC по отношению к импульсу возбуждения. Детектирование повторяется каждые 12,5 нс (т.е. время между двумя последовательными лазерными импульсами), что соответствует частоте повторения лазера Ti:Sa (80 МГц).
11. Определите диапазон глубины измерения, сначала установив усреднение на 1 и усиление мощности лазера на ~10%, затем запустите видеорежим (нажмите на кнопку видео ), найдите глубину, с которой сигнал все еще может быть получен, снова щелкнув значок системы объективов , и используя колесико мыши для перехода к образцу с постепенным увеличением усиления.
12. Для получения изображений образцов тканей NAD(P)H-FLIM, измеренных в режиме FLIM, установите систему на 765 нм при максимальной номинальной мощности 100 мВт. Детектирование флуоресцентного сигнала NAD(P)H (466/60 нм) с помощью гибридной ФЭУ с коэффициентом усиления 97%, который задан в программном обеспечении. Модуль TCSPC подсчитывает фотоны по 227 временным окнам (ячейкам), каждое из которых имеет длительность 55 пс.
13. Щелкните правой кнопкой мыши по отображаемому изображению во время измерения в программном обеспечении и выберите отображение > T-PROFILE , чтобы визуализировать кривую затухания, полученную системой.
14. Обратите внимание на количество столбцов перед лазерным импульсом на кривой затухания для последующего анализа.
15. Получите данные, нажав на кнопку «Начать измерение».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные должны соответствовать определенному формату. Каждый срез, записанный на любой глубине ткани, разделен расстоянием 2 мкм и имеет площадь 500 мкм x 500 мкм, а срезы получены в виде стопки срезов размером 500 мкм x 500 мкм с временными точками 227 x 55 пс (рис. 3A). Каждый воксель содержит гистограмму времени прихода фотонов с пространственным разрешением (в плоскости x и y). Это представляет собой затухание флуоресценции (рис. 3B). Обычно измеряемый объем должен иметь форму гиперстека с размерами ~500 мкм x 500 мкм x 100-300 мкм и 227 ячейками, где каждый срез в z-плоскости содержит зависящие от времени данные об интенсивности, как описано выше. Для примерного набора данных измерений это дает (505 x 505 x 227) x 100 пикселей (16 бит) и соответствует примерно 4 ГБ.

3. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для векторного анализа изображений NAD(P)H-FLIM программа для вычисления времен жизни представляет собой специально написанный код на языке Python³³.

1. Используйте Anaconda с дистрибутивом Python 3.7 в интегрированной среде разработки Spyder (см. Таблицу материалов). В коде используются стандартные библиотеки Python.
2. Загрузите код в среду IDE и выполните его. Откроется диалоговое окно с путями к файлу.
3. Выберите папку с исходными данными для анализа. Код запрограммирован на выбор трех параметров перед анализом через диалоговое окно пользовательского ввода Tkinter с флажками, выпадающим меню и текстовыми полями.
4. Выберите смещение в диалоговом окне ввода. Определите смещение как количество первых срезов в стеке времени, которые не анализируются.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметр сокращает временные точки перед импульсом возбуждения. При калибровке системы и пускового диода это значение должно составлять примерно пять срезов или количество мертвых ячеек до возбуждения лазера, как описано в шаге 2.14.
5. Выберите представление векторных графиков в раскрывающемся меню диалогового окна ввода. Здесь выберите внешний вид точек данных (облачный или топографический), а также координаты полукруглой оси времени (энзимы или время [ps]) в качестве опций из выпадающего меню.
6. Нажмите на OK.
7. Убедитесь, что код вычисляет два типа информации из z-стеков NAD(P)H-FLIM.
   1. Во-первых, измерьте пространственную информацию каждого объемного среза по коллапсу стеков TCSPC, где 227 гистограмм подсчета фотонов с временным разрешением проецируются на один срез, называемый проекционным изображением интенсивности (рисунок 3G), и из анализа экспоненциальных кривых распада на основе Фурье (как описано Leben et al.18), и из нормализованной действительной и мнимой части для каждого пикселя в каждом объемном срезе (рисунок 3C).
   2. Из вещественных и мнимых изображений получите векторные графики (рисунок 3D) и изображение среднего времени жизни флуоресценции (t) (цветовая кодировка, пространственно разрешенные средние константы распада для каждого воксела) (рисунок 3E).
      Примечание: Как описано во введении, время жизни флуоресценции NAD(P)H при связывании с ферментами определяется сайтом связывания кофермента с соответствующим ферментом.
   3. Определите вклад соответствующего фермента в метаболическую активность путем создания вектора между фазовым вектором каждого пикселя и фазовым вектором несвязанного NAD(P)H и проецирования его на полукруг на векторном графике. Полукруг представляет все возможные моноэкспоненциальные распады времен жизни флуоресценции в чистых соединениях.
   4. Используя ранее сгенерированный эталон времени жизни флуоресценции NAD(P)H, связанного с наиболее распространенными NAD(P)H-зависимыми ферментами^18,33 (дополнительный рисунок 1), и рассчитав вероятность активации этих ферментов.
      Примечание: Цветовой код наиболее доминирующего фермента (т.е. фермента, для которого рассчитана наибольшая вероятность активации) присваивается каждому пикселю, таким образом, создается карта ферментов (рис. 3F).
8. Исходя из соотношения свободного (несвязанного) и связанного с ферментом NAD(P)H, в частности, из векторного соотношения на векторном графике между свободным NAD(P)H при 450 пс и фермент-связанным состоянием, рассчитайте общую метаболическую активность в процентном соотношении от 0% *только несвязанный NAD(P)H) до 100% (только связанный с ферментом NAD(P)H). Путем присвоения значения метаболической активности (0%-100%) каждому пикселю создается карта активности (с цветовой кодировкой) (рис. 3F).
9. Наложите полученные карты на изображения интенсивности, чтобы получить дополнительную морфологическую информацию. Здесь используйте макрос ImageJ (см. Таблицу материалов) для наложения оттенка и насыщенности карты фермента или активности на яркость изображений интенсивности.
   1. Убедитесь, что макрос выполняет итерацию по всему стеку. Для каждого среза (глубины) в стеке он должен разделить изображение интенсивности и выбранную карту соответственно на HUE, SATURATION и BRIGHTNESS (тип изображения > > стеке HSB).
   2. Разделите основные каналы для обоих стеков HSB (стеки изображений > > стек в образы).
   3. Закройте ОТТЕНОК и НАСЫЩЕННОСТЬ стека интенсивности, а также ЯРКОСТЬ стека карты (close(slicename_HUE), close(slicename_BRIGHTNESS), ...).
   4. Объедините оставшиеся каналы, чтобы сформировать новый стек HSB, состоящий из значений HUE и SATURATION из среза интересующей карты и BRIGHTNESS из изображения интенсивности (Image > stacks > images to stack).
   5. Измените тип изображения на RGB для лучшего визуального оформления (Тип изображения > > цвет RGB).

4. Сегментация тканей

Примечание: Используйте предварительно обученную сеть на основе U-NET (ILASTIK, см. Таблицу материалов) для сегментации кишечного хозяина и ткани нематоды соответственно, и, кроме того, собственного эпителия и собственной пластинки в организме хозяина, а также областей с высоким флуоресцентным сигналом NAD(P)H и низким флуоресцентным сигнальным участком NAD(P)H в нематоде.

1. Откройте ILASTIK и выберите новый проект и классификацию пикселей.
2. Загрузите ранее рассчитанную проекцию интенсивности из шага 3.7.1, нажав на кнопку Добавить новую > Добавить отдельные изображения. Загрузите в контейнер случайные срезы из нескольких измерений.
3. Нажмите на Выбор функций > выбрать функции. Добавьте значение сигма 50 (безразмерный вес) и отметьте галочкой все активные.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как значение сигма определяет вес объектов, объекты определяют классы и способность сети распознавать ребра, формы, текстуру или цвет.
4. Нажмите на кнопку «Тренировка» и назовите метки в соответствии с тканью, которую необходимо сегментировать (например, «Эпителий», «Фон» и т. д.), щелкнув по ним. Выберите метку и раскрасьте все пиксели изображения, соответствующие этой метке.
5. Повторите то же самое для других надписей.
6. Повторите эти действия примерно для половины изображений в загруженном наборе данных.
7. Нажмите « Обновление в реальном времени» и позвольте модели спрогнозировать метки для оставшихся изображений без меток.
8. Исправьте примерно половину только предсказанных и непомеченных изображений, переименовав ошибочно оцененные сегментации, и повторите оперативное обновление.
9. Повторяйте этот шаг до тех пор, пока сеть не научится правильно оценивать интересующую вас ткань; Убедитесь, что достоверность сети, отображаемая слева рядом с именами меток, находится в диапазоне от 95% до 98%.
10. Загрузите новый набор данных, как описано в шаге 3.11, на этот раз со всеми срезами из одного измерения, и нажмите « Экспорт прогнозов».
11. В выпадающем меню «Источник» выберите «Простая сегментация»; в поле "Формат" выберите вывод в формате tiff; и в разделе «Выбрать настройки экспорта изображения» выберите путь сохранения для вывода. Нажмите на экспорт.
12. При этом создаются бинарные маски для интересующего вас типа ткани. Поскольку они состоят из срезов, в которых сегментированная ткань, представляющая интерес, имеет значение пикселя 1, а остальная — 0 (рисунок 3H), просто умножьте двоичные маски на сгенерированные данные, как указано в шаге 1.1 и шагах 1.4-1.7. Это приводит к маскировке данных (рис. 3 I, J, M). Используйте ImageJ для этого шага (Процесс > Калькулятор изображений > умножения).
13. Для каждого объемного среза рассчитайте отношение сигнал/шум (SNR) по замаскированным изображениям интенсивности. Для этой цели используйте макрос ImageJ. Создайте программу таким образом, чтобы она рассчитывала отношение сигнал/шум (SNR) из сегментированных и замаскированных изображений.
    1. Используйте сегментированный фон из шага 3.21 в качестве фона (BG) и сегментированную ткань интереса в качестве сигнала (SIG), перебирая каждый пиксель каждого среза со значением больше 0 с двумя вложенными циклами for. Вычислите отношение сигнал/шум по следующей формуле³³:
       
       где mean SIG — среднее значение гистограммы сигнала, mean BG — среднее значение фоновой гистограммы, а std BG — стандартное отклонение фоновой гистограммы.
    2. Отбросьте срезы объема со значением SNR ниже 5 из дальнейшего анализа.
14. С помощью скрипта Python^18,33 можно создать график частоты ферментов на основе карт ферментов для каждого типа тканей путем суммирования и усреднения ферментов по срезам, а затем нормализовать их до объема ткани в 100 мкм³ (рисунок 3K, N).
    1. Запрограммируйте скрипт таким образом, чтобы он загружал замаскированную карту ферментов.
    2. Переберите каждый пиксель, вычислите сумму пикселей одного и того же фермента, а затем разделите на анализируемый объем (сумму всех пикселей).
    3. Сгруппируйте рассчитанную распространенность в их метаболических состояниях и усредните, разделив на количество ферментов в каждой группе. Напишите код, который приписывает метаболические состояния, сгруппированные вокруг ЛДГ, анаэробным гликолизоподобным путям, активность ферментов, сгруппированных вокруг PDH/IDH/GAPDH, аэробному гликолизу/oxPhos-подобным путям, а активность NADPH-оксидазы (активность NOX) окислительному взрыву/окислительному стрессу, используемому для защиты (рис. 3L, O).
    4. Используйте библиотеку matplotlib из Python для визуализации данных с помощью блочных графиков.
15. Рассчитайте активность ткани по замаскированным картам активности (рис. 3F) как среднее значение по каждому объемному срезу для всех пикселей со значением больше 0 с помощью макроса ImageJ, выполнив команду Analyze > Measure.
16. Визуализируйте все сгенерированные изображения рядом с помощью ImageJ/FIJI.

Используя текущую процедуру NAD(P)H-FLIM 28,29,33 в сочетании с описанным методом фазорного анализа, метаболическую активность и метаболические пути в здоровой и инфицированной двенадцатиперстной кишке измеряли на 6-й, 10-й, 12-й и 14-й день после инфицирования мышиной кишечной нематодой H. polygyrus.

Сохраненная жизнеспособность кишечной ткани в иссеченной двенадцатиперстной кишке, выявленная с помощью NAD(P)H-FLIM
Для того чтобы исследовать активность тканей ex vivo и определить, как долго удаленные образцы тканей остаются метаболически активными по сравнению с тканями живых организмов, NAD(P)H-FLIM проводили на иссеченной ткани двенадцатиперстной кишки здоровых мышей, которые были (i) только что иссечены или (ii) содержались на льду в течение 3 ч, и результаты сравнивались с уже опубликованными данными NAD(P)H-FLIM, полученными в кишечнике мышей, находящихся под^{наркозом 32}. Подготовку иссеченной двенадцатиперстной кишки и эксперимент с визуализацией проводили, как описано в протоколе подготовки образца (этап 1).

Время жизни флуоресценции NAD(P)H измеряли в течение 3 ч и на четырех различных глубинах тканей (кончик ворсинок: ~0 мкм, верхние ворсинки: ~−50 мкм, нижние ворсинки: ~−100 мкм, основание ворсинок: ~−200 мкм). На основе полученных таким образом данных NAD(P)H-FLIM были построены карты активности, показывающие общую метаболическую активность в различных областях ворсинок с течением времени. Общая метаболическая активность (свободный до связанного с ферментами NAD(P)H) считается показателем дегенерации ткани (рис. 4A, B).

Вторая серия измерений с аналогичными образцами тканей была проведена с другим кусочком кишечника. Здесь измерения не проводились сразу после жертвоприношения, а ткань помещали на лед на 3 часа после подготовки, чтобы имитировать максимальное время ожидания для образцов, помещенных на лед в реальном эксперименте. После времени разогрева ~15 минут с использованием нагревательной пластины была выполнена визуализация на разной глубине тканей (рис. 4C, D). Метаболическая активность, измеренная в двух ранее описанных установках, хорошо согласуется с метаболической активностью, измеренной с помощью NAD(P)H-FLIM в прижизненных условиях в кишечнике мышей³².

Определение различной метаболической и ферментативной активности в кишечной ткани хозяина и H. polygyrus в течение острой инфекции с помощью NAD(P)H-FLIM
В течение болезни с 6-го дня после заражения, когда личинки глистов развиваются в подслизистой оболочке, прорываются в просвет на 10-е сутки и проникают в кишечную нишу, наблюдалось повышение общей метаболической активности паразитов. Из более спящего состояния на 6-й день 58,0% ± 2,2% метаболическая активность неуклонно возрастала до 73,1% ± 5,9%.

Исходное состояние паразита при раннем заражении отражается на его метаболических отпечатках пальцев; В частности, на 6-й день выработка энергии была сбалансирована между анаэробным и аэробным путями, что указывает на неминуемый прорыв в просвет. Затем произошел сдвиг в производстве энергии в сторону сильно анаэробного гликолиза, по-видимому, из-за возросшей потребности в энергии для миграции в просвет (10-й день), и позже у паразитов проявился окислительный путь фосфорилирования/аэробного гликолиза, подобный производству энергии (измерено до 14-го дня). Общая метаболическая активность хозяина оставалась сопоставимой со здоровым состоянием на уровне 74,0% ± 7,6% (с 6 по 14 день), в то время как метаболические пути в тканях хозяина были преимущественно аэробными/окислительными фосфорилированием в течение острой инфекции.

Защитная реакция паразитов основана на активации DUOX2, как единственного представителя семейства NADPH-оксидаз у этого вида. Эта реакция незначительна на ранней стадии инфекции, на 6-й день, но усиливается в более поздние моменты времени во время острой инфекции. (Рисунок 5E, F)

Воспалительное поведение хозяина, с другой стороны, резко возросло по сравнению со здоровым состоянием на 10-й день после заражения, с появлением паразита в просвете, и прекратилось позже на 14-й день после заражения. Такое поведение соответствует тому факту, что паразиты индуцируют регуляторный фенотип в иммунной системе хозяина на более поздних стадиях (хронических) стадиях инфекции ^4,6,7 (рис. 5A-D).

Рисунок 1: Подготовка кишечной ткани мыши к NAD(P)H-FLIM с помощью многофотонного лазерного сканирующего микроскопа. (A) Подготовка требует удаления кусочка кишечника и обрезки его примерно до 1 см в длину (1), нанесения тканевого клея на чашку Петри и помещения на нее трубки (2), продольного разрезания трубки тупыми ножницами у дна (3), разворачивание трубки для открытия просветной стороны тупыми щипцами (4), подсчет червей под стереомикроскопом (5), запечатывание ткани агарозой низкой концентрации тонким слоем толщиной около 0,5 мм (6), заполнение чашки 10 % PBS (7) и визуализация образца ткани или помещение его на лед в ожидании обработки (8). (B) Ось времени для обработки одного образца ткани в минутах от удаления двенадцатиперстной кишки до помещения под микроскоп. Время измерения образца включало в себя нахождение ROI, нагрев охлажденных образцов на нагревательном элементе до 37 °C за это время, а затем получение изображений. (C) Среднее время измерения в 45 минут (определенное впоследствии по данным) показано на графике (C) в зависимости от четырех исследуемых стадий инфекции, а также здоровых тканей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Схема экспериментальной установки. Система состоит из перестраиваемого титаново-сапфирового лазера Ti:Sa LASER Chameleon ULTRA II (690-1,080 нм, 80 МГц, длительность импульса 140 фс) с коммерческой сканирующей головкой Trimscope II. Объектив с водяным погружением (20x, NA 1,05) фокусирует возбуждающий свет. Система дихроичных зеркал, интерференционных фильтров (525/50 нм, 593/40 нм, 655/40 нм) и ФЭУ обнаруживает сигнал флуоресценции. Данные о времени жизни флуоресценции детектируются с помощью гибридной ФЭУ (GaAsP) (hPMT) в канале 466/60 нм, которая охлаждается модулем охлаждения (КМ) и подключена к коррелированному по времени модулю подсчета одиночных фотонов; этот процесс включает в себя детектирование фотонов в интервале 55 пс и сбор данных в течение 9 нс с гауссовской функцией отклика прибора 250 пс FWHM (TCSPC). Для запуска TCSPC 5–8% от интенсивности начального импульса отделяется от возбуждающего пучка и перенаправляется в сверхбыстрый фотодиод (ЧР). Для получения двухфотонного возбуждения в режиме реального времени без TCSPC используются ФЭУ с цветными фильтрами (525 нм, 593 нм, 655 нм). Широкополосная ртутная лампа (ВИ) и глазной путь используются для наблюдения зонда (ОП) для визуальной флуоресцентной микроскопии и позиционирования образца, а ROI обнаруживается с помощью прижизненной стадии (ИИ) с размером шага 1 мкм (ИС). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Векторный анализ данных NAD(P)H-FLIM во временной области. (A) Исходные данные собираются в четырех измерениях: пространственная информация (x, y, z; 505 пикселей = 500 мкм для xy) и данные TCSPC (227 временных точек по 55 пс каждая для t). (B) Каждый пиксель в исходных данных TCSPC вдоль t, как показано на рисунке (A), содержит затухание интенсивности флуоресценции после импульса возбуждения в 227 временных интервалах по 55 пс каждый. Данные TCSPC во временной области предварительно свертываются по Гауссу и переносятся в виртуальную фазовую область путем вычисления нормализованного дискретного численного преобразования Фурье (векторный подход). Это приводит к комплексному числу каждого пикселя в изображении, содержащем действительную и мнимую часть, и это может быть разделено и представлено в виде двух изображений с кодированием интенсивности на каждый измеренный срез: (C, слева) действительная часть и (C, справа) мнимая часть. (D) Действительная и мнимая части предоставляют координаты на векторном графике, где каждая точка на графике имеет пространственный аналог и информацию о ее распаде из (B). Полукруглая ось времени показывает моноэкспоненциальные времена жизни. (E) Время жизни флуоресценции рассчитывается и кодируется цветом из (C) с использованием непрерывного (обратного) преобразования Фурье. Это эквивалентно моноэкспоненциальному анализу кривой затухания интенсивности в точке (B). В соответствии с ранее разработанной структурой анализа (F, справа) создается карта NAD(P)H-зависимых ферментов и (F, слева) карта ферментативной активности. (G) Параллельно первичные данные TCSPC сворачиваются в проекцию интенсивности, теряя временную информацию и сохраняя только пространственную информацию. (H) Исходя из этого, маски генерируются с помощью ILASTIK для желаемой ткани, представляющей интерес, с помощью обученных алгоритмов сегментации, которые накладываются на проекцию интенсивности; Здесь показан пример для паразита (I, слева) и (I, справа) хозяина на 14-й день после заражения. (J, слева) Замаскированная карта активности и замаскированная карта ферментов (J, справа) паразита и (M) ткани хозяина. На основе замаскированных карт генерируются графики частоты ферментов для паразита путем подсчета ферментов и нормализации процента содержания до 100^мкм3 (К). После анализа Liublin et ^al.33 распространенность ферментов была сгруппирована в соответствии с метаболическими путями аэробного гликолиза и окислительного фосфорилирования/анаэробного гликолиза, а также окислительным взрывом и метаболически неактивным состоянием (несвязанным, свободным NAD(P)H) для (L) паразита и для (N,O) ткани хозяина. Все масштабные линейки имеют размер 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Предварительная оценка жизнеспособности эксплантированной ткани. (A) Карта ферментативной активности только что эксплантированной двенадцатиперстной кишки здоровой мыши C57/bl6, как описано в разделе 3. Ткань визуализировали непосредственно после препарирования с интервалом в 20 минут в течение 106 минут в общей сложности на нагревательной пластине при 37 °C. Измерения проводились на четырех различных глубинах тканей: кончики ворсинок (0 мкм), верхняя середина (−50 мкм), нижняя середина (−100 мкм) и основание ворсинок (−200 мкм). Примеры, показанные на рисунке (А), представляют собой верхнюю среднюю область ворсинок через 5 минут и через 68 минут после приготовления. Для каждой точки измерения ферментативная активность, усредненная по всем глубинам, рассчитывалась на основе сегментированных карт активности собственной пластинки и эпителиальной ткани и строилась на графике за время измерения. (B) График показывает жизнеспособность и дегенеративное поведение эксплантированной ткани после жертвоприношения и подготовки в течение 106 минут. Чтобы охватить поведение подготовленных образцов при дегенерации тканей, которые помещали на лед в очередь на измерение, как описано в разделе 1, готовили свежеэксплантированную двенадцатиперстную кишку здоровой мыши C57/bl6 и хранили на льду в течение 3 ч, чтобы имитировать максимальное время ожидания, которое имело место во время экспериментов. (C) Затем ткань нагревали до 37 °C и визуализировали с помощью NAD(P)H-FLIM, а также создавали карту активности. Соответствующая средняя активность ткани была рассчитана на основе сегментированных данных, как описано для (B), и (D) это привело к активности 57,8% ± 4,6% для собственной пластинки и 68,5% ± 5,7% для эпителия). Все масштабные линейки имеют размер 250 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: NAD(P)H-FLIM ворсинок хозяина и ткани нематоды, указывающий на метаболическое состояние и предпочтительные метаболические пути в организме хозяина и паразита. (A) Средняя общая метаболическая активность, определенная по картам маскированной активности эпителия (EP) (78,4% ± 5,5%) и собственной пластинки (LP) (76,3% ± 5,2%) в здоровой двенадцатиперстной кишке мышей. (B) После нашего анализа содержание ферментов было сгруппировано в соответствии с метаболическими путями, включая аэробный гликолиз, окислительное фосфорилирование/анаэробный гликолиз и окислительный взрыв эпителия (EP) и собственной пластинки (LP) в здоровой двенадцатиперстной кишке мышей. (К,Г) Как и в пунктах (А) и (В), был проведен анализ ткани хозяина, приобретенной в ходе острой инфекции. Средняя метаболическая активность ткани хозяина на 6-е сутки составила 74,0% ± 7,6%, на 10-е сутки – 72,4% ± 10,5%, на 14-е сутки – 73,5% ± 11,4%. (Э,Ж) Как и в пунктах (С) и (D), ткань паразита анализировалась в течение острой фазы заболевания. Средняя метаболическая активность паразита на 6-е сутки составила (58,0% ± 2%, на 10-е сутки – 61,1% ± 9,9%, на 12-е сутки – 64,5% ± 5,8%, на 14-е сутки – 73,1% ± 5,9%. Статистический анализ проводили с помощью теста ANOVA (ns p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Время жизни флуоресценции, зависящее от состояния связывания NAD(P)H. Схематическое изображение (A I) несвязанного (свободного) NAD(P)H при возбуждении поглощением фотона в момент времени 0 на временной шкале и времени его специфической флуоресценции в связывающем состоянии (τ) при 450 пс. Тот же процесс показан для (A II) NADH, связанного с LDH и (A III) PDH, со временем жизни флуоресценции 1600 пс и 2470 пс, соответственно, и NADPH, связанного с NADPH-оксидазами (NOX) (A IV) с временем жизни флуоресценции 3650 пс. (B) Таблица характерных времен жизни флуоресценции NAD(P)H, связанного с наиболее распространенными ферментами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Критические шаги в рамках протокола происходят во время подготовки и при определении ROI. Волокна частично переваренной пищи представляют собой проблему для визуализации, в основном из-за эндогенной люминесценции волокон, перекрывающихся флуоресценцией NAD(P)H, а также из-за их гармонического сигнала генерации. Очень важно найти ROI, которые не содержат фекалий. Мы стремились избежать измерения областей, содержащих фекалии. Следует избегать мытья, поскольку это влияет на целостность хрупких ворсинок и влияет на вязкость слизи. Кроме того, предпочтительно, чтобы вся процедура подготовки длилась около 5-10 минут на образец, чтобы избежать дегенерации и высыхания тканей. Кроме того, используемая агароза низкой концентрации имитирует вязкость кишечной слизи³⁴. Таким образом, можно гарантировать, что ворсинки не разрушатся, в то время как черви свободно перемещаются во время измерения. Измерение не должно длиться более 45 минут (рис. 1A, B и рис. 1A, B, C) для сохранения наилучших условий для визуализации клеточного метаболизма. Таким образом, поиск интересующей области (ROI) не должен занимать более 15 минут. Однако, чтобы гарантировать, что ткань, находящаяся на льду, нагревается до желаемых 37 °C на нагревательной пластине, визуализацию следует проводить через ~10 минут. Визуализация обычно длится 45 минут (см. анализ данных TCSPC для контроля жизнеспособности тканей до и во время измерения; Рисунок 1С и Рисунок 4). При поиске подходящего ROI убедитесь, что не менее 20% просветной стороны ткани двенадцатиперстной кишки (на 10-14 день после заражения) под линзой объектива покрыто тканью червей и что движение паразита видно. Для 6-го дня и здоровых людей подходящий ROI определяется как тот, при котором целостность тканей сохраняется после подготовки (как правило, вдали от границ образца). Это обеспечивает наилучшие условия обучения модели сегментации и дает достаточно данных для дальнейшего анализа. Для стадий инфекции с 10-го дня и далее, когда черви прорываются в просвет и прикрепляются к ворсинкам, данные только сегментируются в соответствии с фоном и паразитарной и кишечной тканью с высокой активностью ферментов, поскольку в присутствии червей ворсинки в основном неструктурированы из-за гнездования, а тканевая целостность ворсинок больше не присутствует. Для ткани, эксплантированной на 6-й день и от здоровых мышей, целостность ткани позволяет сегментировать собственную пластинку, а также эпителий относительно фона. Таким образом, настоятельно рекомендуется использовать отдельно обученные модели для конкретных условий. Сигнал перегружает детекторы для материала с высокой автофлуоресцентностью, иногда накапливаясь в пределах измеряемого объема. В этой работе в программном обеспечении использовалось динамическое управление мощностью лазера по всей глубине изображения.

Ограничения этого метода связаны с физическими ограничениями объема возбуждения. Осевое разрешение линзы объектива ранее было определено как 1,3 мкм при 850 нм²⁸, но поскольку оно обычно разрушается в тканях, мы сочли подходящим размер шага в 2 мкм. При поле зрения 0,5 мм x 0,5 мм каждый срез имеет размеры 505 x 505 пикселей. Боковое разрешение объектива составляет ~ 350 нм; Однако из-за ухудшения разрешения^24,28 размер пикселя ~ 1 мкм был признан достаточным. Это означает, что измерение проводится в соответствии со стохастическим подходом. Полученная кривая распада складывается из суммы всех кривых распада, то есть всех времен жизни флуоресценции в пределах выходного объема ~1 x 1 x 2 мкм³. Количество фотонов, записанное с течением времени для каждого воксела (измеренное время жизни флуоресценции или стек TCSPC), имеет форму одной мультиэкспоненциальной кривой распада или линейной комбинации мультиэкспоненциальных кривых распада, что трудно предсказать. Для анализа сложной кривой затухания флуоресценции в каждом вокселе был использован безмодельный нормализованный анализ на основе Фурье, называемый векторным анализом. Стеки были заранее свернуты с помощью гауссова фильтра (σ2) для уменьшения шума в флуоресцентных изображениях с временным разрешением. Потеря пространственного разрешения является приемлемой и является компромиссом для лучшего разрешения флуоресценции в течение всего срока службы.

Время захвата кадра находится в диапазоне от 2,5 с до 7 с (усреднение), а время захвата для типичного z-стека размером 500 x 500 x 200 мкм³ (505 x 505 x 101 воксель) составляет ~ 450 с (7,5 мин). Это время часто приводит к тому, что во время одного измерения паразиты могут перемещать артефакты. В этом случае данные остаются пригодными для использования. Изредка паразиты выходят за пределы измеряемого объема во время измерения.

С помощью флуоресцентной визуализации NADH и NADPH иссеченной мышиной двенадцатиперстной ткани мышей мышей, инфицированных нематодой H. polygyrus, и нашей ранее опубликованной аналитической структуры с использованием референсных флуоресцентных времен жизни NAD(P)H, связанного с частыми NAD(P)H-зависимыми ферментами, была визуализирована и проанализирована общая метаболическая активность и различные метаболические пути в кишечной ткани хозяина и ткани паразита; Этот анализ выявил метаболические перекрестные связи между ними. В качестве альтернативы, если информация об общей метаболической активности или о балансе между НАДН и НАДФН представляет интерес, доступны общеприменимые надежные алгоритмы и программные процедуры, которые могут быть использованы^22,23.

Представленный здесь протокол и установленная методика анализа представляют собой обобщенный метод измерения метаболизма и метаболических путей, применимый к другим органам и другим видам патологий 13,15,16,17,19,20.

По сравнению, например, с анализом одиночных клеток с цитометрией, элегантность метода заключается в возможности получения субклеточной пространственной информации о метаболических путях с минимальным вмешательством и без меток в биологических системах, с возможностью дополнительного использования маркеров или красителей для более высокой плотности информации. Вмешательство в биологическую ткань и связанные с ней инфекционные процессы минимальны благодаря выбору паразита, встречающегося в природе у грызунов, а также предварительному исследованию ткани кишечника и ее сопоставимости с живой тканью с точки зрения жизнеспособности. При соответствующей сегментации и нормализации можно получить сопоставимые измерения в четвертом измерении (времени).

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Мы благодарим Роберта Гюнтера за отличную техническую поддержку. Финансовая поддержка от Немецкого научно-исследовательского совета (DFG) в рамках грантов SPP2332 HA2542/12-1 (S.H.), NI1167/7-1 (R.A.N.), HA5354/11-1 (A.E.H.) и RA2544/1-1 (S.R.), в рамках гранта SFB1444, P14 (R.A.N., A.E.H.), в рамках гранта HA5354/8-2 (A.E.H.) и в рамках гранта GRK2046 B4 и B5 (S.H., С.Р.) и HA2542/8-1 (S.H.) получили широкое признание. В.Л. получил докторскую степень в Берлинской высшей школе прикладных наук в области медицинской физики/физической инженерии в Берлине.