Imagerie à vie de fluorescence NAD(P)H pour l’analyse métabolique de l’intestin murin et des parasites lors d’une infection par nématode

Le présent protocole décrit l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence NAD(P)H d’un intestin murin explanté infecté par le parasite naturel Heligmosomoides polygyrus, ce qui permet d’étudier les processus métaboliques à la fois dans les tissus de l’hôte et du parasite d’une manière spatialement résolue.

Les parasites ont généralement un effet négatif sur la santé de leur hôte. Ils représentent un énorme fardeau pour la santé, car ils affectent globalement la santé de l’homme ou de l’animal infesté à long terme et, par conséquent, ont un impact sur les résultats agricoles et socio-économiques. Cependant, des effets immunorégulateurs induits par les parasites ont été décrits, avec une pertinence thérapeutique potentielle pour les maladies auto-immunes. Bien que le métabolisme de l’hôte et des parasites contribue à leur défense et soit à la base de la survie des nématodes dans l’intestin, il est resté largement sous-étudié en raison d’un manque de technologies adéquates. Nous avons développé et appliqué l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence NAD(P)H à des tissus intestinaux murins explantés lors d’une infection par le nématode naturel Heligmosomoides polygyrus afin d’étudier les processus métaboliques chez l’hôte et les parasites de manière spatialement résolue. L’exploitation de la durée de vie en fluorescence des coenzymes nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH), ci-après NAD(P)H, qui sont préservées dans toutes les espèces, dépend de leur statut de liaison et du site de liaison sur les enzymes catalysant les processus métaboliques. En se concentrant sur les enzymes dépendantes du NAD(P)H les plus abondamment exprimées, les voies métaboliques associées à la glycolyse anaérobie, à la phosphorylation oxydative/glycolyse aérobie et à l’explosion oxydative basée sur les NOX, en tant que mécanisme de défense majeur, ont été distinguées, et la diaphonie métabolique entre l’hôte et le parasite pendant l’infection a été caractérisée.

Les infections parasitaires imposent un lourd fardeau à la santé humaine ^1,2. Une corrélation entre l’augmentation des maladies auto-immunes et le déclin des infections parasitaires a été observée dans les pays industrialisés. On sait que les parasites peuvent avoir des effets bénéfiques en atténuant les réponses immunitaires excessives de l’hôte. H. polygyrus est un parasite naturel présent dans l’intestin chez les rongeurs, et ce parasite est connu pour induire des mécanismes immunorégulateurs qui réduisent la réponse immunitaire antiparasitaire de l’hôte via, entre autres mécanismes, l’induction de lymphocytes T régulateurs (Treg) chez l’hôte infecté 3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Ces mécanismes de régulation sont particulièrement intéressants dans les maladies auto-immunes dégénératives.

L’analyse de la diaphonie métabolique entre l’hôte et les nématodes intestinaux reste largement négligée, bien que le métabolisme joue un rôle important à la fois chez l’hôte et les parasites pour la défense, la survie et la fonction. Nous proposons d’adapter et d’appliquer l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence du NADH et du NADPH sur l’excitation à deux photons, une technologie déjà largement utilisée dans différentes situations physiologiques et physiopathologiques dans les cellules et les tissus de mammifères¹², afin d’étudier corrélativement le métabolisme de l’hôte et du nématode dans les tissus vivants.

Le NADH et le NADPH, appelés NAD(P)H, sont des molécules ubiquitaires qui sont préservées dans toutes les formes de vie cellulaires et jouent le rôle de coenzymes dans diverses voies métaboliques. Par exemple, ils sont impliqués dans la production d’énergie, la biosynthèse réductrice et la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) médiées par la NADPH oxydase, qui sont principalement liées à la défense cellulaire et à la communication cellulaire 13,14,15,16,17,20. Les deux co-enzymes émettent une fluorescence à ~450 nm lors de l’excitation à deux photons à 750 nm, permettant ainsi une imagerie métabolique sans marqueur dans les cellules et les tissus^19,21. Il est possible d’exciter à la fois le NADH et le NADPH avec une seule longueur d’onde en raison de leurs spectres d’excitation à deux photons similaires et assez larges²¹.

La durée de vie de fluorescence de la coenzyme NAD(P)H dépend directement de l’enzyme à laquelle elle se lie 18,21,22,23. En raison de sa structure chimique permettant le transfert d’énergie intramoléculaire, la molécule de NADH ou NADPH excitée perd de l’énergie par des processus de conversion internes, à un rythme dépendant de ses propriétés de liaison, vers les enzymes (catalyseur) avant de se détendre et d’émettre un photon de fluorescence. Cette durée de vie donne un aperçu du site de liaison du NAD(P)H sur l’enzyme et, par conséquent, de la réaction biochimique préférentielle qui a lieu 19,21,22,23,24,25. La durée de vie de fluorescence des molécules libres de NADH et de NADPH s’élève à ~450 ps, tandis que leur durée de vie de fluorescence lorsqu’elles sont liées à une enzyme est beaucoup plus longue (~2 000 ps) et dépend de leur site de liaison à l’enzyme^{respective 21}.

Il y a plus de 370 enzymes impliquées dans les processus liés au NAD(P)H ; cependant, seuls les plus abondants seront en mesure de contribuer à la durée de vie de la fluorescence NAD(P)H résultante dans la plage d’excitation du microscope. À l’aide des données RNASeq provenant de cellules de mammifères, nous avons identifié les enzymes NAD(P)H dépendantes les plus abondantes et généré une référence de durée de vie en fluorescence pour interpréter les données générées dans les échantillons de tissus et de cellules¹⁸. Ainsi, ce travail a distingué par exemple l’activité préférentielle de la lactate déshydrogénase (LDH), qui est associée aux voies métaboliques glycolytiques anaérobies, et l’activité de l’isocitrate déshydrogénase (IDH) et de la pyruvate déshydrogénase (PDH), qui sont principalement impliquées dans les voies métaboliques de glycolyse aérobie/phosphorylation oxydative^16,20. De plus, la liaison du NADPH aux NADPH oxydases, qui sont les enzymes principalement responsables de l’explosion oxydative, peut être facilement résolue en raison de l’emplacement caractéristique de ces enzymes dans la cellule (liée à la membrane) et en raison de la durée de vie particulièrement longue de la fluorescence du NADPH (3 650 ps)18,24,29,30,32. Les données RNASeq de H. polygyrus montrent que la référence générée pour les cellules de mammifères s’applique également sous forme adaptée à ce nématode²⁷.

Par conséquent, dans ce travail, en effectuant l’imagerie de la durée de vie de la fluorescence NAD(P)H (FLIM) dans des échantillons de duodénum fraîchement explantés de souris infectées par H. polygyrus, des informations sur le rapport entre le NAD(P)H libre et enzymatique lié à l’enzyme ont été acquises, ce qui a permis de décrire l’activité métabolique générale dans tous les tissus, ainsi que l’enzyme principalement active dans chaque pixel de l’image (c’est-à-dire l’enzyme à laquelle le NAD(P)H se lie préférentiellement à cet endroit spécifique). Le succès de ces expériences repose sur la préparation précise de l’échantillon de l’intestin explanté, l’imagerie en direct fiable de la durée de vie de la fluorescence du NAD(P)H à résolution subcellulaire et l’évaluation standardisée des données, comme discuté dans ce protocole.

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives nationales de protection des animaux et approuvées par le Comité allemand d’éthique animale pour la protection des animaux (G0176/16 et G0207/19). Le protocole décrit l’acquisition et l’évaluation des données d’imagerie de la durée de vie de la fluorescence NAD(P)H, qui permettent d’évaluer l’activité métabolique générale et les voies métaboliques spécifiques dans l’intestin de l’hôte et les parasites lors de l’infection par le nématode intestinal murin naturel, H. polygyrus. À cette fin, des souris femelles C57BL/6 âgées de 10 à 12 semaines ont été infectées par 200 larves de stade 3 (L3). À différents moments de l’infection, les souris infectées ont été sacrifiées, et les duodénums ont été excisés et préparés pour l’imagerie comme décrit précédemment³³. Les duodénums de souris non infectées, appariées selon l’âge et le sexe, ont été préparés et imagés de la même manière à des fins de contrôle. Pour maintenir les propriétés tissulaires nécessaires à l’imagerie et à l’analyse ultérieures, les échantillons doivent être traités immédiatement après l’explantation, et les étapes suivantes (étapes 1.1 à 1.7) doivent être effectuées rapidement (Figure 1B).

1. Préparation de l’échantillon

1. Coupez des morceaux de ~1 cm de longueur dans le duodénum initialement excisé.
2. Collez le tube de tissu redressé au milieu d’une petite boîte de Pétri avec de la colle à tissu à durcissement rapide (47 mm de diamètre, 10 mm de hauteur de jante, voir le tableau des matériaux) (Figure 1A2).
3. Appliquez une fine couche de colle supplémentaire au fond de la boîte de Pétri sur une grande surface autour du tissu à l’aide d’une microbrosse (Figure 1A2).
4. À l’aide de ciseaux émoussés, faites une incision sur toute la longueur de l’intestin physiquement fixé à proximité du fond de la boîte de Pétri (Figure 1A3).
5. Dépliez l’intestin à l’aide d’une pince à épiler émoussée de manière à ce que le côté abluminal entre en contact complet avec la colle. Ainsi, l’intestin est fixé par la colle avec le côté luminal vers le haut (Figure 1A4).
   1. Dans le cas d’une souris infectée, comptez les vers au stéréomicroscope (grossissement 10x) pour vous assurer que l’infection a réussi (Figure 1A5).
6. Scellez l’intestin avec de l’agarose pour le protéger du dessèchement. Ici, l’agarose à 0,5 % à 0,9 % a été utilisé pour protéger le tissu intestinal sensible contre les brûlures en raison de son point de fusion à basse température d’environ 38 °C. Prélever 1 mL d’agarose dans une pipette et verser délicatement sur l’intestin en laissant un contact tendre entre l’extrémité de la pipette et le tissu de manière à ce qu’une fine couche d’environ 0,5 mm d’épaisseur entoure complètement le tissu (figure 1A6).
7. Remplissez les boîtes de Pétri avec les échantillons scellés dans de l’agarose avec du PBS (10 %) à température ambiante, puis fermez-les avec le couvercle. Imagez directement les échantillons ou placez-les sur de la glace dans une boîte isolante thermique pour faire la queue pour les mesures. Placez le premier échantillon préparé sous l’objectif du microscope sur une plaque chauffante réglée à 37 °C (Figure 1A8).

2. Imagerie

REMARQUE : Le système de microscope utilisé pour effectuer la spectrométrie NAD(P)H-FLIM dans des échantillons de tissus duodénaux infectés et sains comprend les dispositifs énumérés et décrits à la figure 2 et dans le tableau des matériaux. Utilisez ImSpector 208 comme logiciel de contrôle pour tous les modules utilisés.

1. Pour trouver initialement la région d’intérêt (ROI), placez l’échantillon dans la boîte de Pétri sous l’objectif, et déplacez-vous le long des plans x et y à la main pour trouver un ROI approprié par inspection visuelle à l’aide du mode de microscopie à fluorescence à champ large.
2. Basculez le système d’imagerie vers l’excitation à deux photons à l’aide de la détection PMT ou de la détection par comptage de photons uniques corrélés dans le temps (TCSPC) en changeant de mode dans le logiciel. Veillez tout particulièrement à ce que l’environnement soit sombre et exempt de vibrations, à enfermer le microscope dans des rideaux étanches à la lumière et à utiliser une table optique suspendue pneumatique, si possible.
3. Immergez la lentille de l’objectif dans la boîte de Pétri contenant l’échantillon avec le logiciel de contrôle en cliquant sur l’icône du système de lentille et en tournant la molette de la souris pour modifier la position z.
4. Réglez le laser sur 765 nm et réglez la puissance laser maximale sur 10 %, ce qui correspond à 30 mW sous l’objectif, en tapant la longueur d’onde souhaitée dans le panneau des longueurs d’onde du logiciel. Ajustez la puissance du laser si nécessaire. Mesurez en dessous d’un gain de 40 % (~30 mW à 100 mW) pour éviter les photodommages tissulaires et les changements métaboliques indésirables.
5. Dans le logiciel, réglez la taille du pas de la platine z sur 2 μm, ce qui correspond à la résolution axiale du microscope à 765 nm dans les tissus.
6. Réglez la fréquence de balayage linéaire sur 400 Hz dans le panneau de miroir galvo, ce qui permet d’obtenir un temps de séjour des pixels de 4,95 μs.
7. Réglez la moyenne de l’image sur deux à quatre images en choisissant le nombre de moyenne dans le menu déroulant du logiciel (c’est-à-dire balayez le retour sur investissement deux à quatre fois pour obtenir des images plus fluides). De cette façon, le temps de séjour total des pixels est augmenté à 9,9-19,8 μs au profit d’un rapport signal/bruit (SNR) plus élevé dans le processus d’analyse.
8. Réglez le champ de vision de l’image (FOV) sur 505 pixels x 505 pixels (500 x 500 μm²) en choisissant les paramètres dans le panneau FOV du logiciel.
9. Pour chaque mesure, calibrez le temps du module à l’avance pour assurer le fonctionnement optimal de l’électronique TCSPC en cliquant sur initialiser dans la fenêtre d’étalonnage du menu matériel du TCSPC.
10. Ajustez la photodiode rapide vers l’extérieur pour détecter le train d’impulsions laser Ti :Sa à l’aide d’un oscilloscope rapide.
    REMARQUE : Le signal de la photodiode est utilisé pour déclencher la détection hPMT et le comptage des photons par le TCSPC par rapport à l’impulsion d’excitation. La détection est répétée tous les 12,5 ns (c’est-à-dire le temps entre deux impulsions laser consécutives), ce qui correspond au taux de répétition du laser Ti :Sa (80 MHz).
11. Définissez la plage de la profondeur de mesure en réglant d’abord la moyenne sur 1 et le gain de la puissance laser sur ~10 %, puis en démarrant le mode vidéo (cliquez sur le bouton vidéo ), en recherchant la profondeur à partir de laquelle le signal peut encore être acquis en cliquant à nouveau sur l’icône du système d’objectif , et en utilisant la molette de la souris pour progresser dans l’échantillon tout en augmentant progressivement le gain.
12. Pour les images NAD(P)H-FLIM des échantillons de tissus mesurés en mode FLIM, réglez le système sur 765 nm à une puissance nominale maximale de 100 mW. Détectez le signal de fluorescence du NAD(P)H (466/60 nm) avec le PMT hybride à un gain de 97 %, qui est défini dans le logiciel. Le module TCSPC compte les photons sur 227 fenêtres de temps (bacs), chacune de 55 ps.
13. Faites un clic droit sur l’image affichée pendant la mesure dans le logiciel, et choisissez afficher > T-PROFILE pour visualiser la courbe de décroissance acquise par le système.
14. Notez le nombre de bacs avant l’impulsion laser dans la courbe de décroissance pour une analyse ultérieure.
15. Acquérez les données en cliquant sur démarrer la mesure.
    REMARQUE : Les données doivent correspondre à un format spécifique. Chaque coupe, enregistrée à n’importe quelle profondeur de tissu, est séparée par une distance de 2 μm et a une aire de 500 μm x 500 μm, et les coupes sont acquises sous la forme d’un empilement de tranches de 500 μm x 500 μm à des points temporels de 227 x 55 ps (Figure 3A). Chaque voxel contient un histogramme de l’heure d’arrivée des photons spatialement résolu (dans le plan x et le plan y). Il s’agit de la décroissance de la fluorescence (Figure 3B). Un volume généralement mesuré doit se présenter sous la forme d’une hyperpile de dimensions de ~500 μm x 500 μm x 100-300 μm et 227 bacs, où chaque tranche dans le plan z contient les données d’intensité dépendantes du temps comme décrit ci-dessus. Pour un ensemble de données de mesure exemplaire, cela donne (505 x 505 x 227) x 100 pixels (16 bits) et correspond à environ 4 Go.

3. Analyse des données

REMARQUE : Pour l’analyse de phaseur des images NAD(P)H-FLIM, le programme de calcul des durées de vie est un code écrit sur mesure en Python³³.

1. Utilisez Anaconda avec une distribution Python 3.7 sur l’IDE Spyder (voir la Table des matériaux). Le code utilise les bibliothèques standard de Python.
2. Chargez le code dans l’IDE et exécutez-le. Une boîte de dialogue de chemin d’accès au fichier s’ouvre.
3. Choisissez le dossier contenant les données brutes à analyser. Le code est programmé pour choisir trois paramètres avant l’analyse via une boîte de dialogue de saisie utilisateur Tkinter avec des cases à cocher, un menu déroulant et des champs de texte.
4. Choisissez un décalage dans la boîte de dialogue de saisie. Déterminez le décalage comme le nombre de premières tranches de la pile temporelle qui ne sont pas analysées.
   REMARQUE : Le paramètre coupe les points de temps avant l’impulsion d’excitation. Avec l’étalonnage du système et de la diode de déclenchement, cette valeur doit être d’environ cinq tranches ou le nombre de bacs morts avant l’excitation laser, comme décrit à l’étape 2.14.
5. Choisissez la représentation des tracés de phaseur dans le menu déroulant de la boîte de dialogue de saisie. Ici, choisissez l’apparence des points de données (nuageux ou topographiques), ainsi que les graduations de l’axe du demi-cercle de l’axe du temps (enzymes ou temps [ps]), en tant qu’options dans le menu déroulant.
6. Cliquez sur OK.
7. Vérifiez que le code calcule deux types d’informations à partir des piles z NAD(P)H-FLIM.
   1. Tout d’abord, mesurez l’information spatiale de chaque tranche de volume par l’effondrement des empilements TCSPC, où les 227 histogrammes de comptage de photons résolus dans le temps sont projetés sur une seule tranche appelée image de projection d’intensité (Figure 3G), et à partir de l’analyse basée sur Fourier des courbes de décroissance exponentielle (telle que décrite par Leben et al.18), et à partir de la partie réelle et imaginaire normalisée pour chaque pixel dans chaque tranche de volume (Figure 3C).
   2. À partir des images réelles et imaginaires, obtenez les tracés de phaseur (Figure 3D) et l’image de la durée de vie moyenne de la fluorescence (t) (constantes de décroissance moyennes codées en couleur et résolues dans l’espace pour chaque voxel) (Figure 3E).
      REMARQUE : Comme décrit dans l’introduction, la durée de vie en fluorescence du NAD(P)H, lorsqu’il est lié à des enzymes, est déterminée par le site de liaison de la coenzyme à l’enzyme respective.
   3. Déterminez la contribution de l’enzyme respective à l’activité métabolique en générant le vecteur entre le vecteur de phase de chaque pixel et le vecteur de phase du NAD(P)H non lié et en le projetant sur le demi-cercle du diagramme de phaseur. Le demi-cercle représente toutes les décroissances mono-exponentielles possibles de la durée de vie de la fluorescence dans les composés purs.
   4. En utilisant la référence précédemment générée des durées de vie en fluorescence du NAD(P)H lié aux enzymes dépendantes du NAD(P)H les plus abondantes^18,33 (figure supplémentaire 1), et calculer la probabilité d’activation de ces enzymes.
      REMARQUE : Un code couleur de l’enzyme la plus dominante (c’est-à-dire de l’enzyme pour laquelle la probabilité d’activation la plus élevée est calculée) est attribué à chaque pixel, produisant ainsi une carte enzymatique (Figure 3F).
8. À partir du rapport entre le NAD(P)H libre (non lié) et le NAD(P)H lié à l’enzyme, en particulier à partir du rapport vectoriel dans le diagramme de phaseur entre le NAD(P)H libre à 450 ps et l’état enzymatique, calculez l’activité métabolique générale en pourcentage entre 0 % (uniquement du NAD(P)H non lié) et 100 % (uniquement du NAD(P)H lié à l’enzyme). En attribuant une valeur d’activité métabolique (0 %-100 %) à chaque pixel, une carte d’activité (codée en couleur) est générée (Figure 3F).
9. Superposez les cartes résultantes avec les images d’intensité pour obtenir des informations morphologiques supplémentaires. Ici, utilisez une macro ImageJ (voir la Table des matériaux) pour superposer la teinte et la saturation de l’enzyme ou des cartes d’activité avec la luminosité des images d’intensité.
   1. Assurez-vous que la macro effectue une itération sur l’ensemble de la pile. Pour chaque tranche (profondeur) de la pile, il doit diviser l’image d’intensité et la carte de votre choix respectivement en HUE, SATURATION et BRIGHTNESS (type de > d’image > pile TSL).
   2. Séparez les canaux principaux pour les deux piles HSB (piles de > d’images > pile d’images).
   3. Fermez la TEINTE et la SATURATION de la pile d’intensité, ainsi que la LUMINOSITÉ de la pile de la carte (close(slicename_HUE), close(slicename_BRIGHTNESS), ...).
   4. Recombinez les canaux restants pour former une nouvelle pile HSB composée de la teinte et de la SATURATION de la tranche de la carte d’intérêt et de la LUMINOSITÉ de l’image d’intensité (l’image > empile > images à empiler).
   5. Changez le type d’image en RVB pour une meilleure apparence visuelle (type de > d’image > couleur RVB).

4. Segmentation tissulaire

REMARQUE : Utilisez un réseau basé sur U-Net pré-entraîné (ILASTIK, voir le tableau des matériaux) pour segmenter le tissu intestinal de l’hôte et le tissu du nématode, respectivement, ainsi que l’épithélium et la lamina propria de l’hôte et les zones de signal de fluorescence à haut NAD(P)H et les zones à faible signal de fluorescence NAD(P)H dans le nématode.

1. Ouvrez ILASTIK et choisissez un nouveau projet et une nouvelle classification de pixels.
2. Chargez la projection d’intensité calculée précédemment à partir de l’étape 3.7.1 en cliquant sur Ajouter une nouvelle > Ajouter des images séparées. Chargez des tranches aléatoires à partir de plusieurs mesures dans le conteneur.
3. Cliquez sur Sélection de fonctionnalités > sélectionnez des fonctionnalités. Ajoutez une valeur sigma de 50 (poids sans unité) et cochez toutes les fonctionnalités pour être actives.
   REMARQUE : Alors que la valeur sigma détermine le poids des entités, celles-ci déterminent les classes et la capacité du réseau à reconnaître les arêtes, les formes, la texture ou la couleur.
4. Cliquez sur Entraînement, et nommez les étiquettes en fonction du tissu à segmenter (par exemple, Épithélium, Arrière-plan, etc.) en cliquant dessus. Sélectionnez une étiquette et colorez tous les pixels de l’image correspondant à cette étiquette.
5. Répétez l’opération pour les autres étiquettes.
6. Répétez l’opération pour environ la moitié des images du jeu de données chargé.
7. Cliquez sur Mise à jour en direct et laissez le modèle prédire les étiquettes pour les images non étiquetées restantes.
8. Corrigez environ la moitié des images uniquement prédites et non étiquetées en réétiquetant les segmentations faussement estimées, et répétez la mise à jour en direct.
9. Répétez cette étape jusqu’à ce que le réseau ait appris à estimer correctement le tissu d’intérêt souhaité ; Assurez-vous que le niveau de confiance dans le réseau indiqué à gauche, près des noms d’étiquette, se situe entre 95 % et 98 %.
10. Chargez un nouveau jeu de données comme décrit à l’étape 3.11, cette fois avec toutes les tranches d’une seule mesure, et cliquez sur Exporter les prédictions.
11. Dans le menu déroulant « Source », choisissez Segmentation simple ; dans « Format », choisissez la sortie au format tiff ; et dans « Choisir les paramètres d’exportation de l’image », sélectionnez le chemin d’enregistrement pour la sortie. Cliquez sur exporter.
12. Cela crée des masques binaires pour le type de tissu d’intérêt. Puisqu’ils sont constitués de tranches où le tissu segmenté d’intérêt a une valeur de pixel de 1 et le reste a une valeur de pixel de 0 (Figure 3H), il suffit de multiplier les masques binaires avec les données générées comme indiqué aux étapes 1.1 et 1.4 à 1.7. Cela conduit à des données masquées (Figure 3 I, J, M). Utilisez ImageJ pour cette étape (Traiter > Calculatrice d’image > multiplier).
13. Pour chaque tranche de volume, calculez un rapport signal/bruit (SNR) à partir des images d’intensité masquée. Utilisez une macro ImageJ à cet effet. Créez votre programme de manière à ce qu’il calcule le rapport signal/bruit (SNR) à partir des images segmentées et masquées.
    1. Utilisez l’arrière-plan segmenté de l’étape 3.21 comme arrière-plan (BG) et le tissu d’intérêt segmenté comme signal (SIG) en itérant sur chaque pixel de chaque tranche d’une valeur supérieure à 0 avec deux boucles for imbriquées. Calculez le SNR à l’aide de la formule suivante³³ :
       
       où la moyenne SIG fait référence à la valeur moyenne de l’histogramme du signal, la moyenne BG fait référence à la valeur moyenne de l’histogramme d’arrière-plan et std BG fait référence à l’écart-type de l’histogramme d’arrière-plan.
    2. Éliminez les tranches de volume dont la valeur SNR est inférieure à 5 de l’analyse ultérieure.
14. Avec le script Python^18,33, créez un graphique de fréquence enzymatique à partir des cartes enzymatiques pour chaque type de tissu en additionnant et en faisant la moyenne des enzymes par tranche, puis en les normalisant à un volume tissulaire de 100 μm³ (Figure 3K, N).
    1. Codez le script de manière à ce qu’il charge la carte d’enzyme masquée.
    2. Itérez sur chaque pixel, calculez la somme des pixels d’une même enzyme, puis divisez par le volume analysé (le total de tous les pixels).
    3. Regroupez les abondances calculées dans leurs états métaboliques et faites la moyenne en divisant par le nombre d’enzymes dans chaque groupe. Écrivez un code qui attribue les états métaboliques regroupés autour de la LDH aux voies de type glycolyse anaérobie, l’activité enzymatique regroupée autour des voies PDH/IDH/GAPDH aux voies de glycolyse aérobie/de type oxPhos, et l’activité de la NADPH oxydase (activité NOX) à l’éclatement oxydatif/stress oxydatif utilisé pour la défense (Figure 3L, O).
    4. Utilisez la bibliothèque matplotlib de Python pour visualiser les données avec des boîtes à moustaches.
15. Calculez l’activité du tissu à partir des cartes d’activité masquées (Figure 3F) en tant que valeur moyenne sur chaque tranche de volume pour tous les pixels d’une valeur supérieure à 0 à l’aide d’une macro ImageJ en exécutant Analyser > mesurer.
16. Visualisez toutes les images générées côte à côte avec ImageJ/FIJI.

À l’aide de la procédure actuelle NAD(P)H-FLIM 28,29,33 combinée à la méthode d’analyse de phaseur décrite, l’activité métabolique et les voies métaboliques dans les duodénums sains et infectés ont été mesurées au jour 6, au jour 10, au jour 12 et au jour 14 après l’infection par le nématode intestinal murin H. polygyrus.

Viabilité tissulaire intestinale préservée dans le duodénum excisé révélée par le NAD(P)H-FLIM
Afin d’étudier l’activité tissulaire ex vivo et de déterminer combien de temps les échantillons de tissus excisés restent métaboliquement actifs par rapport aux tissus d’organismes vivants, le NAD(P)H-FLIM a été réalisé sur du tissu duodénal excisé de souris saines qui a été (i) fraîchement excisé ou (ii) maintenu sur glace pendant 3 h, et les résultats ont été comparés aux données NAD(P)H-FLIM déjà publiées acquises dans l’intestin de souris anesthésiées³². La préparation du duodénum excisé et l’expérience d’imagerie ont été réalisées comme décrit dans le protocole de préparation de l’échantillon (étape 1).

La durée de vie en fluorescence du NAD(P)H a été mesurée sur une période de 3 h et à quatre profondeurs tissulaires différentes (extrémité des villosités : ~0 μm, villosités supérieures : ~−50 μm, villosités inférieures : ~−100 μm, base des villosités : ~−200 μm). À partir des données NAD(P)H-FLIM ainsi acquises, des cartes d’activité ont été générées montrant l’activité métabolique générale dans les différentes régions des villosités au cours du temps. L’activité métabolique générale (NAD(P)H libre à lié à l’enzyme) est considérée comme un indicateur de la dégénérescence du tissu (Figure 4A,B).

Une deuxième série de mesures avec des échantillons de tissus similaires a été effectuée avec un autre morceau d’intestin. Ici, les mesures n’ont pas été prises directement après le sacrifice, mais le tissu a été placé sur de la glace pendant 3 heures après la préparation pour imiter le temps d’attente maximal pour les échantillons placés sur la glace dans l’expérience réelle. Après un temps de préchauffage de ~15 min à l’aide d’une plaque chauffante, une imagerie à différentes profondeurs de tissus a été réalisée (Figure 4C,D). L’activité métabolique mesurée dans les deux configurations décrites précédemment était en bon accord avec l’activité métabolique mesurée par le NAD(P)H-FLIM dans des conditions intravitales dans l’intestin murin³².

Détection d’une activité métabolique et enzymatique différente dans le tissu intestinal de l’hôte et H . polygyrus au cours d’une infection aiguë à l’aide du NAD(P)H-FLIM
Au cours de la maladie, à partir du 6e jour après l’infection, lorsque les larves de vers se développent dans la sous-muqueuse, éclatent dans la lumière au 10e jour et s’infiltrent dans la niche intestinale, une augmentation de l’activité métabolique globale des parasites a été observée. D’un état plus dormant au jour 6 58,0 % ± 2,2 %, l’activité métabolique a augmenté régulièrement pour atteindre 73,1 % ± 5,9 %.

L’état initial du parasite au début de l’infection se reflète dans son empreinte métabolique ; Plus précisément, au jour 6, la production d’énergie était équilibrée entre les voies anaérobies et aérobies, indiquant une percée imminente dans la lumière. Il y a ensuite eu un changement dans la production d’énergie vers un comportement fortement semblable à la glycolyse anaérobie, probablement en raison de l’augmentation du besoin d’énergie pour migrer dans la lumière (jour 10), et les parasites ont montré une voie de phosphorylation oxydative / glycolyse aérobie pour la production d’énergie plus tard (mesurée jusqu’au jour 14). L’activité métabolique générale de l’hôte est restée comparable à l’état sain à 74,0 % ± 7,6 % (du 6e au 14e jour), tandis que les voies métaboliques dans le tissu de l’hôte étaient principalement une phosphorylation aérobie/oxydative au cours de l’infection aiguë.

La réaction de défense des parasites est basée sur l’activation de DUOX2, en tant que seul membre de la famille des NADPH oxydase chez cette espèce. Cette réaction est négligeable au stade précoce de l’infection, au jour 6, mais augmente à des moments ultérieurs au cours de l’infection aiguë. Par conséquent, nous avons détecté une augmentation drastique de l’activation de DUOX2 à partir du jour 10, après la transmigration luminale, et tout au long de la phase aiguë de l’infection. (Figure 5E,F)

Le comportement inflammatoire de l’hôte, en revanche, a considérablement augmenté par rapport à un état sain au 10e jour après l’infection, avec l’apparition du parasite dans la lumière, et a cessé plus tard au 14e jour après l’infection. Ce comportement est parallèle au fait que les parasites induisent un phénotype régulateur dans le système immunitaire de l’hôte aux stades ultérieurs (chroniques) de l’infection ^4,6,7 (Figure 5A-D).

Figure 1 : Préparation du tissu intestinal murin pour le NAD(P)H-FLIM avec le microscope à balayage laser multiphotonique. (A) La préparation nécessite de retirer le morceau d’intestin et de le couper à environ 1 cm de longueur (1), d’étaler de la colle tissulaire sur une boîte de Pétri et d’y placer le tube (2), de couper le tube longitudinalement avec des ciseaux émoussés près du fond (3), déplier le tube pour ouvrir la face luminale à l’aide d’une pince émoussée (4), compter les vers au stéréomicroscope (5), sceller le tissu avec de l’agarose à faible concentration en une couche mince d’environ 0,5 mm d’épaisseur (6), remplir la boîte avec 10 % de PBS (7) et imager l’échantillon de tissu ou le placer sur de la glace en attendant le traitement (8). (B) Axe temporel pour le traitement d’un seul échantillon de tissu en quelques minutes, depuis le retrait du duodénum jusqu’à sa mise en place au microscope. Le temps de mesure d’un échantillon consistait à trouver un retour sur investissement, à réchauffer les échantillons refroidis sur un élément chauffant à 37 °C dans l’intervalle, puis à acquérir les images. (C) Le temps de mesure moyen de 45 min (déterminé par la suite à partir des données) est tracé en (C) en fonction des quatre stades de l’infection étudiés, ainsi que des tissus sains. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Schéma du dispositif expérimental. Le système se compose d’un laser Ti :Sa accordable titane :saphir LASER Chameleon ULTRA II (690-1 080 nm, 80 MHz, largeur d’impulsion de 140 fs) avec une tête de balayage commerciale Trimscope II. Une lentille d’objectif à immersion dans l’eau (20x, NA 1,05) concentre la lumière d’excitation. Un système de miroirs dichroïques, de filtres interférentiels (525/50 nm, 593/40 nm, 655/40 nm) et de PMT détecte le signal de fluorescence. Les données de durée de vie de la fluorescence sont détectées à l’aide d’un PMT hybride (GaAsP) (hPMT) sur le canal 466/60 nm, qui est refroidi par un module de refroidissement (CM) et est connecté à un module de comptage de photons uniques corrélé dans le temps ; ce processus implique la détection de photons dans un bac de 55 ps et l’acquisition de données sur 9 ns avec une fonction de réponse d’instrument en forme de gaussienne de 250 ps FWHM (TCSPC). Pour déclencher le TCSPC, 5 à 8 % de l’intensité de l’impulsion initiale est séparée du faisceau d’excitation et redirigée dans une photodiode ultra-rapide (). Pour obtenir l’excitation à deux photons en temps réel sans le TCSPC, des PMT avec des filtres de couleur (525 nm, 593 nm, 655 nm) sont utilisés. Une lampe à vapeur de mercure (MV) à large bande et une voie oculaire sont utilisées pour l’observation de la sonde (OP) pour la microscopie visuelle à fluorescence et le positionnement de l’échantillon, et le retour sur investissement est trouvé avec un étage intravital (IS) d’une taille de pas de 1 μm (IS). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Analyse Phasor des données NAD(P)H-FLIM dans le domaine temporel. (A) Les données brutes sont acquises en quatre dimensions : l’information spatiale (x, y, z ; 505 pixels = 500 μm pour xy) et les données TCSPC (227 points temporels de 55 ps chacun pour t). (B) Chaque pixel des données brutes du TCSPC le long de t, comme indiqué en (A), contient la décroissance de l’intensité de fluorescence après une impulsion d’excitation dans 227 intervalles de temps de 55 ps chacun. Les données TCSPC dans le domaine temporel sont pré-alambiquées gaussiennes et transférées dans un domaine de phase virtuel en calculant la transformée de Fourier différentielle normalisée et discrète (approche de phaseur). Il en résulte un nombre complexe de chaque pixel de l’image, contenant une partie réelle et une partie imaginaire, et cela peut être divisé et représenté sous la forme de deux images codées en intensité par tranche mesurée : (C, à gauche) la partie réelle et (C, à droite) la partie imaginaire. (D) Les parties réelle et imaginaire fournissent les coordonnées dans le tracé du phaseur, où chaque point du graphique a une contrepartie spatiale et ses informations de décomposition de (B). L’axe temporel semi-circulaire indique les durées de vie mono-exponentielles. (E) Les durées de vie de la fluorescence sont calculées et codées en couleur à partir de (C) à l’aide de la transformation de Fourier continue (rétro-)). Ceci est équivalent à une analyse mono-exponentielle de la courbe de décroissance de l’intensité en (B). À la suite d’un cadre d’analyse préalablement développé, (F, à droite) une carte des enzymes NAD(P)H-dépendantes et (F, à gauche) une carte de l’activité enzymatique sont générées. (G) En parallèle, les données brutes du TCSPC sont regroupées dans la projection d’intensité, perdant l’information temporelle et ne conservant que l’information spatiale. (H) À partir de là, des masques sont générés à l’aide d’ILASTIK pour le tissu d’intérêt souhaité par des algorithmes de segmentation entraînés, qui sont superposés à la projection d’intensité ; un exemple est montré ici pour (I, à gauche) parasite et (I, à droite) hôte au 14e jour après l’infection. (J, à gauche) La carte d’activité masquée et la carte enzymatique masquée de (J, à droite) le parasite et de (M) le tissu hôte. À partir des cartes masquées, des graphiques de fréquence enzymatique pour le parasite sont générés en comptant les enzymes et en normalisant le pourcentage d’abondance à 100 μm³ (K). À la suite de l’analyse de Liublin et ^al.33, les abondances enzymatiques ont été regroupées selon les voies métaboliques de la glycolyse aérobie et de la phosphorylation oxydative/glycolyse anaérobie, ainsi que de l’éclatement oxydatif et d’un état métaboliquement inactif (NAD(P)H libre et non lié) pour (L) le parasite et pour (N,O) le tissu hôte. Toutes les barres d’échelle mesurent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4 : Pré-évaluation de la vitalité du tissu explanté. (A) Carte de l’activité enzymatique du duodénum fraîchement explanté d’une souris C57/bl6 saine, comme décrit dans la section 3. Le tissu a été imagé directement après la préparation à des intervalles de 20 minutes pour une durée totale de 106 minutes sur une plaque chauffante à 37 °C. Les mesures ont été effectuées à quatre profondeurs tissulaires différentes : l’extrémité des villosités (0 μm), le milieu supérieur (−50 μm), le milieu inférieur (−100 μm) et la base des villosités (−200 μm). Les exemples illustrés en (A) sont la région moyenne supérieure des villosités 5 min et 68 min après la préparation. Pour chaque point temporel de mesure, l’activité enzymatique moyenne sur toutes les profondeurs a été calculée à partir des cartes d’activité segmentées de la lamina propria et du tissu épithélial et tracée sur le temps de mesure. (B) Le graphique montre la vitalité et le comportement de dégénérescence du tissu explanté après sacrifice et préparation sur 106 min. Pour couvrir le comportement de dégénérescence tissulaire des échantillons préparés qui ont été placés sur de la glace pour faire la queue pour la mesure, comme décrit dans la section 1, du duodénum fraîchement explanté d’une souris C57/bl6 saine a été préparé et stocké sur de la glace pendant 3 h pour imiter le temps d’attente maximal qui s’est produit pendant les expériences. (C) Le tissu a ensuite été chauffé à 37 °C et imagé avec NAD(P)H-FLIM, et une carte d’activité a été générée. Les activités moyennes correspondantes du tissu ont été calculées à partir des données segmentées décrites pour (B) et (D), ce qui a donné une activité de 57,8 % ± 4,6 % pour la lamina propria et de 68,5 % ± 5,7 % pour l’épithélium). Toutes les barres d’échelle mesurent 250 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 : NAD(P)H-FLIM des villosités de l’hôte et du tissu du nématode indiquant l’état métabolique et les voies métaboliques préférentielles chez l’hôte et le parasite. (A) L’activité métabolique générale moyenne déterminée à partir des cartes d’activité masquée pour l’épithélium (EP) (78,4 % ± 5,5 %) et la lamina propria (LP) (76,3 % ± 5,2 %) dans le duodénum murin sain. (B) À la suite de notre analyse, les abondances enzymatiques ont été regroupées selon les voies métaboliques, y compris la glycolyse aérobie, la phosphorylation oxydative/glycolyse anaérobie et l’éclatement oxydatif de l’épithélium (EP) et de la lamina propria (LP) dans le duodénum murin sain. (C, D) Comme pour (A) et (B), une analyse a été effectuée pour le tissu de l’hôte acquis au cours de l’infection aiguë. L’activité métabolique moyenne du tissu de l’hôte au jour 6 était de 74,0 % ± 7,6 %, au jour 10, de 72,4 % ± 10,5 % et au jour 14, de 73,5 % ± 11,4 %. (E, F) Comme en (C) et (D), le tissu parasitaire a été analysé au cours de la phase aiguë de la maladie. L’activité métabolique moyenne du parasite au jour 6 était de (58,0 % ± 2 %, au jour 10 était de 61,1 % ± 9,9 %, au jour 12 était de 64,5 % ± 5,8 % et au jour 14 était de 73,1 % ± 5,9 %. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test ANOVA (ns p > 0,05, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Durées de vie de fluorescence dépendantes de l’état de liaison au NAD(P)H. Représentation schématique du NAD(P)H non lié (A), I, non lié (libre) lors de l’excitation par absorption de photons au point 0 de la chronologie et de sa durée de vie de fluorescence spécifique à l’état de liaison (τ) à 450 ps. Le même processus est montré pour le NADH (A II) lié à la LDH et (A III) PDH, avec des durées de vie de fluorescence de 1 600 ps et 2 470 ps, respectivement, et du NADPH lié aux NADPH oxydases (NOX) (A IV) avec sa durée de vie de fluorescence de 3 650 ps. (B) Tableau des durées de vie de fluorescence caractérisées du NAD(P)H lié aux enzymes les plus abondantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les étapes critiques du protocole se produisent lors de la préparation et de la recherche du retour sur investissement. Les fibres d’aliments partiellement digérés représentent un défi pour l’imagerie, principalement en raison de la luminescence endogène des fibres chevauchant la fluorescence NAD(P)H, mais aussi en raison de leur signal de génération d’harmoniques. Il est très important de trouver des zones d’investissement exemptes de matières fécales. Nous avons cherché à éviter de mesurer les zones contenant des matières fécales. Le lavage a été évité car il affecte l’intégrité des villosités fragiles et influence la viscosité du mucus. De plus, l’ensemble de la procédure de préparation doit de préférence durer environ 5 à 10 minutes par échantillon, afin d’éviter la dégénérescence et le dessèchement des tissus. De plus, l’agarose à faible concentration utilisée imite la viscosité du mucus intestinal³⁴. Par conséquent, on peut s’assurer que les villosités ne s’effondrent pas pendant que les vers se déplacent librement pendant la mesure. La mesure ne doit pas durer plus de 45 min (Figure 1A,B et Figure 1A,B,C) afin de préserver les meilleures conditions d’imagerie du métabolisme cellulaire. Par conséquent, la recherche de la région d’intérêt (ROI) ne doit pas prendre plus de 15 min. Cependant, pour s’assurer que le tissu maintenu sur la glace chauffe jusqu’à 37 °C souhaité sur la plaque chauffante, l’imagerie doit être effectuée après ~10 min. L’imagerie dure généralement 45 min (voir l’analyse des données TCSPC pour contrôler la viabilité des tissus avant et pendant la mesure ; Figure 1C et Figure 4). Lors de la recherche d’un retour sur investissement approprié, assurez-vous qu’au moins 20 % de la face luminale du tissu duodénal (jours 10 à 14 après l’infection) sous la lentille de l’objectif est couverte par du tissu vermifuge et que le mouvement du parasite est visible. Pour les personnes au jour 6 et les personnes en bonne santé, un retour sur investissement approprié est défini comme celui où l’intégrité des tissus est maintenue après la préparation (généralement, loin des limites de l’échantillon). Cela garantit les meilleures conditions d’entraînement pour le modèle de segmentation et fournit suffisamment de points de données pour une analyse plus approfondie. Pour les stades de l’infection à partir du 10e jour, lorsque les vers pénètrent dans la lumière et se fixent aux villosités, les données ne sont segmentées qu’en fonction du fond et du tissu parasitaire et intestinal à forte activité enzymatique, car en présence des vers, les villosités sont pour la plupart non structurées en raison de la nidification, et l’intégrité tissulaire des villosités n’est plus présente. Pour les tissus explantés au jour 6 et provenant de souris saines, l’intégrité tissulaire permet la segmentation de la lamina propria ainsi que de l’épithélium par rapport au fond. Par conséquent, il est fortement recommandé d’utiliser des modèles entraînés séparément pour les conditions. Le signal surcharge les détecteurs pour les matériaux hautement auto-fluorescents, s’accumulant parfois dans le volume mesuré. Dans ce travail, un contrôle dynamique de la puissance laser a été utilisé sur toute la profondeur d’imagerie dans le logiciel.

Les limites de cette technique sont liées aux limitations physiques du volume d’excitation. La résolution axiale de la lentille de l’objectif a déjà été déterminée à 1,3 μm à 850 nm²⁸, mais comme elle se dégrade généralement dans les tissus, nous avons trouvé qu’une taille de pas de 2 μm était appropriée. Avec un champ de vision de 0,5 mm x 0,5 mm, chaque tranche est de 505 pixels x 505 pixels. La résolution latérale de l’objectif est de ~ 350 nm ; Cependant, en raison de la dégradation de la résolution^24,28, une taille de pixel de ~ 1 μm s’est avérée suffisante. Cela signifie que la mesure suit une approche stochastique. La courbe de décroissance acquise est composée de la somme de toutes les courbes de décroissance, c’est-à-dire de toutes les durées de vie de fluorescence dans le volume sortant de ~1 x 1 x 2 μm³. Le nombre de photons enregistré au fil du temps pour chaque voxel (la durée de vie de fluorescence mesurée ou pile TCSPC) suit la forme d’une courbe de décroissance multi-exponentielle ou la combinaison linéaire de courbes de décroissance multi-exponentielle, ce qui est difficile à prévoir. Une analyse de Fourier normalisée sans modèle a été utilisée pour analyser la courbe complexe de décroissance de la fluorescence dans chaque voxel, appelée analyse de phaseur. Les piles ont été convolutées à l’avance avec un filtre gaussien (σ2) pour réduire le bruit dans les images de fluorescence résolues en temps. La perte de résolution spatiale est acceptable et constitue un compromis pour une meilleure résolution de la durée de vie de la fluorescence.

Le temps d’acquisition de l’image est de l’ordre de 2,5 s à 7 s (moyenne moyenne), et le temps d’acquisition d’une pile z typique de 500 x 500 x 200 μm³ (505 x 505 x 101 voxel) prend ~ 450 s (7,5 min). Ces moments entraînent souvent le déplacement d’artefacts causés par les parasites au cours d’une mesure. Dans ce cas, les données restent utilisables. Parfois, les parasites se déplacent en dehors du volume mesuré pendant la mesure.

À l’aide de l’imagerie de la durée de vie de fluorescence du NADH et du NADPH du tissu duodénal murin excisé de souris infectées par le nématode H. polygyrus et de notre cadre d’analyse précédemment publié utilisant les durées de vie de fluorescence de référence du NAD(P)H lié à des enzymes fréquemment dépendantes du NAD(P)H, l’activité métabolique générale et les voies métaboliques distinctes dans le tissu intestinal de l’hôte et le tissu parasitaire ont été visualisées et analysées ; Cette analyse a révélé l’interaction métabolique entre les deux. Par ailleurs, si l’information sur l’activité métabolique globale ou sur l’équilibre entre le NADH et le NADPH est intéressante, des algorithmes robustes et des routines logicielles généralement applicables sont disponibles et peuvent être utilisés^22,23.

Le protocole présenté ici et la procédure d’analyse établie représentent une méthode généralisée de mesure du métabolisme et des voies métaboliques qui est applicable à d’autres organes et à d’autres types de pathologies 13,15,16,17,19,20.

Par rapport à, par exemple, l’analyse sur cellule unique avec cytométrie, l’élégance de la méthode réside dans la possibilité d’obtenir des informations spatiales subcellulaires sur les voies métaboliques avec une intervention minimale et de manière sans marquage dans les systèmes biologiques, avec la possibilité d’utiliser des marqueurs ou des colorants supplémentaires pour une densité d’information plus élevée. L’interférence avec le tissu biologique et les processus d’infection qui y sont liés sont minimes en raison du choix d’un parasite naturellement présent chez les rongeurs ainsi que de l’examen préliminaire du tissu intestinal et de sa comparabilité avec les tissus vivants en termes de vitalité. Avec une segmentation et une normalisation appropriées, des mesures comparables peuvent être générées sur la quatrième dimension (temps).

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Nous remercions Robert Günther pour son excellent support technique. Soutien financier du Conseil allemand de la recherche (DFG) au titre des subventions SPP2332 HA2542/12-1 (S.H.), NI1167/7-1 (R.A.N.), HA5354/11-1 (A.E.H.) et RA2544/1-1 (S.R.), au titre de la subvention SFB1444, P14 (R.A.N., A.E.H.), au titre de la subvention HA5354/8-2 (A.E.H.), et au titre des subventions GRK2046 B4 et B5 (S.H., S.R.) et HA2542/8-1 (S.H.) sont grandement reconnus. W.L. a obtenu une bourse de doctorat de la Berliner Hochschule für Technik, École des sciences appliquées, Berlin en physique médicale/génie physique.