Просвечивающая электронная микроскопия: инструмент хирургической патологии при нейробластоме

Небольшие круглые синеклеточные опухоли у детей представляют собой интригующую и сложную коллекцию новообразований. Поэтому просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и профессиональные знания об опухолях у детей могут быть чрезвычайно ценными в хирургической патологии. Здесь мы представляем протокол проведения ПЭМ для диагностики нейробластомы, одной из наиболее распространенных солидных опухолей в детском возрасте.

Малые круглые синеклеточные опухоли у детей (PSRBCT) представляют собой интригующую и сложную коллекцию новообразований. Световая микроскопия небольших круглых опухолей голубых клеток выявляет маленькие круглые клетки. Они содержат в целом гиперхроматическое ядро и относительно скудную базофильную цитоплазму. Детские небольшие круглые синеклеточные опухоли включают в себя несколько образований. Обычно они включают опухоль Вильмса, нейробластому, рабдомиосаркому, саркому Юинга, ретинобластому, лимфому и мелкоклеточную остеосаркому, среди прочих. Даже с помощью иммуногистохимии дифференциальный диагноз этих новообразований может быть спорным при световой микроскопии. Слабое окрашивание или неоднозначный фон могут отпугнуть патологоанатомов от принятия правильного диагностического решения. Кроме того, молекулярная биология может предоставить огромное количество данных, которые трудно различить, а некоторые транслокации могут быть замечены более чем в одной категории. Таким образом, просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) может быть чрезвычайно ценной. Здесь мы делаем акцент на современном протоколе обработки данных ПЭМ нейробластомы. Опухолевые клетки с клубками цитоплазматических отростков, содержащими нейросекреторные гранулы, могут диагностировать нейробластому.

Работа патологоанатома может быть довольно сложной как в клинической диагностике, так и в исследовательской сфере. Эволюция световой микроскопии в^18-м и^19-м веках была замечательной. Мощность электронного микроскопа опирается в первую очередь на длину волны электронов, которая короче светового ^1,2,3. До появления поликлональных и моноклональных антител и их применения в иммуногистохимии ПЭМ играл важную роль в диагностике небольших круглых синеклеточных опухолей.

Начиная с 90-х годов прошлого века, иммуногистохимический подход заменил морфологический инструмент в диагностике⁴. В настоящее время существуют тысячи новых поликлональных и моноклональных антител, направленных на антигены небольшой круглой синеклеточной опухоли группы 4,6,7,8. В последнее десятилетие очень плодотворного^20-го века и в первом десятилетии начала^21-го века молекулярная биология, включая флуоресцентную гибридизацию in situ, от геномных зондов до секвенирования следующего поколения, по-видимому, вытеснила значительную прикладную роль иммуногистохимии в нескольких лабораториях. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) в Соединенных Штатах Америки, Канадское агентство по контролю за продуктами питания (CFIA) в Канаде, Агентство по охране окружающей среды (EPA) или аналогичные правительственные органы в других странах не всегда одобряют протоколы молекулярной биологии⁹. Кажется, что существует много информации, которую довольно сложно вставить в отчет о патологии, которая может быть использована в терапевтических целях, и выбор хорошо финансируемой и функционирующей лабораторной информационной^{системы имеет решающее} значение. В то же время иммуногистохимия выявила многочисленные подводные камни: эпителиальные опухоли демонстрируют мезенхимальные маркеры и наоборот¹¹. Эпителиально-мезенхимальный переход спутал некоторые границы в группах патологии^12,13. В последние несколько лет стало очевидным, что электронная микроскопия процветает в нескольких лабораториях^{по всему} миру. В частности, время обработки образцов тканей сократилось с недель до всего лишь 3 дней и даже меньше при использовании нескольких протоколов, приближающихся к окрашиванию моноклональными или поликлональными антителами ^4,10.

Кроме того, применение электронной камеры, соединенной с электронным микроскопом, помогло патологоанатомам получить быстрое изображение, которое является универсальным в различных операционных системах. Наконец, некоторые антитела, даже после забора антигена, трудно выявить в некоторых областях некроза или изменений, связанных с аутофагией/ишемией. В то же время электронная микроскопия в надежных руках все еще может дать отличные результаты и подсказки для правильной классификации неизвестных патологических^{опухолей.}

Педиатрическая группа малых круглых синеклеточных опухолей включает в себя несколько опухолей, в основном нейробластому, опухоль Вильмса или нефробластому, рабдомиосаркому и саркому Юинга. Данные молекулярной биологии относительно педиатрической группы небольших круглых опухолей голубых клеток могут быть ошеломляющими из-за применяемых методов. Маленькие круглые голубые клетки могут не сильно отличаться при обычном окрашивании (окрашивание гематоксилином и эозином), а некоторые опухоли могут иметь аберрантные иммунофенотипические признаки. С момента открытия ПЭМ в молекулярной биологии были достигнуты огромные успехи. В группе небольших круглых синеклеточных опухолей некоторые новообразования могут встречаться чаще, чем другие, но их необходимо учитывать. Несмотря на то, что папиллярная почечно-клеточная карцинома по существу не является небольшой круглой синеклеточной опухолью, а в основном имеет сосочки, она может иметь некоторые круглые клеточные участки, которые, возможно, необходимо отличать от других хорошо известных небольших круглых синеклеточных опухолей (например, опухоли Вильмса) с использованием нескольких^{вспомогательных методов.} В конечном счете, метанефрические стромальные опухоли также могут нуждаться в дифференциальной диагностике¹⁷. Рабдоидная опухоль является особенно злокачественной опухолью у детей, относящейся к почечному и внепочечному подтипу¹⁸.

Нейробластома является одним из наиболее распространенных солидных злокачественных новообразований в младенчестве и детстве. Клетки нейробластомы – это злокачественные клетки этой солидной опухоли, которые коварно возникают из производных первичного нервного гребня. Его диагностика и дифференциальная диагностика могут быть затруднены. Его естественная биология претерпела замечательный прогресс за последние пару десятилетий. Семейство транскрипционных факторов forkhead характеризуется отчетливым доменом «forkhead» (FOXO3/FKHRL1). Эти факторы транскрипции функционируют как триггер апоптоза (запрограммированной гибели клеток) за счет экспрессии генов, необходимых для клеточной гибели. FOXO3/FKHRL1 активируется 5-аза-2-дезоксицитидином и индуцирует молчаливую каспазу-8, и этот комплекс играет решающую роль в развитии нейробластомы. Ядерный FOXO3 предсказывает неблагоприятные клинические исходы и способствует ангиогенезу опухоли при нейробластоме ^7,19. Несмотря на достижения в области молекулярной патологии, классификация Шимада остается стандартом практики для любого патологоанатома и детского онколога. Это имеет решающее значение для дифференциации между благоприятной и неблагоприятной гистологией 20,21,22,23.

Обоснование разработки простого протокола для электронной микроскопии опухолей с подозрением на нейробластому связано с целесообразностью и обоснованностью ультраструктурного исследования образца ткани. Он редко изменяется из-за проблем, обычно возникающих при использовании иммуногистохимии. Обоснование и протокол были положены в основу нескольких учебников и научных статей по детской патологии и электронной микроскопии ^4,24,25. Этот протокол охватывает опыт трех десятилетий работы автора и будет сосредоточен на нескольких PSRBCT, уделяя особое внимание личному опыту и обзору литературы.

Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием людей, соответствовали этическим нормам институционального и/или национального исследовательского комитета, а также Хельсинкской декларации 1964 года и более поздним поправкам к ней или сопоставимым этическим стандартам. Исследование методом электронной микроскопии является частью обычной процедуры микроскопического исследования образцов, полученных в диагностических целях, и не требует одобрения Комитета по биоэтике. Данное исследование является ретроспективным и соблюдает полную анонимность образцов.

1. Протокол ПЭМ для забора FFPE (фиксированных формалином и парафином) и образцов тканей, фиксированных глутаральдегидом

1. Извлеките последние препараты, окрашенные гематоксилином и эозином, и тканевый блок FFPE.
2. С помощью перманентного маркера выберите интересующую область на предметном стекле и сопоставьте ее с областью на тканевом блоке.
3. Вырежьте выбранный участок новым лезвием бритвы из блока и аккуратно нарежьте его на кубики по 5 мм на фильтровальной бумаге.
4. Поместите фильтровальную бумагу с извлеченной салфеткой в чашку Петри с этикеткой. Поместите чашку Петри в духовку при температуре 60-70 °C на 15 минут, т.е. пока парафин не расплавится (парафин состоит из смеси твердых углеводородов с прямой цепью в температуре плавления 48-66 °C (от 120 до 150 °F)) и не впитается фильтровальной бумагой.
5. Переложите извлеченную ткань без парафина в сцинтилляционный флакон, наполненный 4 мл 100% толуола (метилбензола) v/v [100% толуол означает 100 мл толуола]. Убедитесь, что образцы непрерывно вращаются в процессе депарафинизации (скорость вращения: 24 оборота/мин).
6. Пройдите через две замены толуола, по 1 часу каждая, и одну замену 4 мл 100% толуола по 30 минут каждая, используя вращающееся устройство под углом.
7. Проведите через одну замену 4 мл 100% абсолютного этанола (C₂H₅OH) в течение 1 ч, а затем две замены 4 мл 100% абсолютного этанола в течение 30 мин каждая. Затем еще одна смена 30 мин в 4 мл 70% этанола.
8. Проведите через одну замену 4 мл 0,1 М буфера какодилата натрия в течение 30 минут. Перенесите образцы в 4 мл 2,5% глутаральдегида и держите при 4 °C до обработки.
9. Используйте следующие шаги в автоматизированном тканевом процессоре для стандартизации обработки: 0,1 М буфер какодилата натрия в течение 5 мин, 2% тетраоксид осмия в течение 1 ч и 50 мин, dH₂O в течение 5 мин, 50% этанол в течение 15 мин, 70% этанол в течение 30 мин, 100% этанол в течение 15 мин (три раза), 100% этанол в течение 30 мин (три раза), 100% этанол в течение 45 минут, ацетон в течение 50 минут, смола в течение 1 часа (два раза) и свежая смола в течение ночи. Объем всех растворов составляет 15 мл.
10. Залейте свежей смолой прямо из тканевого процессора.
    1. Поместите полиэтиленовые капсулы в держатель с пронумерованными полосками бумаги. Капните в капсулы свежую смолу, переложите образец в соответствующие блоки и оставьте блоки на ночь в духовке при температуре 60 °C (140 °F).
11. Полутонкие (500 нм) срезы окрасить 1% толуидинового синего на конфорку, минимальный нагрев в течение 30 с, прополоскать при dH₂O, а затем установить покровную крышку.
12. Здесь микротом Ultracut (UCM) используется для резки полутонких секций.
    1. Возьмите закладной блок из смолы и установите его в держатель блока UCM. Затем установите держатель блока на столик UCM и затяните его.
    2. Разрежьте излишки смолы вокруг образца с помощью лезвия бритвы с однолезвием с помощью окуляра. Вырежьте лицевую сторону блока в форме трапеции.
    3. Снимите держатель блока со сцены и установите его в кронштейн UCM, плотно затянув. Далее установите держатель лезвия на столик UCM. Наконец, затяните стеклянный нож на держателе лезвия.
    4. Используя окуляры и свет, обеспечиваемый UCM, медленно, как можно ближе подведите край стеклянного ножа к поверхности смоляного блока, который нужно разрезать. Затяните держатель лезвия на месте на сцене.
    5. Установите толщину резки UCM на 500 нм и обрежьте смоляной блок до 75% по всей поверхности.
    6. Поменяйте стеклянный нож на новый. Добавьте стерильную воду в резервуар для стеклянного ножа.
    7. Нанесите на предметное стекло микроскопа маркировку с номером случая и капните на предметное стекло четыре отдельные капли стерильной воды.
    8. Еще при настройке 500 нм вырезаем четыре секции из блока. С помощью тонких щипцов переведите по 1 секции за раз в одну из капель воды на предметное стекло. Каждая капля на слайде будет содержать одну секцию. Сушите предметное стекло на горячей плите при самом низком нагреве до полного высыхания (30 с).
13. Окрашиваем методом Толуидина синего. Промойте в воде и накройте крышкой. Рассмотрите срезы толуидинового синего под световым микроскопом. Если видны нужные тканевые структуры, разрежьте ультратонкие срезы. Если желаемые тканевые структуры не видны, вырежьте более глубокие срезы и окрашивайте их, используя те же шаги, пока желаемые структуры не обнажаются и не будут показаны на синем предметном стекле толуидина.
14. Когда из толуидинового синего среза будет определена нужная область для электронной микроскопии, вырежьте ультратонкие срезы на медных сетках. Ультратонкие ломтики нарезать с помощью ультрамикротома (образцы, предназначенные для просмотра в ПЭМ, должны быть нарезаны очень тонкими ломтиками (80 нм)).
    1. Возьмите закладной блок из смолы и установите его в держатель блока UCM. Затем установите держатель блока на столик UCM и затяните его.
    2. С помощью окуляра разрежьте смолу вокруг нужной области для электронной микроскопии с помощью лезвия бритвы с однолезвийным покрытием. Разрежьте лицевую сторону блока в форме трапеции, размером не более 1 мм квадрата. Если желаемую область для электронной микроскопии трудно увидеть из-за яркого света, используйте каплю хлороформа, чтобы выделить структуры в блоке смолы.
    3. Снимите держатель блока со сцены и установите его в кронштейн UCM, плотно затянув. Далее установите держатель лезвия на столик UCM. Наконец, затяните алмазный нож на держателе лезвия.
    4. Используя окуляры и свет, обеспечиваемый UCM, медленно, как можно ближе сдвиньте край алмазного ножа к поверхности смоляного блока, который нужно резать. Затяните держатель лезвия на месте на сцене.
    5. Отрегулируйте различные углы наклона алмазного ножа с помощью винтов UCM. Следите за тем, чтобы край алмазного ножа был максимально точно выровнен с поверхностью разрезаемого блока. Наполните резервуар алмазного ножа стерильной водой.
    6. Установите UCM на толщину 80 нм и скорость 1 мм/с. Здесь для ультратонкой резки используется автоматизированная функция. Установите окно резки на UCM (верх и низ грани блока).
    7. Нажмите кнопку «Пуск » на UCM, чтобы начать секционирование. Секции будут плавать на стерильном резервуаре алмазного ножа.
    8. Когда будет срезано достаточное количество секций, используйте пары хлороформа, чтобы выпрямить срезы. Обмакните ватный тампон в хлороформ и проведите им над срезами, не касаясь их.
15. Опустите медную сетку в 100% спирт, а затем в стерильную воду с помощью тонких щипцов. Очистите каждую решетку перед использованием. Выделите секции на нескольких сетках.
16. Оставьте сетки с секциями на маркированной фильтровальной бумаге. Поместите эту фильтровальную бумагу в чашку Петри и поставьте в духовку при температуре 60 °C на 30 минут, чтобы секции высохли на решетках.
17. Затем выполните контрастное окрашивание.
    1. Окрасить решетки в уранилацетат или любой экологически чистый заменитель на 1 мин. Затем промойте их в стерильной воде для инъекций (40 погружений в четыре разные емкости с водой для каждого полоскания после уранилацетата и цитрата свинца). Шаг цитрата свинца также составляет 1 мин.
18. Вставьте решетку в ПЭМ, позволив высоковольтному электронному пучку излучаться катодом и создаваться магнитными линзами. Луч, частично прошедший через тонкий (электронно-полупрозрачный) образец, формирует на экране ПЭМ-информацию (см. ниже).

2. Протокол ПЭМ для сканирования и фотографирования образцов

1. После того, как срезы на сетках будут окрашены, просвечивайте их с помощью электронного микроскопа. На электронном микроскопе включите напряжение ACC до заранее установленного значения (200-300 кВ), которое зависит от используемого электронного микроскопа.
2. На компьютере включите программное обеспечение цифровой камеры и введите номер корпуса. Это важно, потому что микрофотографии сохраняются в соответствующем файле дела.
3. Загрузите сетку в электронный микроскоп, вытяните образец пистолета наполовину и переключите переключатель в положение ВОЗДУХ , чтобы вакуум из камеры пистолета заполнился окружающим (комнатным) воздухом.
4. Как только он наполнится воздухом, вытащите образец пистолета. Поместите образец пистолета на предназначенный для этого держатель. Затем откройте держатель сетки на кончике пистолета.
5. Установите сетку на место. Закройте держатель решетки и убедитесь, что решетка надежно закреплена.
6. Поместите образец пистолета обратно в камеру для образцов на полпути и переключите переключатель в положение EVAC , чтобы создать вакуум в камере для образцов.
7. Зеленый световой индикатор загорится, когда в камере для образцов будет достигнут вакуум. Затем осторожно вставьте образец пистолета в колонку электронного микроскопа и убедитесь, что он не движется слишком быстро. В противном случае он мог бы повредить объект на кончике образца оружия.
8. Как только сетка прочно встанет на место в колонке электронного микроскопа, включите нить накала на промежуточную (заранее установленную) настройку насыщения.
9. Включите камеру с помощью переключателя ВКЛ/ВЫКЛ. На компьютере нажмите « Изображение в реальном времени » в программном обеспечении для обработки изображений.
10. На электронном микроскопе нажмите кнопку «Малое увеличение » и откройте диафрагму объектива. Это позволяет выбрать желаемую зону грохочения. Затем расположите нужную область сечения в центре экрана компьютера, используя два контроллера по обе стороны от колонны электронного микроскопа.
11. На электронном микроскопе нажмите кнопку «Зум» и закройте диафрагму объектива, чтобы получить лучший контраст.
12. Начните просмотр разреза с микрофотографий с увеличением 2500x. Затем отрегулируйте фокусировку с помощью кнопки воблера и кнопки яркости на электронном микроскопе, чтобы обеспечить качество микрофотографии.
13. Нажмите на кнопку «Итоговое изображение» на компьютере, чтобы сделать микроснимок. Если цвета неровные, выполните коррекцию фона в программном обеспечении камеры. Кроме того, отрегулируйте контраст на конечном изображении с помощью программного обеспечения перед сохранением микрофотографии.
14. Когда микрофотография сохраняется, дважды проверьте номер корпуса и увеличение, чтобы обеспечить надлежащую идентификацию сделанных микрофотографий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях пользователь также может ввести дополнительные подписи, а также ввести инициалы технолога электронной микроскопии.
15. Выполните процесс микрофотографирования по всей площади исследуемого среза. После достаточного 2500-кратного увеличения микрофотографии сохраняются, чтобы охватить интересующую область, захватить микрофотографии с 4000-кратным и 8000-кратным увеличением и сохранить их на компьютере с соответствующей идентификацией по номеру дела.
16. Сделайте крупный план раздела для конкретных ультраструктурных деталей, если даны очень конкретные инструкции по скринингу. Затем сохраните измерения конкретных ультраструктурных деталей в компьютере с учетом большего увеличения, если это необходимо.
17. Когда просеивание образцов будет завершено, последовательно выключите нить накала, камеру, высокое напряжение и программное обеспечение камеры. Далее снимите сетку с колонки электронного микроскопа, пропустив воздух в камеру для образца пистолета.
18. Поместите сетку в желатиновую капсулу и храните капсулу в коробке с соответствующей маркировкой вместе с блоками смолы в том же футляре. Поместите образец оружия обратно в патронник пистолета и храните его в прохладном и сухом месте, чтобы сохранить используемый материал.
19. Передавайте цифровые микрофотографии на общие платформы для совместной работы (например, SharePoint) или внутренние серверы, чтобы патологоанатом мог их просмотреть.
20. Введите рабочие единицы в информационную систему лаборатории (ЛИС).
21. Если требуются более конкретные микрофотографии, вытащите сетку полей и повторно используйте их для дополнительного скрининга или конкретных вопросов.

Здесь представлены отличительные особенности нейробластомы в ПЭМ. Здесь мы проиллюстрируем отличительные особенности нейробластомы в ПЭМ.

Нейробластома является одним из наиболее распространенных солидных злокачественных новообразований в младенчестве и детстве. Клетки нейробластомы – это злокачественные клетки этой солидной опухоли, которые коварно возникают из производных первичного нервного гребня. Этот гистогенез объясняет некоторые биохимические и морфологические особенности этой голубой опухоли. Тем не менее, детерминированные цито- и гистопатологические особенности нейробластомы могут специфически колебаться в зависимости от варьируемой степени дифференцировки. Поэтому его диагностика и дифференциальная диагностика могут быть затруднены. Различие нейробластомы с ганглиозными клеточными элементами проявляется в увеличении количества клеточной цитоплазмы с развитием цитоплазматического процесса и изменением ядерного изображения (рис. 1A-D). Увеличение ядра и видимое ядрышко характерны для дифференцировки нейробластомы. Также может быть замечена дифференциация на шванновские клетки. Электронно-микроскопическое исследование выявило нейросекреторные гранулы (средний диаметр 100 нм), постоянно присутствующие с нейритоподобными цитоплазматическими проекциями или без них, содержащими микротрубочки и тонкие промежуточные филаменты²⁶. Недостаток гликогена характеризует нейробластому, и если его редко наблюдать, он никогда не образует агрегатов. По степени дифференцировки различают ультраструктуру нейробластомы. Для этого новообразования характерны нейросекреторные или катехоламиновые гранулы, диаметром которых составляет около 150 нм. Нейросекреторные гранулы необходимо отличать от десмосомоподобных структур. Нейросекреторные гранулы можно увидеть вблизи интрацитоплазматических филаментов (нейрофиламентов). Клеточные отростки часто пухлые и цилиндрические и обычно называются нейритами (аксонами и дендритами). Некоторые клеточные отростки содержат митохондрии, которые имеют решающее значение для движения опухолевой клетки. Нейриты содержат микротрубочки, но также могут иметь набухшие митохондрии. В случае возникновения низкодифференцированной нейробластомы чаще можно обнаружить некоторые особенности. К ним относятся более значительная нерегулярность морфологии ядра, многочисленные митозы и апоптотические фигуры, малое количество микротрубочек и клеточных процессов, контрастирующее с почти постоянным присутствием нейрофиламентов, недостаток нейритов, которые содержат чаще митохондрий, чем микротрубочки, отсутствие или очень малое количество синаптических соединений, отсутствие гликогена, площадь многочисленных полирибосом, малое количество нейросекреторных гранул. Нейросекреторные гранулы имеют решающее значение для дифференциации нейробластомы от других PSRBCT, включая эмбриональную рабдомиосаркому, эозинофильную гранулему, мелкоклеточную остеосаркому и саркому ретикулумных клеток, которые могут вызывать диагностические трудности из-за наличия цитоплазматической гранулярности.

Рисунок 1: ПЭМ нейробластомы. (A-C) Нейробластоматические клетки низкодифференцированного типа с высоким соотношением ядер к цитоплазме и несколькими органеллами. Хроматин рассеян в ядре, но также концентрируется на периферии, близкой к ядерной мембране. Ядрышко видно в ядре в правом верхнем углу (масштабная линейка: 2 мкм). (D) Клетки нейробластомы с нейросекреторными гранулами, демонстрирующими характерную двойную мембрану (масштабная линейка: 200 нм). Красные стрелки указывают на ядрышки, синие стрелки указывают на гетерохроматин, оранжевые стрелки определяют эухроматин, зеленые стрелки фокусируются на митохондриях, а желтые стрелки указывают на везикулы, напоминающие нормальные пресинаптические окончания. Тем не менее, везикулы при нейробластоме больше и более неправильные, чем классические пресинаптические окончания. Наконец, черные стрелки обнажают многочисленные нейросекреторные гранулы с плотным ядром. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В этом повествовательном обзоре с соответствующим протоколом мы выделили отличительные ультраструктурные особенности нейробластомы. В конце концов, мы предполагаем, что электронная микроскопия далеко не «мертвая» или древняя техника, постулирующая открытие новой роли в сочетании с технологиями омикса одиночных клеток. В этой статье мы хотели бы подчеркнуть недавнюю роль электронной микроскопии в детской патологии ^4,27. Ниже подробно описаны критические шаги, модификации и устранение неполадок метода, а также ограничения.

Этот протокол состоит из нескольких важных шагов. Во-первых, необходимо вырезать нужную область для электронной микроскопии. Край ромба должен быть отрегулирован так, чтобы он был обращен к лицевой стороне блока как можно ближе. Для этого нужна очень твердая рука. Следует соблюдать осторожность при подборе плавающей секции с медными решетками.

Модификации и устранение неисправностей техники включают в себя несколько аспектов, которые необходимо учитывать. Каждый образец отличается такими качествами, как плотность и характер, которые варьируются. Учитывая природу и плотность материала, не все образцы тканей режутся одинаково. Например, некоторые образцы нейробластомы могут быть недифференцированными или плохо дифференцированными, в то время как другие могут демонстрировать высокую степень дифференцировки и различную степень кальцинатов. Иногда приходится вырезать несколько секций, чтобы получить несколько хороших секций для дальнейшей обработки. Очень важно избегать любых вибраций: дыхательных, настольных, компрессоров из ЭМ-прицелов. Если вы столкнулись с раскалыванием секций, может быть важно затянуть винты UCM. Если на срезах видны царапины, смените алмазный нож, который будет использоваться для резки. Иногда артефакты резки видны только на последнем этапе. Если под электронным микроскопом обнаружены артефакты резки, ультратонкие срезы должны быть разрезаны повторно после выявления причины артефакта.

ПЭМ имеет очевидные ограничения, а окно наблюдения даже меньше, чем при использовании обычной световой микроскопии. Желаемая площадь для электронной микроскопии не может быть больше 1 квадратного мм. Иногда большая площадь может пойти на пользу для просеивания, но это невозможно сократить. Он не поместится на медной сетке, повредит алмазный нож, а качество сечения точно будет ниже. Необходимо сделать определенный выбор, и выбрать наиболее важное сооружение или зону на момент показа. Скорость резки не может быть увеличена; Это приведет к появлению артефактов резки на секциях. Скорость 1 мм/с остается критической.

В дополнение к перечисленным выше классическим признакам (например, нейросекреторным гранулам), ультраструктура митохондрий в клетках нейробластомы, исследованных с помощью ПЭМ, часто демонстрирует замечательные уровни митофагии, селективный клеточный механизм контроля качества митохондрий, позволяющий деградацию митохондрий, которые клетки считают поврежденными и/или ненужными^28,29. В результате в митохондриях происходит набухание, разрыв кристаллов и их исчезновение. На самом деле, Radogna et al. обнаружили, что эффективная митофагия является критическим механизмом, приводящим к сбою активации пути программной гибели клеток, что повышает резистентность SK-N-AS, клеточной линии нейробластомы с усиленным синтезом инсулиноподобного фактора роста II (IFG-II) и РНК IGF-II и содержит рецепторы IGF I типа к UNBS1450, геми-синтетическому карденолиду, принадлежащему к семейству сердечных стероидных гликозидов. запуск некроптоза при несколько более высоких дозах³⁰.

Особенно актуальной для дифференциальной диагностики является роль ПЭМ при саркоме Юинга. Саркома Юинга считается эквивалентной периферической нейроэктодермальной клеточной опухоли, хотя в последнее время велись некоторые споры 31,32,33. Практически, в примитивных клетках саркомы Юинга основными характеристиками являются обилие цитоплазматического гликогена, слабо развитые клеточные соединения и отсутствие нейронных особенностей. Существует поразительное сходство периферической нейроэктодермальной опухоли с саркомой Юинга при электронной микроскопии. На самом деле, обе опухоли считаются одним и тем же образованием и лечатся по одним и тем же терапевтическим протоколам как в SIOP (Международное общество детской онкологии), так и COG (Детская онкологическая группа), а также в UKCCSG (Группа по изучению детского рака в Соединенном Королевстве), поскольку они имеют одну и ту же хромосомную транслокацию. Тем не менее, при ПНЭО присутствуют некоторые нейронные особенности, в том числе нейросекреторные гранулы, которые практически отсутствуют при саркоме Юинга. Эта спецификация также отражает иммуногистохимический фенотип. Существует положительный результат, по крайней мере, в отношении одного или двух нейронных маркеров, например, нейрон-специфической енолазы, S-100, синаптофизина или нейрофиламентов. Franchi et al. изучили ES-PNET³¹. В большинстве случаев неопластические клетки имели типичную ультраструктуру, включающую плотно упакованные, низкодифференцированные клетки, овальной или многоугольной формы. Эти клетки содержат круглое или овальное ядро с тонко диспергированным хроматином и одним или двумя ядрышками. В цитоплазме крошечные органеллы отражают плохую дифференцировку этих опухолевых клеток. Тем не менее, пристальное внимание к деталям может выявить наличие митохондрий, нескольких грубых структур эндоплазматического ретикулума (так называемых цистерн), спорадических лизосом и свободных рибосом. Накопление гликогена может быть легко обнаружено. Гликоген можно рассматривать как диспергированный или объединенный. Промежуточные филаменты часто наблюдаются как в цитоплазменных, так и в цитоплазматических процессах опухолевых клеток. Микротрубочки не видны. Рудиментарные соединения могут быть обнаружены примерно в половине случаев при подключении ячеек. Эти структуры состоят из хорошо развитых десмосом с тонофиламентами, если соединения идентифицированы. Можно распознать некоторое накопление материала базальной мембраны и коллагеновых фибрилл во внеклеточном матриксе. Могут наблюдаться плотные гранулы ядра с диаметром, аналогичным гранулам, наблюдаемым при нейробластоме. Как и в иммуногистохимических исследованиях^{предыдущих авторов}, хорошо дифференцированные новообразования, как правило, возникают за пределами скелета, в то время как низкодифференцированные опухоли возникают чаще в костях, чем в мягких тканях.

Подводя итог, можно сказать, что ПЭМ является выдающейся технологией, которая может иметь огромный потенциал в будущем и далеко не мертва в медицине. Внедрение методов молекулярной биологии с последними достижениями в области секвенирования нового поколения подчеркивает непоследовательность континуума в диагностике, но волну прогресса, подобную кенгуру. Внедрение новых методов не должно отпугивать патологоанатомов от постоянного использования электронной микроскопии, потому что как иммуногистохимия, так и молекулярные методы могут быть ошибочными. Некоторые иммуногистохимические паттерны и генетические аномалии не являются опухолево-специфичными и могут плохо коррелировать с гистологией. Насколько нам известно, ПЭМ остается надежным, валидным и воспроизводимым методом в патологии и медицине. ПЭМ является вспомогательным инструментом для исследования небольших круглых синеклеточных опухолей и является убедительным доказательством иммуногистохимического результата. Последовательное применение ПЭМ в современном учреждении может обеспечить высокую оценку межиндивидуального согласия, высокую валидность и эффективную надежность. В ближайшем будущем молекулярные биологи могут искать компетентные и действующие лаборатории электронной микроскопии, которые смогут ответить на конкретные вопросы на ультраструктурном уровне. В частности, мы видим новую перспективу и применение ПЭМ в молекулярной биологии, например, сочетание ПЭМ с экспериментами, направленными на понимание некоторых современных исследований одиночных клеток.

Первый автор получает авторские гонорары от следующих издательств: Springer (https://link-springer-com.bdigitaluss.remotexs.co/book/10.1007/978-3-662-59169-7; ISBN: 978-3-662-59169-7) и Nova (https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/; ISBN: 978-1-53619-816-4). Все гонорары идут в педиатрические благотворительные организации.

Мы высоко оценили опыт и щедрую поддержку доктора Ричарда Вриенда, ранее работавшего сотрудником Службы здравоохранения Альберты в больнице Университета Альберты, и Стивена Джоя (1972-2019), также ранее работавшего сотрудником Службы здравоохранения Альберты в больнице Университета Альберты. Мы посвящаем эту работу памяти г-на Джоя, старшего технолога-эксперта по ультраструктурным исследованиям, который трагически и безвременно ушел из жизни несколько лет назад. Г-н Джой был одним из основных участников большинства исследований в области электронной микроскопии в провинции Альберта, Канада. Наши мысли и молитвы за него и его семью. Мы также в долгу перед г-жой Лесли Бернет за ее помощь и советы. Исследования доктора К. Серджи финансировались за счет щедрости Детской больницы Восточного Онтарио, Оттава, Онтарио, и Фонда детской больницы Столлери, а также поддержки Женской больницы Лоис Хоул через Научно-исследовательский институт женского и детского здоровья (WCHRI, Grant ID #: 2096), Фонд естественных наук провинции Хубэй для Хубэйского технологического университета (грант 100 талантов для программы набора иностранных экспертов, общее финансирование: Цифровая диагностика инфекций и онкологии на основе ПЦР и NGS, 2017-2022 гг.), Австрийский исследовательский фонд (Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, FWF, Grant ID L313-B13), Канадский фонд женского здоровья («Раннее сердце плода-RES0000928»), Канадский фонд женского здоровья («Раннее сердце плода-»), Общество исследования рака (экспрессия гена фактора фон Виллебранда в раковых клетках), Канадские институты исследований в области здравоохранения (Омега-3 жирные кислоты для лечения заболевания печени, связанного с кишечной недостаточностью: трансляционное научное исследование, 2011-2014, CIHR 232514) и Саудовское культурное бюро, Оттава, Канада. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.