Transmissionselektronenmikroskopie: Ein chirurgisches Pathologiewerkzeug für Neuroblastome

Pädiatrische kleine runde blauzellige Tumoren sind eine faszinierende und herausfordernde Ansammlung von Neoplasien. Daher können die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und das Fachwissen über pädiatrische Tumoren in der chirurgischen Pathologie äußerst wertvoll sein. Hier stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von TEM zur Diagnose des Neuroblastoms, einem der häufigsten soliden Tumoren im Kindesalter, vor.

Pädiatrische kleine runde blauzellige Tumoren (PSRBCT) sind eine faszinierende und herausfordernde Ansammlung von Neoplasien. Die Lichtmikroskopie von kleinen runden blauen Zelltumoren identifiziert kleine runde Zellen. Sie beherbergen einen im Allgemeinen hyperchromatischen Kern und ein relativ spärliches basophiles Zytoplasma. Pädiatrische kleine runde blauzellige Tumoren umfassen mehrere Entitäten. In der Regel umfassen sie unter anderem Wilms-Tumor, Neuroblastom, Rhabdomyosarkom, Ewing-Sarkom, Retinoblastom, Lymphom und kleinzelliges Osteosarkom. Auch mit Hilfe der Immunhistochemie kann die Differentialdiagnose dieser Neoplasien in der Lichtmikroskopie umstritten sein. Eine schwache Färbung oder ein unklarer Hintergrund können Pathologen davon abhalten, die richtige diagnostische Entscheidung zu treffen. Darüber hinaus kann die Molekularbiologie eine überwältigende Menge an Daten liefern, die schwer zu unterscheiden sind, und einige Translokationen können in mehr als einer Kategorie beobachtet werden. Daher kann die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) äußerst wertvoll sein. Hier betonen wir das moderne Protokoll für TEM-Daten des Neuroblastoms. Tumorzellen mit einem Gewirr von zytoplasmatischen Prozessen, die neurosekretorische Granula enthalten, können ein Neuroblastom diagnostizieren.

Die Arbeit eines Pathologen kann sowohl in der klinischen Diagnostik als auch in der Forschung eine ziemliche Herausforderung darstellen. Die Entwicklung der Lichtmikroskopie im 18^{. und} 19^. Jahrhundert war bemerkenswert. Die Leistung eines Elektronenmikroskops hängt in erster Linie von der Wellenlänge der Elektronen ab, die kürzer als Licht ^1,2,3 ist. Vor dem Aufkommen der polyklonalen und monoklonalen Antikörper und ihrer Anwendung in der Immunhistochemie spielte TEM eine einflussreiche Rolle bei der Diagnose kleiner runder blauzelliger Tumoren.

Seit den 90er Jahren des letzten Jahrhunderts hat der immunhistochemische Ansatz das morphologische Werkzeug in der Diagnostik ersetzt⁴. Derzeit gibt es Tausende neuer polyklonaler und monoklonaler Antikörper, die gegen Antigene der kleinen runden blauen Zelltumorgruppe 4,6,7,8 gerichtet sind. Im letzten Jahrzehnt des äußerst produktiven 20^. Jahrhunderts und im ersten Jahrzehnt zu Beginn des 21^. Jahrhunderts scheint die Molekularbiologie, einschließlich der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, von genomischen Sonden bis hin zur Next-Generation-Sequencing, die bedeutende Anwendungsrolle der Immunhistochemie in mehreren Laboratorien abgelöst zu haben⁴ . Die Food and Drug Administration (FDA) in den Vereinigten Staaten von Amerika, die kanadische Lebensmittelinspektionsbehörde (CFIA), die Environmental Protection Agency (EPA) oder ähnliche Regierungsbehörden in anderen Ländern genehmigen molekularbiologische Protokolle nicht immer⁹. Es scheint, dass es eine Menge Informationen gibt, die in einen pathologischen Bericht eingefügt werden können, die für therapeutische Zwecke verwendet werden können, und die Wahl eines gut finanzierten und funktionierenden Laborinformationssystems ist entscheidend¹⁰. In der Zwischenzeit hat die Immunhistochemie zahlreiche Fallstricke aufgedeckt, wobei epitheliale Tumoren mesenchymale Marker aufweisen und umgekehrt¹¹. Der epithelial-mesenchymale Übergang hat in den Pathologiegruppen^12,13 einige Grenzen verwirrt. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass die Elektronenmikroskopie in mehreren Labors weltweit floriert¹⁴. Insbesondere hat sich die Durchlaufzeit der Gewebeproben von Wochen auf nur 3 Tage oder sogar weniger verkürzt, wobei mehrere Protokolle verwendet wurden, die sich der Färbung mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern nähern ^4,10.

Darüber hinaus half der Einsatz einer elektronischen Kamera, die mit dem Elektronenmikroskop gekoppelt war, den Pathologen ein schnelles Bild zu liefern, das in verschiedenen Betriebssystemen vielseitig einsetzbar ist. Schließlich ist es schwierig, einige Antikörper, selbst nach Antigengewinnung, in einigen Bereichen von Nekrose oder Autophagie-/Ischämie-bedingten Veränderungen nachzuweisen. Gleichzeitig kann die Elektronenmikroskopie in sicheren Händen nach wie vor hervorragende Ergebnisse und Hinweise für die korrekte Klassifizierung unbekannter pathologischer Tumoren liefern¹⁵.

Die Gruppe der kleinen runden blauzelligen Tumoren bei Kindern umfasst mehrere Tumoren, hauptsächlich das Neuroblastom, den Wilms-Tumor oder das Nephroblastom, das Rhabdomyosarkom und das Ewing-Sarkom. Die molekularbiologischen Daten in Bezug auf die pädiatrische Gruppe der kleinen runden blauzelligen Tumoren können aufgrund der angewandten Techniken überwältigend sein. Die kleinen runden blauen Blutkörperchen unterscheiden sich bei Routinefärbungen (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung) möglicherweise nicht wesentlich, und einige Tumoren können abweichende immunphänotypische Merkmale aufweisen. Seit der Entdeckung von TEM sind die Fortschritte in der Molekularbiologie enorm. In der Gruppe der kleinen runden blauzelligen Tumoren können einige Neoplasien häufiger auftreten als andere, aber sie müssen berücksichtigt werden. Obwohl das papilläre Nierenzellkarzinom nicht im Wesentlichen ein kleiner runder blauzelliger Tumor ist, sondern hauptsächlich Papillen aufweist, kann es einige runde Zellbereiche aufweisen, die möglicherweise von anderen bekannten kleinen runden blauzelligen Tumoren (z. B. Wilms-Tumor) unterschieden werden müssen, wobei mehrere ergänzende Techniken verwendet werden müssen¹⁶. Letztlich müssen auch metanephrische Stromatumoren differentialdiagnostisch berücksichtigt werden¹⁷. Der rhabdoide Tumor ist ein besonders bösartiger pädiatrischer Tumor, der sich zwischen dem renalen und dem extrarenalen Subtyp¹⁸ unterscheidet.

Das Neuroblastom ist eine der häufigsten soliden bösartigen Erkrankungen im Säuglings- und Kindesalter. Neuroblastomzellen sind die bösartigen Zellen dieses soliden Tumors, die heimtückisch aus Derivaten der primordialen Neuralleiste entstehen. Die Diagnose und die Differentialdiagnose können schwierig sein. Seine natürliche Biologie hat in den letzten Jahrzehnten bemerkenswerte Fortschritte gemacht. Die Forkhead-Familie der Transkriptionsfaktoren zeichnet sich durch eine ausgeprägte "Forkhead"-Domäne (FOXO3/FKHRL1) aus. Diese Transkriptionsfaktoren fungieren als Auslöser für die Apoptose (programmierter Zelltod) durch die Expression von Genen, die für den Zelltod notwendig sind. FOXO3/FKHRL1 wird durch 5-Aza-2-Desoxycytidin aktiviert und induziert stillgelegte Caspase-8, und dieser Komplex spielt eine entscheidende Rolle beim Neuroblastom. Nukleäres FOXO3 sagt ungünstige klinische Ergebnisse voraus und fördert die Tumorangiogenese beim Neuroblastom ^7,19. Trotz der Fortschritte in der molekularen Pathologie bleibt die Shimada-Klassifikation der Standard für jeden Pathologen und Kinderonkologen. Sie ist entscheidend für die Unterscheidung zwischen günstiger und ungünstiger Histologie 20,21,22,23.

Die Begründung für die Entwicklung eines einfachen Protokolls für die Elektronenmikroskopie von Tumoren, die für ein Neuroblastom verdächtig sind, hängt mit der Machbarkeit und Solidität der ultrastrukturellen Untersuchung der Gewebeprobe zusammen. Sie wird selten durch Probleme verändert, die bei der Immunhistochemie häufig auftreten. Die Begründung und das Protokoll waren die Grundlage für mehrere Lehrbücher und wissenschaftliche Beiträge zur Kinderpathologie und Elektronenmikroskopie ^4,24,25. Dieses Protokoll umfasst die Erfahrung des Autors aus drei Jahrzehnten und konzentriert sich auf einige PSRBCT, wobei der Schwerpunkt auf der persönlichen Erfahrung und der Literaturrecherche liegt.

Alle Verfahren, die in Studien mit menschlichen Teilnehmern durchgeführt wurden, entsprachen den ethischen Standards des institutionellen und/oder nationalen Forschungsausschusses sowie der Erklärung von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards. Die elektronenmikroskopische Untersuchung gehört zur normalen Routine für die mikroskopische Untersuchung der zu diagnostischen Zwecken erhaltenen Proben und bedarf keiner Genehmigung durch die Bioethikkommission. Diese Studie ist retrospektiv und respektiert die vollständige Anonymität der Proben.

1. TEM-Protokoll für FFPE-Entnahme (Formalin-fixiert und Paraffin-eingebettet) und Glutaraldehyd-fixierte Gewebeproben

1. Entnehmen Sie die letzten Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Objektträger und den FFPE-Gewebeblock.
2. Wählen Sie mit einem Permanentmarker den interessierenden Bereich auf dem Gewebeobjektträger aus und ordnen Sie ihn dem Bereich auf dem Gewebeblock zu.
3. Schneiden Sie die ausgewählte Stelle mit einer neuen Rasierklinge aus dem Block aus und schneiden Sie sie auf Filterpapier präzise in 5 mm große Würfel.
4. Legen Sie das Filterpapier mit dem entnommenen Taschentuch in eine beschriftete Petrischale. Die Petrischale für 15 min in einen 60-70 °C heißen Ofen stellen, d.h. bis das Paraffin schmilzt (Paraffinwachs besteht aus einer Mischung von festen geradkettigen Kohlenwasserstoffen mit einem Schmelzpunkt von 48 °C-66 °C (120 bis 150 °F)) und vom Filterpapier absorbiert wird.
5. Übertragen Sie das entnommene paraffinfreie Gewebe in ein Szintillationsfläschchen, das mit 4 ml 100 % Toluol (Methylbenzol) v/v gefüllt ist [100 % Toluol bedeutet 100 ml Toluol]. Stellen Sie sicher, dass sich die Proben kontinuierlich durch den Entparaffinierungsprozess drehen (Rotationsgeschwindigkeit: 24 Umdrehungen/min).
6. Führen Sie zwei Toluolwechsel von jeweils 1 h und einen Wechsel von 4 ml 100% Toluol jeweils 30 Minuten mit einer abgewinkelten Drehvorrichtung durch.
7. Fahren Sie fort durch einen Wechsel von 4 mL 100 % absolutem Ethanol (C₂H₅OH) für 1 h und dann zwei Wechsel von 4 mL 100 % absolutem Ethanol für jeweils 30 Minuten. Dann ein weiterer Wechsel von 30 Minuten in 4 mL 70% Ethanol.
8. Fahren Sie fort durch einen Wechsel von 4 ml 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, 30 min. Die Proben werden in 4 mL mit 2,5 % Glutaraldehyd überführt und bis zur Verarbeitung bei 4 °C aufbewahrt.
9. Verwenden Sie die folgenden Schritte in einem automatisierten Tissue-Prozessor, um die Verarbeitung zu standardisieren: 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für 5 min, 2 % Osmiumtetroxid für 1 h und 50 min, dH₂O für 5 min, 50 % Ethanol für 15 min, 70 % Ethanol für 30 min, 100 % Ethanol für 15 min (dreimal), 100 % Ethanol für 30 min (dreimal), 100% Ethanol für 45 min, Aceton für 50 min, Harz für 1 h (zweimal) und frisches Harz über Nacht. Das Volumen aller Lösungen beträgt 15 mL.
10. Einbetten mit frischem Harz direkt aus dem Tissue-Prozessor.
    1. Positionieren Sie die Polyethylenkapseln in einer Halterung mit nummerierten Papierstreifen. Geben Sie frisches Harz in die Kapseln, geben Sie die Probe in die entsprechenden Blöcke und bewahren Sie die Blöcke über Nacht in einem 60 °C (140 °F) Ofen auf.
11. Halbdünne (500 nm) Abschnitte mit 1 % Toluidinblau auf der Heizplatte färben, Mindesthitzestufe 30 s stellen, in dH₂O spülen und anschließend ein Deckglas aufsetzen.
12. Hier wird das Ultracut-Mikrotom (UCM) zum Trennen von halbdünnen Schnitten verwendet.
    1. Nehmen Sie einen in Harz eingebetteten Block und installieren Sie ihn in den Blockhalter des UCM. Montieren Sie dann den Blockhalter auf der Bühne des UCM und ziehen Sie ihn fest.
    2. Schneiden Sie überschüssiges Harz um die Probe herum mit einer einschneidigen beschichteten Rasierklinge mit den Okularen. Schneiden Sie die Fläche des Blocks in eine trapezförmige Form.
    3. Entfernen Sie den Blockhalter vom Tisch und installieren Sie ihn fest im UCM-Arm. Montieren Sie anschließend den Klingenhalter auf dem UCM-Tisch. Zum Schluss ziehen Sie ein Glasmesser auf den Klingenhalter.
    4. Schieben Sie die Kante des Glasmessers mit den Okularen und dem vom UCM bereitgestellten Licht langsam und so nah wie möglich an die Oberfläche des zu schneidenden Harzblocks. Ziehen Sie den Klingenhalter auf dem Tisch fest.
    5. Stellen Sie die Schnittstärke des UCM auf 500 nm ein und trimmen Sie den Harzblock, bis er zu 75 % vollflächig bedeckt ist.
    6. Tauschen Sie das Glasmesser gegen ein neues aus. Gib steriles Wasser in das Reservoir des Glasmessers.
    7. Beschriften Sie einen Objektträger mit der Fallnummer und geben Sie vier separate Tropfen steriles Wasser auf den Objektträger.
    8. Schneiden Sie bei einer Einstellung von 500 nm vier Abschnitte aus dem Block ab. Übertragen Sie mit einer feinen Pinzette jeweils 1 Abschnitt in einen der Wassertropfen auf dem Objektträger. Jeder Tropfen auf der Folie enthält einen Abschnitt. Trocknen Sie die Folie auf einer Herdplatte bei niedrigster Hitzestufe, bis sie trocken ist (30 s).
13. Färben Sie mit der Toluidinblau-Methode. Spülen Sie es mit Wasser ab und legen Sie ein Deckglas auf. Untersuchen Sie Toluidin-Blauschnitte unter einem Lichtmikroskop. Wenn gewünschte Gewebestrukturen sichtbar sind, schneiden Sie ultradünne Schnitte. Wenn die gewünschten Gewebestrukturen nicht sichtbar sind, schneiden Sie tiefere Schnitte und färben Sie sie in den gleichen Schritten, bis die gewünschten Strukturen freigelegt und auf dem Toluidinblau-Objektträger dargestellt werden.
14. Wenn der gewünschte Bereich für die Elektronenmikroskopie aus den blauen Abschnitten von Toluidin identifiziert ist, schneiden Sie die ultradünnen Abschnitte auf den Kupfergittern. Schneiden Sie ultradünne Scheiben mit einem Ultramikrotom (Proben, die für die Betrachtung im TEM bestimmt sind, müssen in sehr dünne Scheiben (80 nm) geschnitten werden).
    1. Nehmen Sie einen in Harz eingebetteten Block und installieren Sie ihn in den Blockhalter des UCM. Montieren Sie dann den Blockhalter auf der Bühne des UCM und ziehen Sie ihn fest.
    2. Schneiden Sie das Harz mit dem Okular mit einer einschneidig beschichteten Rasierklinge um die gewünschte Stelle für die Elektronenmikroskopie herum. Schneiden Sie die Vorderseite des Blocks in eine Trapezform, die nicht größer als 1 mm im Quadrat ist. Wenn der gewünschte Bereich für die Elektronenmikroskopie aufgrund der Blendung des Lichts schwer zu erkennen ist, verwenden Sie einen Tupfer Chloroform, um die Strukturen im Harzblock hervorzuheben.
    3. Entfernen Sie den Blockhalter vom Tisch und installieren Sie ihn fest im UCM-Arm. Montieren Sie anschließend den Klingenhalter auf dem UCM-Tisch. Ziehen Sie zum Schluss ein Diamantmesser am Klingenhalter fest.
    4. Schieben Sie die Schneide des Diamantmessers mit den Okularen und dem vom UCM bereitgestellten Licht langsam und so nah wie möglich an die Oberfläche des zu schneidenden Harzblocks. Ziehen Sie den Klingenhalter auf dem Tisch fest.
    5. Stellen Sie die verschiedenen Winkel des Diamantmessers mit den Schrauben des UCM ein. Achten Sie darauf, dass die Schneide des Diamantmessers so perfekt wie möglich mit der Oberfläche des zu schneidenden Blocks ausgerichtet ist. Füllen Sie das Reservoir des Diamantmessers mit sterilem Wasser.
    6. Stellen Sie das UCM auf 80 nm Dicke und 1 mm/s Geschwindigkeit ein. Hier wird die automatisierte Funktion für ultradünne Schnitte genutzt. Legen Sie das Schnittfenster auf dem UCM fest (oben und unten auf der Fläche des Blocks).
    7. Drücken Sie die Start-Taste des UCM, um mit dem Schnitten zu beginnen. Die Abschnitte schwimmen auf dem sterilen Reservoir des Diamantmessers.
    8. Wenn genügend Abschnitte geschnitten sind, verwenden Sie Chloroformdämpfe, um die Abschnitte zu begradigen. Tauchen Sie ein Wattestäbchen in Chloroform und führen Sie es über die Abschnitte, ohne sie zu berühren.
15. Tauchen Sie ein Kupfergitter in 100%igen Alkohol und sterilisieren Sie es dann mit einer feinen Pinzette. Reinigen Sie jedes Gitter, bevor es verwendet wird. Wählen Sie die Abschnitte in einigen Rastern aus.
16. Lassen Sie die Gitter mit Abschnitten auf beschriftetem Filterpapier. Legen Sie dieses Filterpapier in eine Petrischale und stellen Sie es für 30 min in den 60 °C heißen Ofen, damit die Abschnitte auf den Gittern trocknen können.
17. Führen Sie dann die Kontrastfärbung durch.
    1. Färben Sie die Gitter 1 Minute lang mit Uranylacetat oder einem anderen umweltfreundlichen Ersatzstoff. Spülen Sie sie dann in sterilem Wasser für die Injektion (40 Tauchgänge in vier verschiedene Wasserbehälter für jede Spülung nach Uranylacetat und Bleicitrat). Der Schritt des Bleicitrats beträgt ebenfalls 1 min.
18. Setzen Sie das Gitter in das TEM ein, so dass ein Hochspannungs-Elektronenstrahl von einer Kathode emittiert und durch magnetische Linsen erzeugt werden kann. Der Strahl, der teilweise durch die dünne (elektronenhalbdurchlässige) Probe durchgelassen wurde, bildet die TEM-Information auf dem Bildschirm (siehe unten).

2. TEM-Protokoll zum Scannen und Fotografieren der Proben

1. Nachdem die Abschnitte auf den Gittern gefärbt sind, werden sie mit dem Elektronenmikroskop gesiebt. Schalten Sie am Elektronenmikroskop die ACC-Spannung auf eine vorher festgelegte Einstellung (200-300 kV) ein, die vom verwendeten Elektronenmikroskop abhängt.
2. Schalten Sie am Computer die Digitalkamera-Software ein und geben Sie die Fallnummer ein. Dies ist wichtig, da die Mikrofotografien in der entsprechenden Fallakte gespeichert werden.
3. Laden Sie das Gitter in das Elektronenmikroskop, ziehen Sie die Pistolenprobe halb heraus und stellen Sie den Schalter auf LUFT , damit sich das Vakuum aus der Probenpistolenkammer mit Umgebungsluft (Raumluft) füllen kann.
4. Sobald es mit Luft gefüllt ist, ziehen Sie die Pistolenprobe heraus. Legen Sie die Pistolenprobe auf den dafür vorgesehenen Halter. Klappen Sie dann den Gitterhalter an der Spitze der Pistole auf.
5. Platzieren Sie das Raster an seinem Platz. Schließen Sie die Gitterhalterung und stellen Sie sicher, dass das Gitter gesichert ist.
6. Setzen Sie die Pistolenprobe nach der Hälfte der Zeit wieder in die Probenkammer ein und legen Sie den Schalter auf EVAC , um ein Vakuum in der Probenkammer zu erzeugen.
7. Die grüne Leuchtanzeige leuchtet auf, wenn das Vakuum in der Probenkammer erreicht ist. Schieben Sie dann die Pistolenprobe vorsichtig in die Elektronenmikroskopsäule und achten Sie darauf, dass sie nicht zu schnell bewegt wird. Andernfalls würde das Objekt an der Spitze der Pistolenprobe beschädigt werden.
8. Sobald das Gitter gut in der Elektronenmikroskopsäule sitzt, schalten Sie das Filament auf die mittlere (vorher festgelegte) Sättigungseinstellung ein.
9. Schalten Sie die Kamera über den EIN/AUS-Schalter ein. Klicken Sie auf dem Computer in der Imaging-Software auf Live Image .
10. Drücken Sie am Elektronenmikroskop die Taste für niedrige Vergrößerung und öffnen Sie die Objektivblende. Dies ermöglicht die Auswahl des gewünschten Screening-Bereichs. Positionieren Sie als Nächstes den gewünschten Bereich des Schnitts in der Mitte des Computerbildschirms, indem Sie die beiden Controller auf beiden Seiten der Säule des Elektronenmikroskops verwenden.
11. Drücken Sie am Elektronenmikroskop die Zoom-Taste und schließen Sie die Objektivblende, um einen besseren Kontrast zu erzielen.
12. Beginnen Sie die Vorführung des Schnitts, indem Sie Mikrofotos mit 2.500-facher Vergrößerung aufnehmen. Stellen Sie dann den Fokus mit der Wobbler-Taste und der Helligkeitstaste am Elektronenmikroskop ein, um die Qualität des Mikrofotos sicherzustellen.
13. Klicken Sie auf dem Computer auf Final Image, um das Mikrofoto aufzunehmen. Wenn die Farben nicht gleichmäßig sind, führen Sie eine Hintergrundkorrektur in der Kamerasoftware durch. Passen Sie außerdem den Kontrast des endgültigen Bildes mit der Software an, bevor Sie das Mikrofoto speichern.
14. Wenn das Mikrofoto gespeichert wird, überprüfen Sie die Gehäusenummer und die Vergrößerung, um eine korrekte Identifizierung der aufgenommenen Mikrofotos sicherzustellen.
    HINWEIS: In einigen Fällen kann der Benutzer auch zusätzliche Untertitel eingeben, und die Initialen des Elektronenmikroskopietechnologen werden ebenfalls eingegeben.
15. Führen Sie das Schliffbild über den gesamten Bereich des zu untersuchenden Schnitts durch. Nach ausreichender 2.500-facher Vergrößerung werden Mikrofotografien gespeichert, um den interessierenden Bereich abzudecken, Mikrofotos mit 4.000- und 8.000-facher Vergrößerung aufzunehmen und auf dem Computer mit der entsprechenden Fallnummernkennzeichnung zu speichern.
16. Machen Sie eine Nahaufnahme des Abschnitts, um spezifische ultrastrukturelle Details zu erfahren, wenn sehr spezifische Screening-Anweisungen gegeben werden. Speichern Sie dann die Messungen bestimmter ultrastruktureller Details auf dem Computer, wobei bei Bedarf höhere Vergrößerungen berücksichtigt werden.
17. Wenn das Probenscreening abgeschlossen ist, schalten Sie nacheinander das Filament, die Kamera, die Hochspannung und die Kamerasoftware aus. Entfernen Sie anschließend das Gitter von der Elektronenmikroskopsäule, so dass Luft in die Probenkammer der Pistole gelangen kann.
18. Feilen Sie das Gitter in eine Gelatinekapsel und bewahren Sie die Kapsel in einer ordnungsgemäß beschrifteten Schachtel auf, zusammen mit den Harzblöcken desselben Gehäuses. Legen Sie die Pistolenprobe zurück in die Pistolenkammer und lagern Sie sie in einer kühlen und trockenen Umgebung, um das verwendete Material zu schonen.
19. Übertragen Sie die digitalen Mikrofotografien auf gängige kollaborative Plattformen (z. B. SharePoint) oder interne Server, damit der Pathologe sie anzeigen kann.
20. Geben Sie die Arbeitseinheiten im Laborinformationssystem (LIS) ein.
21. Wenn spezifischere Mikrofotografien benötigt werden, ziehen Sie das Feldraster heraus und verwenden Sie sie für zusätzliche Screenings oder spezifische Fragen wieder.

Hier werden die charakteristischen TEM-Merkmale des Neuroblastoms dargestellt. Hier werden wir die charakteristischen TEM-Merkmale des Neuroblastoms veranschaulichen.

Das Neuroblastom ist eine der häufigsten soliden bösartigen Erkrankungen im Säuglings- und Kindesalter. Neuroblastomzellen sind die bösartigen Zellen dieses soliden Tumors, die heimtückisch aus Derivaten der primordialen Neuralleiste entstehen. Diese Histogenese erklärt einige biochemische und morphologische Eigenschaften dieses blauen Tumors. Die deterministischen zyto- und histopathologischen Merkmale von Neuroblastomen können jedoch je nach variablem Differenzierungsgrad spezifisch schwanken. Daher kann die Diagnose und Differentialdiagnose schwierig sein. Die Unterscheidung des Neuroblastoms zu ganglienzellähnlichen Elementen zeigt sich in einer zunehmenden Menge an zellulärem Zytoplasma mit der Entwicklung eines zytoplasmatischen Prozesses und einer Veränderung des Kernbildes (Abbildung 1A-D). Eine Kernvergrößerung und ein sichtbarer Nukleolus sind charakteristisch für die Neuroblastomdifferenzierung. Eine Differenzierung zu Schwann-Zell-ähnlichen Elementen kann ebenfalls festgestellt werden. Die elektronenmikroskopische Untersuchung zeigt neurosekretorische Granula (mittlerer Durchmesser 100 nm), die ständig mit oder ohne neuritenähnliche zytoplasmatische Projektionen vorhanden sind, die Mikrotubuli und dünne Zwischenfilamente enthalten²⁶. Der Mangel an Glykogen kennzeichnet das Neuroblastom, und wenn es selten zu sehen ist, bildet es nie Aggregate. Der Grad der Differenzierung unterscheidet die Ultrastruktur des Neuroblastoms. Charakteristisch für dieses Neoplasma sind neurosekretorische oder Katecholamin-Granulate mit einem Durchmesser von etwa 150 nm. Die neurosekretorischen Granula müssen von desmosomartigen Strukturen unterschieden werden. Neurosekretorische Granula sind in der Nähe von intrazytoplasmatischen Filamenten (Neurofilamenten) zu sehen. Die Zellfortsätze sind oft prall und zylindrisch und werden allgemein als Neuriten (Axone und Dendriten) bezeichnet. Einige Zellprozesse enthalten Mitochondrien, die für die Bewegung der neoplastischen Zelle entscheidend sind. Neuriten enthalten Mikrotubuli, können aber auch geschwollene Mitochondrien haben. Bei einem schlecht differenzierten Neuroblastom sind einige Merkmale häufiger zu finden. Dazu gehören eine signifikantere Unregelmäßigkeit der Kernmorphologie, zahlreiche Mitosen und apoptotische Figuren, ein Mangel an Mikrotubuli und Zellfortsätzen, im Gegensatz zu dem fast konstanten Vorhandensein von Neurofilamenten, ein Mangel an Neuriten, die häufiger Mitochondrien als Mikrotubuli enthalten, keine oder nur sehr wenige synaptische Verbindungen, kein Glykogen, Bereiche mit zahlreichen Polyribosomen und ein Mangel an neurosekretorischen Granulaten. Neurosekretorische Granula sind entscheidend für die Unterscheidung des Neuroblastoms von anderen PSRBCT, einschließlich des embryonalen Rhabdomyosarkoms, des eosinophilen Granuloms, des kleinzelligen Osteosarkoms und des Retikulumzellsarkoms, die aufgrund des Vorhandenseins der zytoplasmatischen Granularität diagnostische Herausforderungen verursachen können.

Abbildung 1: TEM des Neuroblastoms. (A-C) Neuroblastomzellen eines schlecht differenzierten Typs mit einem hohen Zellkern-Zytoplasma-Verhältnis und wenigen Organellen. Das Chromatin ist im Zellkern verstreut, aber auch an der Peripherie in der Nähe der Kernmembran konzentriert. In einem Zellkern in der oberen rechten Ecke ist ein Nukleolus sichtbar (Maßstabsbalken: 2 μm). (D) Neuroblastomzellen mit neurosekretorischen Granula, die eine charakteristische Doppelmembran aufweisen (Maßstab: 200 nm). Rote Pfeile zeigen auf die Nukleolen, blaue Pfeile zeigen Heterochromatin, orangefarbene Pfeile zeigen Euchromatin, grüne Pfeile fokussieren auf Mitochondrien und gelbe Pfeile zeigen auf Vesikel, die den normalen präsynaptischen Enden ähneln. Allerdings sind die Vesikel beim Neuroblastom größer und unregelmäßiger als die klassischen präsynaptischen Terminals. Schließlich zeigen die schwarzen Pfeile zahlreiche neurosekretorische Granula mit dichtem Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In dieser Übersichtsarbeit mit zugehörigem Protokoll haben wir die charakteristischen ultrastrukturellen Merkmale des Neuroblastoms hervorgehoben. Letztendlich schlagen wir vor, dass die Elektronenmikroskopie alles andere als eine "tote" oder uralte Technik ist, und postulieren die Entdeckung einer neuen Rolle, wenn sie mit Einzelzell-Omics-Technologien kombiniert wird. In diesem Beitrag möchte die nie wieder alte Rolle der Elektronenmikroskopie in der Kinderpathologie hervorgehoben^{werden 4,27}. Die kritischen Schritte, die Änderungen und die Fehlerbehebung der Technik sowie die Einschränkungen werden im Folgenden beschrieben.

Es gibt einige wichtige Schritte zu diesem Protokoll. Zunächst ist es wichtig, den gewünschten Bereich für die Elektronenmikroskopie zu schneiden. Die Kante des Diamanten muss so angepasst werden, dass sie so nah wie möglich an der Oberfläche des Blocks liegt. Dies erfordert eine sehr ruhige Hand. Beim Aufnehmen der schwimmenden Sektion mit den Kupfergittern ist Vorsicht geboten.

Modifikationen und Fehlerbehebungen der Technik beinhalten einige Aspekte, die berücksichtigt werden müssen. Jede Probe ist anders und hat Qualitäten wie Dichte und Beschaffenheit, die variabel sind. Aufgrund der Beschaffenheit und Dichte des Materials werden nicht alle Gewebeproben auf die gleiche Weise geschnitten. So können einige Neuroblastom-Proben undifferenziert oder schlecht differenziert sein, während andere einen hohen Grad an Differenzierung und einen unterschiedlichen Grad an Verkalkungen aufweisen können. Gelegentlich müssen mehrere Abschnitte geschnitten werden, um ein paar gute Abschnitte für die Weiterverarbeitung zu erhalten. Es ist wichtig, jede Art von Vibrationen zu vermeiden: Atmung, Tisch, Kompressoren aus den EM-Endoskopen. Wenn an den Abschnitten Brüche auftreten, kann es wichtig sein, die UCM-Schrauben festzuziehen. Wenn Kratzer an den Abschnitten zu sehen sind, wechseln Sie das Diamantmesser, das zum Schneiden verwendet werden soll. Manchmal sind Schnittartefakte erst im letzten Schritt zu sehen. Werden Schnittartefakte unter dem Elektronenmikroskop entdeckt, müssen ultradünne Schnitte nachgeschnitten werden, nachdem die Ursache des Artefakts identifiziert wurde.

Die TEM hat offensichtliche Grenzen, und das Beobachtungsfenster ist sogar kleiner als die mit herkömmlicher Lichtmikroskopie aufgenommene Sicht. Die gewünschte Fläche für die Elektronenmikroskopie darf nicht größer als 1 mm im Quadrat sein. Manchmal würde eine größere Fläche dem Screening zugute kommen, aber es ist unmöglich, sie zu schneiden. Es passt nicht auf das Kupfergitter, es beschädigt das Diamantmesser und die Qualität des Abschnitts ist definitiv minderwertig. Es müssen einige Entscheidungen getroffen werden, und es muss die wichtigste Struktur oder der zum Zeitpunkt des Screenings wichtigste Bereich ausgewählt werden. Die Schnittgeschwindigkeit kann nicht erhöht werden; Dies führt zu Schnittartefakten an den Abschnitten. Die Geschwindigkeit von 1 mm/s bleibt kritisch.

Zusätzlich zu den oben aufgeführten klassischen Merkmalen (z. B. neurosekretorische Granulate) weist die Ultrastruktur der Mitochondrien in Neuroblastomzellen, die mit TEM untersucht werden, oft ein bemerkenswertes Maß an Mitophagie auf, einem selektiven zellulären Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle, der den Abbau von Mitochondrien ermöglicht, die von den Zellen als geschädigt und/oder überflüssig angesehen werden^28,29. Infolgedessen beherbergen die Mitochondrien Schwellungen, Risse der Cristae-Rupturen und das Verschwinden der Cristae. In der Tat fanden Radogna et al. eine effiziente Mitophagie als den kritischen Mechanismus, der zum Versagen der Aktivierung des Signalwegs des programmatischen Zelltods führte, der die Resistenz von SK-N-AS erhöhte, einer Neuroblastom-Zelllinie mit erhöhter Synthese von Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor II (IFG-II) und IGF-II-RNA und Typ-I-IGF-Rezeptoren zu UNBS1450, einem halbsynthetischen Cardenolid, das zur Familie der kardialen Steroidglykosid gehört. Auslösen von Nekroptose bei etwas höheren Dosen³⁰.

Besonders relevant für die Differentialdiagnose ist die Rolle der TEM beim Ewing-Sarkom. Das Ewing-Sarkom wird als gleichwertig mit peripheren neuroektodermalen Zelltumoren angesehen, obwohl in der Vergangenheit einige Debatten geführt wurden 31,32,33. In der Praxis sind bei den primitiven Zellen des Ewing-Sarkoms reichlich vorhandenes zytoplasmatisches Glykogen, schlecht entwickelte Zellverbindungen und keine neuronalen Merkmale die Hauptmerkmale. In der Elektronenmikroskopie besteht eine frappierende Ähnlichkeit zwischen dem peripheren neuroektodermalen Tumor und dem Ewing-Sarkom. Tatsächlich werden beide Tumoren als dieselbe Entität betrachtet und mit den gleichen therapeutischen Protokollen sowohl in der SIOP (International Society of Pediatric Oncology) und COG (Children's Oncology Group) als auch in der UKCCSG (United Kingdom Children Cancer Study Group) behandelt, da sie die gleiche chromosomale Translokation aufweisen. Im PNET gibt es jedoch einige neuronale Merkmale, darunter neurosekretorische Granula, die beim Ewing-Sarkom praktisch nicht vorhanden sind. Diese Spezifikation spiegelt auch den immunhistochemischen Phänotyp wider. Es gibt eine Positivität für mindestens ein oder zwei neuronale Marker, z. B. neuronenspezifische Enolase, S-100, Synaptophysin oder Neurofilamente. Franchi et al. untersuchten das ES-PNET³¹. In den meisten Fällen wiesen neoplastische Zellen die typische Ultrastruktur auf, einschließlich fest gepackter, schlecht differenzierter Zellen mit ovaler bis polygonaler Form. Diese Zellen enthalten einen runden oder ovalen Kern mit fein dispergiertem Chromatin und ein oder zwei Nukleolen. Im Zytoplasma gibt es winzige Organellen, die die schlechte Differenzierung dieser neoplastischen Zellen widerspiegeln. Die Liebe zum Detail kann jedoch das Vorhandensein von Mitochondrien, einigen rauen endoplasmatischen Retikulumstrukturen (den sogenannten Zisternen), sporadischen Lysosomen und freien Ribosomen offenbaren. Eine Glykogenakkumulation kann leicht nachgewiesen werden. Glykogen kann entweder als dispergiert oder gepoolt angesehen werden. Intermediäre Filamente werden häufig sowohl im Zytoplasma als auch in zytoplasmatischen Prozessen der Tumorzellen beobachtet. Mikrotubuli sind nicht zu sehen. Rudimentäre Verbindungen können in etwa der Hälfte der Fälle über die Zellverbindungen nachgewiesen werden. Diese Strukturen bestehen aus gut entwickelten Desmosomen mit Tonofilamenten, wenn die Verbindungsstellen identifiziert werden. Eine gewisse Anhäufung von Basalmembran-ähnlichem Material und Kollagenfibrillen in der extrazellulären Matrix ist zu erkennen. Es können dichte Kernkörnchen mit einem ähnlichen Durchmesser wie beim Neuroblastom beobachtet werden. Wie die immunhistochemischen Untersuchungen der Vorautoren³¹ treten gut differenzierte Neoplasien tendenziell außerhalb des Skeletts auf, während schlecht differenzierte Tumoren häufiger im Knochen als im Weichgewebe auftreten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass TEM eine herausragende Technologie ist, die in der Zukunft ein enormes Potenzial haben kann und in der Medizin noch lange nicht tot ist. Die Einführung molekularbiologischer Techniken mit den jüngsten Fortschritten bei der Sequenzierung der nächsten Generation unterstreicht die Inkonsistenz eines Kontinuums in der Diagnostik, aber einer Känguru-ähnlichen Welle des Fortschritts. Die Einführung neuer Methoden sollte Pathologen nicht davon abhalten, die Elektronenmikroskopie konsequent einzusetzen, da sowohl die Immunhistochemie als auch die molekularen Techniken trügerisch sein können. Einige immunhistochemische Muster und genetische Anomalien sind nicht tumorspezifisch und können schlecht mit der Histologie korrelieren. Nach unserem Kenntnisstand ist TEM nach wie vor eine robuste, valide und reproduzierbare Methode in der Pathologie und Medizin. TEM ist ein zusätzliches Werkzeug zur Untersuchung kleiner runder blauzelliger Tumoren und ein solider Beweis für das immunhistochemische Ergebnis. Die konsequente Anwendung von TEM in einer modernen Einrichtung kann zu einem hohen interindividuellen Übereinstimmungswert, einer hohen Validität und einer effizienten Zuverlässigkeit führen. In naher Zukunft könnten Molekularbiologen nach kompetenten und validen Laboratorien für Elektronenmikroskopie suchen, die spezifische Fragen auf ultrastruktureller Ebene beantworten können. Insbesondere sehen wir eine neue Perspektive und Anwendung von TEM in der Molekularbiologie, wie z.B. die Kopplung von TEM mit Experimenten, die darauf abzielen, einige aktuelle Einzelzellforschungen zu verstehen.

Der Erstautor erhält Tantiemen von folgenden Verlagen: Springer (https://link-springer-com.bdigitaluss.remotexs.co/book/10.1007/978-3-662-59169-7; ISBN: 978-3-662-59169-7) und Nova (https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/; ISBN: 978-1-53619-816-4). Alle Tantiemen gehen an pädiatrische Wohltätigkeitsorganisationen.

Wir danken Dr. Richard Vriend, ehemals Mitarbeiter der Alberta Health Services am University of Alberta Hospital, und Steven Joy (1972-2019), ebenfalls ehemaliger Mitarbeiter der Alberta Health Services am University of Alberta Hospital, für ihre Expertise und großzügige Unterstützung. Wir widmen diese Arbeit dem Andenken an Mr. Joy, einen leitenden Technologen und Experten für ultrastrukturelle Untersuchungen, der vor einigen Jahren tragisch und vorzeitig verstorben ist. Herr Joy war eine Säule für die meisten elektronenmikroskopischen Studien in Alberta, Kanada. Unsere Gedanken und Gebete sind für ihn und seine Familie. Wir sind auch Frau Lesley Burnet für ihre Hilfe und ihren Rat zu Dank verpflichtet. Die Forschung von Dr. C. Sergi wurde durch die Großzügigkeit des Children's Hospital of Eastern Ontario, Ottawa, Ontario, und der Stollery Children's Hospital Foundation sowie der Unterstützer des Lois Hole Hospital for Women durch das Women and Children's Health Research Institute (WCHRI, Grant ID #: 2096), der Natural Science Foundation der Provinz Hubei für die Hubei University of Technology (100-Talent-Stipendium für das Rekrutierungsprogramm ausländischer Experten) finanziert. Gesamtfinanzierung: Digitale PCR und NGS-basierte Diagnostik für Infektion und Onkologie, 2017-2022), Österreichische Krebshilfe Tirol (Krebsgesellschaft Tirol, 2007 und 2009 - "DMBTI und cholangiozelluläre Karzinome" und "Hsp70 und HSPBP1 bei Karzinomen der Bauchspeicheldrüse"), Österreichischer Forschungsfonds (FWF, Grant ID L313-B13), Kanadische Stiftung für Frauengesundheit ("Early Fetal Heart-RES0000928"), Cancer Research Society (Genexpression des von-Willebrand-Faktors in Krebszellen), Canadian Institutes of Health Research (Omega-3-Fettsäuren zur Behandlung von Darmversagens-assoziierten Lebererkrankungen: Eine translationale Forschungsstudie, 2011-2014, CIHR 232514) und das Saudi Cultural Bureau, Ottawa, Kanada. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.