الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال: أداة جراحية لعلم الأمراض للورم الأرومي العصبي

أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة لدى الأطفال هي مجموعة مثيرة للاهتمام وصعبة من الأورام. لذلك ، يمكن أن يكون المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) والمعرفة المهنية بأورام الأطفال ذات قيمة كبيرة في علم الأمراض الجراحية. نقدم هنا بروتوكولا لإجراء TEM لتشخيص الورم الأرومي العصبي ، وهو أحد أكثر الأورام الصلبة شيوعا في مرحلة الطفولة.

أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة للأطفال (PSRBCT) هي مجموعة مثيرة للاهتمام وصعبة من الأورام. يحدد الفحص المجهري الضوئي لأورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة الخلايا المستديرة الصغيرة. لديهم نواة مفرطة اللون بشكل عام وسيتوبلازم قاعدي ضئيل نسبيا. تشمل أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة لدى الأطفال عدة كيانات. عادة ، يشملون ورم ويلمز ، والورم الأرومي العصبي ، والساركوما العضلية المخططة ، وساركوما إوينغ ، والورم الأرومي الشبكي ، وسرطان الغدد الليمفاوية ، والساركوما العظمية ذات الخلايا الصغيرة ، من بين أمور أخرى. حتى باستخدام الكيمياء المناعية ، قد يكون التشخيص التفريقي لهذه الأورام مثيرا للجدل في الفحص المجهري الضوئي. يمكن أن يؤدي تلطيخ خافت أو خلفية غامضة إلى ردع علماء الأمراض عن اتخاذ القرار التشخيصي المناسب. بالإضافة إلى ذلك ، قد توفر البيولوجيا الجزيئية كمية هائلة من البيانات التي تصعب تمييزها ، ويمكن رؤية بعض عمليات النقل في أكثر من فئة واحدة. وبالتالي ، يمكن أن يكون المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM) ذا قيمة كبيرة. نؤكد هنا على البروتوكول الحديث لبيانات TEM للورم الأرومي العصبي. يمكن للخلايا السرطانية ذات تشابك العمليات السيتوبلازمية التي تحتوي على حبيبات إفراز عصبي تشخيص الورم الأرومي العصبي.

قد يكون عمل أخصائي علم الأمراض صعبا للغاية في كل من التشخيص السريري ومجالات البحث. كان تطور الفحص المجهري الضوئي^{في القرنين} الثامن^عشر والتاسع عشر رائعا. تعتمد قوة المجهر الإلكتروني بشكل أساسي على الطول الموجي للإلكترونات ، وهو أقصر من الضوء^1،2،3. قبل ظهور الأجسام المضادة متعددة النسيلة وحيدة النسيلة وتطبيقها في الكيمياء المناعية ، لعب TEM دورا مؤثرا في تشخيص أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة.

بدءا من التسعينيات من القرن الماضي ، حل النهج الكيميائي المناعي محل الأداة المورفولوجية في التشخيص⁴. حاليا ، هناك الآلاف من الأجسام المضادة متعددة النسيلة وحيدة النسيلة الجديدة الموجهة إلى مستضدات مجموعة ورم الخلايا الزرقاء المستديرة^{الصغيرة 4،6،7،8}. في العقد الأخير^{من القرن العشرين} غزير الإنتاج والعقد الأول من^{بداية القرن} الحادي والعشرين ، يبدو أن البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك التهجين الفلوري في الموقع ، من المجسات الجينومية إلى تسلسل الجيل التالي ، قد حلت محل الدور التطبيقي المهم للكيمياء المناعية في العديد من المختبرات⁴. لا توافق إدارة الغذاء والدواء (FDA) في الولايات المتحدة الأمريكية ، أو الوكالة الكندية لفحص الأغذية (CFIA) ، أو وكالة حماية البيئة (EPA) ، أو الهيئات الحكومية المماثلة في البلدان الأخرى دائما على بروتوكولات البيولوجيا^{الجزيئية 9}. يبدو أن هناك الكثير من المعلومات التي يصعب إدراجها في تقرير علم الأمراض الذي يمكن استخدامه للأغراض العلاجية ، كما أن الاختيار الرائع لنظام معلومات مختبري ممول جيدا وتشغيله أمر بالغ الأهمية¹⁰. في غضون ذلك ، كشفت الكيمياء النسيجية المناعية عن العديد من المزالق ، حيث تظهر الأورام الظهارية علامات اللحمة المتوسطة والعكس صحيح¹¹. لقد أربك الانتقال الظهاري الوسيط بعض الحدود في مجموعات علم الأمراض^12،13. في السنوات القليلة الماضية ، أصبح من الواضح أن المجهر الإلكتروني ازدهر في العديد من المختبرات في جميع أنحاء^{العالم 14}. على وجه الخصوص ، انخفض وقت استجابة عينات الأنسجة من أسابيع إلى 3 أيام فقط أو حتى أقل باستخدام العديد من البروتوكولات التي تقترب من التلوين بالأجسام المضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة^4،10.

علاوة على ذلك ، ساعد تطبيق كاميرا إلكترونية مقترنة بالمجهر الإلكتروني في تزويد علماء الأمراض بصورة سريعة ، وهي متعددة الاستخدامات في أنظمة التشغيل المختلفة. أخيرا ، يصعب الكشف عن بعض الأجسام المضادة ، حتى بعد استرجاع المستضد ، في بعض مناطق النخر أو التغيرات المرتبطة بالالتهام الذاتي / نقص التروية. في الوقت نفسه ، لا يزال بإمكان الفحص المجهري الإلكتروني في أيد أمينة تقديم نتائج وتلميحات ممتازة للتصنيف الصحيح للأورام المرضية غير المعروفة¹⁵.

تشمل مجموعة أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة للأطفال العديد من الأورام ، وخاصة الورم الأرومي العصبي ، ورم ويلمز أو الورم الأرومي الكلوي ، والساركوما العضلية المخططة ، وساركوما يوينغ. يمكن أن تكون بيانات البيولوجيا الجزيئية المتعلقة بمجموعة الأطفال من أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة ساحقة بسبب التقنيات المطبقة. قد لا تختلف الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة كثيرا في البقع الروتينية (تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين) ، وقد يكون لبعض الأورام سمات مناعية ظاهرية شاذة. كانت التطورات في البيولوجيا الجزيئية هائلة منذ اكتشاف TEM. في مجموعة أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة ، قد تتم مواجهة بعض الأورام بشكل متكرر أكثر من غيرها ، ولكن يجب أخذها في الاعتبار. على الرغم من أن سرطان الخلايا الكلوية الحليمي ليس في الأساس ورما صغيرا للخلايا الزرقاء المستديرة ولكنه يتميز بالحليمات في الغالب ، إلا أنه قد يظهر بعض مناطق الخلايا المستديرة التي قد تحتاج إلى أن تكون متميزة عن أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة المعروفة (على سبيل المثال ، ورم ويلمز) باستخدام العديد من التقنيات الإضافية¹⁶. في النهاية ، قد تحتاج الأورام اللحمية metanepleric أيضا إلى أن تؤخذ في التشخيص التفريقي¹⁷. الورم الربيدي هو ورم خبيث بشكل خاص في الأطفال يتميز بالنوع الفرعي الكلوي وخارج^{الكلى 18}.

الورم الأرومي العصبي هو أحد أكثر الأورام الخبيثة الصلبة شيوعا في مرحلة الطفولة والطفولة. خلايا الورم الأرومي العصبي هي الخلايا الخبيثة لهذا الورم الصلب التي تنشأ بشكل خبيث من مشتقات القمة العصبية البداية. قد يكون تشخيصه وتشخيصه التفريقي صعبا. شهدت بيولوجيتها الطبيعية تقدما ملحوظا في العقدين الماضيين. تتميز عائلة عوامل النسخ الشوكية بمجال "شوكة" مميز (FOXO3 / FKHRL1). تعمل عوامل النسخ هذه كمحفز لموت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) من خلال التعبير عن الجينات اللازمة لموت الخلايا. يتم تنشيط FOXO3 / FKHRL1 بواسطة 5-aza-2-deoxycytidine ويحفز كاسباز 8 الصامتة ، ويلعب هذا المركب دورا مهما في الورم الأرومي العصبي. يتنبأ FOXO3 النووي بالنتائج السريرية السلبية ويعزز تكوين الأوعية الدموية للورم في الورم الأرومي العصبي^7،19. على الرغم من التقدم في علم الأمراض الجزيئي ، يظل تصنيف شيمادا هو معيار الممارسة لأي أخصائي علم الأمراض وطبيب أورام الأطفال. إنه أمر بالغ الأهمية في التمييز بين علم الأنسجة المواتي وغير المواتي^{20،21،22،23}.

يرتبط الأساس المنطقي لتطوير بروتوكول مباشر للفحص المجهري الإلكتروني للأورام المشبوهة في إصابتها بالورم الأرومي العصبي بجدوى وصلابة الفحص فوق البني لعينة الأنسجة. نادرا ما يتم تغييره بسبب المشاكل التي تتم مواجهتها عادة باستخدام الكيمياء المناعية. كان الأساس المنطقي والبروتوكول أساس العديد من الكتب المدرسية والمساهمات العلمية في علم أمراض الأطفال والفحص المجهري الإلكتروني^4،24،25. يمتد هذا البروتوكول إلى تجربة ثلاثة عقود من المؤلف وسيركز على عدد قليل من PSRBCT ، مع التركيز على التجربة الشخصية ومراجعة الأدبيات.

كانت جميع الإجراءات التي أجريت في الدراسات التي شملت مشاركين بشريين متوافقة مع المعايير الأخلاقية للجنة البحوث المؤسسية و / أو الوطنية ومع إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة أو المعايير الأخلاقية المماثلة. تعد دراسة المجهر الإلكتروني جزءا من الروتين العادي للفحص المجهري للعينات المستلمة لأغراض التشخيص ولا تتطلب موافقة لجنة أخلاقيات علم الأحياء. هذه الدراسة بأثر رجعي وتحترم عدم الكشف عن هويتها تماما للعينات.

1. بروتوكول TEM لاستخراج FFPE (الثابتة بالفورمالين والبارافين) وعينات الأنسجة الثابتة بالجلوتارالديهايد

1. استرجع آخر شرائح ملطخة بالهيماتوكسيلين والأيوزين وكتلة أنسجة FFPE.
2. باستخدام علامة دائمة ، حدد منطقة الاهتمام على شريحة الأنسجة وقم بمطابقتها مع المنطقة الموجودة على كتلة الأنسجة.
3. قم بقص المنطقة المحددة بشفرة حلاقة جديدة من الكتلة وقم بتقطيعها بدقة إلى مكعبات 5 مم على ورق الترشيح.
4. ضع ورق الترشيح مع المنديل المستخرج في طبق بتري مكتوب عليه. ضع طبق بتري في فرن 60-70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، أي حتى يذوب البارافين (يتكون شمع البارافين من خليط من الهيدروكربونات الصلبة ذات السلسلة المستقيمة التي تتراوح في درجة انصهار 48 درجة مئوية -66 درجة مئوية (120 إلى 150 درجة فهرنهايت)) ويتم امتصاصها بواسطة ورق الترشيح.
5. انقل الأنسجة المستردة الخالية من البارافين إلى قارورة تلألؤ مملوءة ب 4 مل من 100٪ تولوين (ميثيل بنزين) v / v [100٪ تولوين يعني 100 مل من التولوين]. تأكد من أن العينات تدور باستمرار خلال عملية إزالة التفارافين (سرعة الدوران: 24 دورة / دقيقة).
6. قم بإجراء تغييرين من التولوين ، 1 ساعة لكل منهما ، وتغيير واحد بمقدار 4 مل من 100٪ تولوين 30 دقيقة لكل منهما ، باستخدام جهاز دوار بزاوية.
7. تابع تغييرا واحدا في 4 مل من الإيثانول المطلق بنسبة 100٪ (C₂H₅OH) لمدة ساعة واحدة ، ثم تغييرين بمقدار 4 مل من الإيثانول المطلق بنسبة 100٪ لمدة 30 دقيقة لكل منهما. ثم ، تغيير آخر لمدة 30 دقيقة في 4 مل من 70٪ من الإيثانول.
8. استمر في تغيير واحد بمقدار 4 مل من 0.1 M cacodylate الصوديوم ، 30 دقيقة. انقل العينات في 4 مل من 2.5٪ جلوتارالديهايد واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية حتى المعالجة.
9. استخدم الخطوات التالية في معالج الأنسجة الآلي لتوحيد المعالجة: 0.1 M عازلة كاكوديلات الصوديوم لمدة 5 دقائق ، 2٪ رابع أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة و 50 دقيقة ، dH₂O لمدة 5 دقائق ، 50٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة ، 70٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة ، 100٪ إيثانول لمدة 15 دقيقة (ثلاث مرات) ، 100٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة (ثلاث مرات) ، 100٪ إيثانول لمدة 45 دقيقة ، أسيتون لمدة 50 دقيقة ، راتنج لمدة ساعة واحدة (مرتين) ، وراتنج طازج بين عشية وضحاها. حجم جميع المحاليل 15 مل.
10. قم بتضمينه مع الراتنج الطازج مباشرة من معالج المناديل.
    1. ضع كبسولات البولي إيثيلين في حامل به شرائط ورقية مرقمة. قم بإسقاط الراتنج الطازج في الكبسولات ، وانقل العينة إلى الكتل المناسبة واحتفظ بالكتل طوال الليل في فرن 60 درجة مئوية (140 درجة فهرنهايت).
11. قم بتلطيخ الأقسام شبه الرقيقة (500 نانومتر) مع 1٪ من التولودين الأزرق على الصفيحة الساخنة ، وإعداد الحد الأدنى للحرارة لمدة 30 ثانية ، واشطفها في dH₂O ، ثم ضع غطاء غطاء.
12. هنا ، يتم استخدام ميكروتوم Ultracut (UCM) لتقسيم الأقسام شبه الرقيقة.
    1. خذ كتلة مدمجة من الراتنج وقم بتثبيتها في حامل الكتلة في UCM. ثم قم بتثبيت حامل الكتلة على مسرح UCM وقم بإحكام ربطه.
    2. قم بقص الراتنج الزائد حول العينة باستخدام شفرة حلاقة مطلية بحافة واحدة باستخدام العينات. قطع وجه الكتلة في شكل شبه منحرف.
    3. قم بإزالة حامل الكتلة من المسرح وتثبيته في ذراع UCM بإحكام. بعد ذلك ، قم بتثبيت حامل الشفرة على مرحلة UCM. أخيرا ، شد سكين زجاجي على حامل الشفرة.
    4. باستخدام العينين والضوء الذي يوفره UCM ، حرك حافة السكين الزجاجي ببطء ، في أقرب وقت ممكن ، إلى سطح كتلة الراتنج للقطع. شد حامل الشفرة في مكانه على المسرح.
    5. اضبط سمك القطع في UCM على 500 نانومتر وقم بقص كتلة الراتنج حتى 75٪ كاملة الوجه.
    6. قم بتغيير السكين الزجاجي إلى سكين جديد. أضف الماء المعقم إلى خزان السكين الزجاجي.
    7. قم بتسمية شريحة مجهر برقم العلبة وضع أربع قطرات منفصلة من الماء المعقم على الشريحة الزجاجية.
    8. لا يزال عند إعداد 500 نانومتر ، قم بقص أربعة أقسام من الكتلة. باستخدام ملقط ناعم ، انقل قسما واحدا في كل مرة في إحدى قطرات الماء على الشريحة الزجاجية. ستحتوي كل قطرة على الشريحة على قسم واحد. جفف الشريحة على طبق ساخن بأقل درجة حرارة حتى تجف (30 ثانية).
13. وصمة عار بطريقة تولويدين الزرقاء. اشطفها بالماء وضع غطاء. افحص أقسام تولويدين الزرقاء تحت المجهر الضوئي. إذا كانت هياكل الأنسجة المرغوبة مرئية ، فقم بقص أقسام رقيقة للغاية. إذا كانت هياكل الأنسجة المرغوبة غير مرئية ، فقم بقص أقسام أعمق ولطخها باستخدام نفس الخطوات حتى يتم الكشف عن الهياكل المرغوبة وعرضها على شريحة تولويدين الزرقاء.
14. عندما يتم تحديد المنطقة المطلوبة للفحص المجهري الإلكتروني من أقسام تولويدين الزرقاء ، قم بقص الأقسام الرقيقة للغاية على الشبكات النحاسية. قم بقص شرائح رفيعة جدا باستخدام ميكروتوم فائق الصغر (يجب تقطيع العينات المخصصة للعرض في TEM إلى شرائح رفيعة جدا (80 نانومتر)).
    1. خذ كتلة مدمجة من الراتنج وقم بتثبيتها في حامل الكتلة في UCM. ثم قم بتثبيت حامل الكتلة على مسرح UCM وقم بإحكام ربطه.
    2. باستخدام العينين ، قم بقص الراتنج حول المنطقة المرغوبة للفحص المجهري الإلكتروني باستخدام شفرة حلاقة مطلية أحادية الحافة. قطع وجه الكتلة على شكل أرجوحة ، لا يزيد حجمها عن 1 مم مربع. إذا كان من الصعب رؤية المنطقة المطلوبة للفحص المجهري الإلكتروني بسبب وهج الضوء ، فاستخدم لمسة من الكلوروفورم لتسليط الضوء على الهياكل الموجودة في كتلة الراتنج.
    3. قم بإزالة حامل الكتلة من المسرح وتثبيته في ذراع UCM بإحكام. بعد ذلك ، قم بتثبيت حامل الشفرة على مرحلة UCM. أخيرا ، شد سكين الماس على حامل الشفرة.
    4. باستخدام العينات والضوء الذي توفره UCM ، حرك حافة السكين الماسي ببطء ، في أقرب وقت ممكن ، إلى سطح كتلة الراتنج لقطعها. شد حامل الشفرة في مكانه على المسرح.
    5. اضبط الزوايا المختلفة للسكين الماسي باستخدام مسامير UCM. تأكد من محاذاة حافة السكين الماسي بشكل مثالي قدر الإمكان مع سطح الكتلة المراد قطعها. املأ خزان السكين الماسي بالماء المعقم.
    6. اضبط UCM على سمك 80 نانومتر وسرعة 1 مم / ثانية. هنا ، يتم استخدام الوظيفة التلقائية للتقسيم الرقيق للغاية. اضبط نافذة القطع على UCM (أعلى وأسفل وجه الكتلة).
    7. اضغط على زر البدء في UCM لبدء التقسيم. سوف تطفو الأقسام على الخزان المعقم لسكين الماس.
    8. عندما يتم قطع أقسام كافية ، استخدم أبخرة الكلوروفورم لتقويم الأقسام. اغمس قطعة قطن في الكلوروفورم ومررها فوق الأقسام دون لمسها.
15. اغمس شبكة نحاسية في كحول 100٪ ثم قم بتعقيم الماء باستخدام ملقط ناعم. نظف كل شبكة قبل استخدامها. اختر الأقسام الموجودة على عدد قليل من الشبكات.
16. اترك الشبكات التي تحتوي على أقسام على ورق ترشيح مسمى. ضع ورق الترشيح هذا في طبق بتري وضعه في فرن 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح للأقسام بالجفاف على الشبكات.
17. ثم قم بإجراء تلطيخ التباين.
    1. تلطخ الشبكات في أسيتات اليورانيل أو أي بديل صديق للبيئة لمدة 1 دقيقة. ثم اشطفها بماء معقم للحقن (40 غمس في أربع حاويات مياه مختلفة لكل شطف بعد أسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص). خطوة سترات الرصاص هي أيضا 1 دقيقة.
18. أدخل الشبكة في TEM ، مما يسمح بانبعاث شعاع إلكتروني عالي الجهد بواسطة كاثود وإنشائه بواسطة العدسات المغناطيسية. يشكل الشعاع الذي تم نقله جزئيا عبر العينة الرقيقة (شبه الشفافة الإلكترونية) معلومات TEM على الشاشة (انظر أدناه).

2. بروتوكول TEM لمسح العينات وتصويرها

1. بعد تلطيخ الأقسام الموجودة على الشبكات ، قم بفحصها بالمجهر الإلكتروني. في المجهر الإلكتروني ، قم بتشغيل جهد ACC إلى إعداد محدد مسبقا (200-300 كيلو فولت) ، والذي يعتمد على المجهر الإلكتروني المستخدم.
2. في الكمبيوتر ، قم بتشغيل برنامج الكاميرا الرقمية وأدخل رقم الحالة. هذا مهم لأنه يتم حفظ الصور المصغرة في ملف الحالة المقابل.
3. قم بتحميل الشبكة في المجهر الإلكتروني ، واسحب عينة البندقية في منتصف الطريق للخارج واقلب المفتاح إلى AIR للسماح للفراغ من غرفة بندقية العينة بملء الهواء المحيط (الغرفة).
4. بمجرد أن تمتلئ بالهواء ، اسحب عينة البندقية. ضع عينة البندقية على الحامل المصمم. ثم افتح حامل الشبكة عند طرف البندقية.
5. ضع الشبكة في مكانها. أغلق حامل الشبكة وتأكد من تأمين الشبكة.
6. ضع عينة البندقية مرة أخرى في غرفة العينة في منتصف الطريق واقلب المفتاح إلى EVAC لإنشاء فراغ في غرفة العينة.
7. سيتم تشغيل مؤشر الضوء الأخضر عند تحقيق الفراغ في غرفة العينة. بعد ذلك ، ادفع عينة البندقية بعناية في عمود المجهر الإلكتروني وتأكد من عدم السماح لها بالسير بسرعة كبيرة. خلاف ذلك ، سيؤدي ذلك إلى إتلاف الجسم الموجود في طرف عينة البندقية.
8. بمجرد أن تصبح الشبكة في مكانها الصحيح في عمود المجهر الإلكتروني ، قم بتشغيل الفتيل إلى إعداد التشبع الوسيط (المحدد مسبقا).
9. قم بتشغيل الكاميرا من خلال مفتاح التشغيل / الإيقاف . على الكمبيوتر ، انقر فوق Live Image في برنامج التصوير.
10. على المجهر الإلكتروني ، اضغط على زر التكبير المنخفض وافتح فتحة المجردة الموضوعية. هذا يسمح باختيار منطقة الفحص المطلوبة. بعد ذلك ، ضع المنطقة المطلوبة من القسم في منتصف شاشة الكمبيوتر ، باستخدام وحدتي التحكم على جانبي عمود المجهر الإلكتروني.
11. على المجهر الإلكتروني ، اضغط على زر التكبير وأغلق الفتحة الموضوعية للحصول على تباين أفضل.
12. ابدأ عرض القسم بالتقاط صور مصغرة بتكبير 2,500 مرة. بعد ذلك ، اضبط التركيز باستخدام زر المتذبذب وزر السطوع على المجهر الإلكتروني لضمان جودة الصورة المصغرة.
13. انقر فوق الصورة النهائية على الكمبيوتر لالتقاط الصورة المصغرة. إذا لم تكن الألوان متساوية ، فقم بإجراء تصحيح للخلفية على برنامج الكاميرا. أيضا ، اضبط التباين على الصورة النهائية باستخدام البرنامج قبل حفظ الصورة المصغرة.
14. عند حفظ الصورة المصغرة، تحقق جيدا من رقم الحالة والتكبير لضمان التحديد الصحيح للصور المصغرة الملتقطة.
    ملاحظة: في بعض الحالات ، يمكن للمستخدم أيضا إدخال تسميات توضيحية إضافية ، كما يتم إدخال الأحرف الأولى من اسم تقني المجهر الإلكتروني.
15. قم بإجراء عملية التصوير: المجهري من خلال كامل مساحة القسم المراد فحصها. بعد تكبير كاف بمقدار 2,500 ضعفا ، يتم حفظ الصور المصغرة لتغطية منطقة الاهتمام ، والتقاط صور ميكروفوغرافية مكبرة 4,000x و 8,000x وحفظها على الكمبيوتر مع تحديد رقم الحالة المناسب.
16. قم بعمل لقطة مقربة على القسم للحصول على تفاصيل محددة للبنية التحتية إذا تم تقديم تعليمات فحص محددة للغاية. بعد ذلك ، احفظ قياسات تفاصيل البنية التحتية المحددة في الكمبيوتر مع مراعاة التكبير الأعلى إذا لزم الأمر.
17. عند اكتمال فحص العينة ، قم بإيقاف تشغيل الفتيل والكاميرا والجهد العالي وبرنامج الكاميرا بالتسلسل. بعد ذلك ، قم بإزالة الشبكة من عمود المجهر الإلكتروني ، مما يسمح بدخول الهواء إلى غرفة عينة البندقية.
18. قم بحفظ الشبكة في كبسولة جيلاتين وقم بتخزين الكبسولة في صندوق مكتوب عليه بشكل صحيح ، جنبا إلى جنب مع كتل الراتنج في نفس الحالة. ضع عينة البندقية مرة أخرى في حجرة البندقية وقم بتخزينها في بيئة باردة وجافة للحفاظ على المواد المستخدمة.
19. انقل الصور المصغرة الرقمية على منصات تعاونية مشتركة (مثل SharePoint) أو خوادم داخلية للسماح لأخصائي علم الأمراض بعرضها.
20. أدخل وحدات العمل في نظام معلومات المختبر (LIS).
21. إذا كانت هناك حاجة إلى صور مصغرة أكثر تحديدا ، فاسحب الشبكة الميدانية وأعد استخدامها لفحص إضافي أو أسئلة محددة.

يتم عرض ميزات TEM المميزة للورم الأرومي العصبي هنا. سنوضح هنا سمات TEM المميزة للورم الأرومي العصبي.

الورم الأرومي العصبي هو أحد أكثر الأورام الخبيثة الصلبة شيوعا في مرحلة الطفولة والطفولة. خلايا الورم الأرومي العصبي هي الخلايا الخبيثة لهذا الورم الصلب التي تنشأ بشكل خبيث من مشتقات القمة العصبية البداية. يفسر هذا التكوين النسيجي بعض الخصائص الكيميائية الحيوية والمورفولوجية لهذا الورم الأزرق. ومع ذلك ، يمكن أن تتقلب السمات الحتمية للأورام الأرومية العصبية الخلوية والنسيجية المرضية على وجه التحديد وفقا لدرجة التمايز المتغيرة. لذلك ، قد يكون تشخيصه وتشخيصه التفريقي صعبا. يظهر التمييز بين الورم الأرومي العصبي والعناصر الشبيهة بالخلايا العقدية من خلال زيادة كمية السيتوبلازم الخلوية مع تطور عملية السيتوبلازمية وتغيير الصورة النووية (الشكل 1A-D). التضخم النووي والنواة المرئية هي سمة من سمات تمايز الورم الأرومي العصبي. يمكن أيضا ملاحظة التمايز إلى العناصر الشبيهة بخلايا شوان. يكشف التحقيق المجهري الإلكتروني عن حبيبات إفرازية عصبية (متوسط قطر 100 نانومتر) موجودة باستمرار مع أو بدون إسقاطات سيتوبلازمية تشبه العصبيات تحتوي على أنابيب دقيقة وخيوط وسيطة^{رفيعة 26}. تميز ندرة الجليكوجين الورم الأرومي العصبي ، وإذا نادرا ما يتم رؤيته ، فإنه لا يبني الركام أبدا. تميز درجة التمايز البنية التحتية للورم الأرومي العصبي. تعتبر حبيبات الإفراز العصبي أو الكاتيكولامين من سمات هذا الورم ، حيث يبلغ قطرها حوالي 150 نانومتر. يجب تمييز حبيبات الإفراز العصبي عن الهياكل الشبيهة بالديموسوم. يمكن رؤية حبيبات الإفراز العصبي بالقرب من الخيوط داخل الهيولى (الخيوط العصبية). غالبا ما تكون عمليات الخلايا ممتلئة وأسطوانية ويشار إليها عادة باسم الخلايا العصبية (المحاور والتشعبات). تحتوي بعض عمليات الخلايا على الميتوكوندريا ، والتي تعتبر ضرورية لحركة الخلية الورمية. تحتوي العصبيات على أنابيب دقيقة ولكن قد يكون لها أيضا تورم الميتوكوندريا. في حالة الإصابة بالورم الأرومي العصبي ضعيف التمايز ، غالبا ما يتم العثور على بعض الميزات. وهي تشمل عدم انتظام أكثر أهمية في التشكل النووي ، والعديد من الميتوزات والأشكال موت الخلايا المبرمج ، وندرة الأنابيب الدقيقة والعمليات الخلوية ، على النقيض من الوجود المستمر تقريبا للخيوط العصبية ، وندرة الأعصاب ، التي تحتوي في كثير من الأحيان على الميتوكوندريا أكثر من الأنابيب الدقيقة ، ولا توجد تقاطعات متشابكة أو عدد قليل جدا منها ، ولا يوجد جليكوجين ، ومناطق من العديد من البولي ريبوسومات ، وندرة الحبيبات الإفرازية العصبية. تعتبر الحبيبات الإفرازية العصبية ضرورية للتمييز بين الورم الأرومي العصبي عن PSRBCT الأخرى ، بما في ذلك الساركوما العضلية المخططة الجنينية ، والورم الحبيبي اليوزيني ، والساركوما العظمية ذات الخلايا الصغيرة ، وساركوما الخلايا الشبكية ، والتي قد تسبب تحديات تشخيصية بسبب وجود حبيبات السيتوبلازمية.

الشكل 1: TEM للورم الأرومي العصبي. (AC) خلايا الورم الأرومي العصبي من النوع ضعيف التمايز مع نسبة عالية من النواة إلى السيتوبلازم وعدد قليل من العضيات. ينتشر الكروماتين في النواة ولكنه يتركز أيضا في المحيط القريب من الغشاء النووي. تظهر النواة في نواة في الزاوية العلوية اليمنى (شريط المقياس: 2 ميكرومتر). (د) خلايا الورم الأرومي العصبي ذات الحبيبات الإفرازية العصبية التي تظهر غشاء مزدوج مميز (شريط المقياس: 200 نانومتر). تشير الأسهم الحمراء إلى النواة ، وتكشف الأسهم الزرقاء عن الكروماتين المتغاير ، وتكتشف الأسهم البرتقالية اليوروكروماتين ، وتركز الأسهم الخضراء على الميتوكوندريا ، وتشير الأسهم الصفراء إلى حويصلات تشبه الأطراف الطبيعية قبل المشبكي. ومع ذلك ، فإن الحويصلات في الورم الأرومي العصبي أكبر وأكثر انتظاما من الأطراف الكلاسيكية قبل المشبكي. أخيرا ، تكشف الأسهم السوداء عن العديد من حبيبات الإفراز العصبي كثيفة النواة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه المراجعة السردية مع البروتوكول المرتبط بها ، سلطنا الضوء على السمات البنية التحتية المميزة للورم الأرومي العصبي. في النهاية ، نقترح أن المجهر الإلكتروني بعيد كل البعد عن كونه تقنية "ميتة" أو قديمة ، بافتراض اكتشاف دور جديد إذا تم دمجه مع تقنيات omics أحادية الخلية. تود هذه المساهمة التأكيد على الدور القديم للفحص المجهري الإلكتروني في علم أمراض الأطفال^4،27. الخطوات الحاسمة والتعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها والقيود مفصلة أدناه.

هناك بعض الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول. أولا ، من الضروري قطع المنطقة المطلوبة للفحص المجهري الإلكتروني. يجب تعديل حافة الماس لمواجهة وجه الكتلة في أقرب وقت ممكن. هذا يتطلب يدا ثابتة للغاية. يجب توخي الحذر أثناء التقاط القسم العائم بالشبكات النحاسية.

تتضمن التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في هذه التقنية بعض الجوانب التي يجب أخذها في الاعتبار. تختلف كل عينة بصفات ، مثل الكثافة والطبيعة ، وهي متغيرة. بالنظر إلى طبيعة المادة وكثافتها ، لا يتم قطع جميع عينات الأنسجة بنفس الطريقة. على سبيل المثال ، قد تكون بعض عينات الورم الأرومي العصبي غير متمايزة أو ضعيفة التمايز ، بينما قد يكشف البعض الآخر عن درجة عالية من التمايز ودرجة متغيرة من التكلسات. من حين لآخر ، يجب قطع أقسام متعددة للحصول على عدد قليل من الأقسام الجيدة لتتم معالجتها بشكل أكبر. من الأهمية بمكان تجنب أي نوع من الاهتزازات: التنفس ، والطاولة ، والضواغط من نطاقات EM. إذا تمت مصادفة تحطم على الأقسام ، فقد يكون من الضروري شد مسامير UCM. إذا شوهدت خدوش على الأقسام ، فقم بتغيير السكين الماسي لاستخدامه في القطع. في بعض الأحيان ، لا ترى قطع القطع الأثرية إلا في الخطوة النهائية. إذا تم اكتشاف قطع القطع الأثرية تحت المجهر الإلكتروني ، فيجب إعادة قطع المقاطع الرقيقة جدا بعد تحديد سبب القطعة الأثرية.

TEM له قيود واضحة ، ونافذة المراقبة أصغر من المنظر الذي تم التقاطه باستخدام الفحص المجهري الضوئي التقليدي. لا يمكن أن تكون المساحة المطلوبة للفحص المجهري الإلكتروني أكبر من 1 مم مربع. في بعض الأحيان ، قد تفيد مساحة أكبر من الفحص ، لكن من المستحيل قطعها. لن تتناسب مع الشبكة النحاسية ، وسوف تلحق الضرر بالسكين الماسي ، وستكون جودة القسم أقل شأنا بالتأكيد. يجب اتخاذ بعض الخيارات ، ويجب اختيار الهيكل أو المنطقة الأكثر أهمية في وقت الفحص. لا يمكن زيادة سرعة القطع ؛ سوف يتسبب في قطع القطع الأثرية على الأقسام. لا يزال 1 مم / ثانية حرجا.

بالإضافة إلى السمات الكلاسيكية المذكورة أعلاه (على سبيل المثال ، حبيبات الإفراز العصبي) ، غالبا ما تظهر البنية التحتية للميتوكوندريا في خلايا الورم الأرومي العصبي التي تم فحصها بواسطة TEM مستويات ملحوظة من الانقسام ، وهي آلية خلوية انتقائية للتحكم في جودة الميتوكوندريا تمكن من تدهور الميتوكوندريا ، والتي تعتبرها الخلايا تالفة و / أو غير ضرورية^28،29. نتيجة لذلك ، تعاني الميتوكوندريا من تورم وتمزق كريستا واختفاء كريستا. في الواقع ، Radogna et al. وجد الانقسام الخفيف الفعال كآلية حاسمة تؤدي إلى فشل تنشيط مسار موت الخلايا البرمجية التي زادت من مقاومة SK-N-AS ، وهو خط خلوي من الورم الأرومي العصبي مع تخليق معزز لعامل النمو الشبيه بالأنسولين II (IFG-II) و IGF-II RNA وإيواء مستقبلات IGF من النوع الأول ل UNBS1450 ، وهو كاردينوليد نصفي ينتمي إلى عائلة جليكوسيد الستيرويد القلبي ، تحفيز التشريع بجرعات أعلى إلى حد ما³⁰.

من المهم بشكل خاص التشخيص التفريقي دور TEM لساركوما إوينغ. تعتبر ساركوما إوينغ مكافئة لورم الخلايا العصبية الظاهرية المحيطية ، على الرغم من أن بعض الجدل قد تم إنفاقه في^31،32،33 الماضية. عمليا ، في الخلايا البدائية لساركوما إوينج ، فإن الجليكوجين السيتوبلازم الوفير ، ووصلات الخلايا سيئة التطور ، وعدم وجود سمات عصبية هي الخصائص الرئيسية. هناك تشابه مذهل في ورم الأديم العصبي الظاهر المحيطي مع ساركوما إوينغ في المجهر الإلكتروني. في الواقع ، يعتبر كلا الورمين نفس الكيان ويتم علاجهما بنفس البروتوكولات العلاجية في كل من SIOP (الجمعية الدولية لأورام الأطفال) و COG (مجموعة أورام الأطفال) بالإضافة إلى UKCCSG (مجموعة دراسة سرطان الأطفال في المملكة المتحدة) لأنهما يشتركان في نفس نقل الكروموسومات. ومع ذلك ، في PNET ، توجد بعض السمات العصبية ، بما في ذلك الحبيبات الإفرازية العصبية التي تكاد تكون غائبة في ساركوما إوينغ. تعكس هذه المواصفات أيضا النمط الظاهري الكيميائي المناعي. هناك إيجابية لعلامة عصبية واحدة أو اثنتين على الأقل ، على سبيل المثال ، enolase الخاص بالخلايا العصبية ، أو S-100 ، أو synaptophysin ، أو الخيوط العصبية. درس Franchi et al. ES-PNET³¹. في معظم الحالات ، كان للخلايا الورمية بنية فوقية نموذجية ، بما في ذلك الخلايا المعبأة بإحكام ، وضعيفة التمايز ، والشكل البيضاوي إلى متعدد الأضلاع. تحتوي هذه الخلايا على نواة مستديرة أو بيضاوية مع كروماتين مشتت بدقة ونواة واحدة أو اثنتين. في السيتوبلازم ، تعكس العضيات الصغيرة التمايز الضعيف لهذه الخلايا الورمية. ومع ذلك ، فإن الاهتمام الوثيق بالتفاصيل قد يكشف عن وجود الميتوكوندريا ، وعدد قليل من هياكل الشبكة الإندوبلازمية الخشنة (ما يسمى بالصهاريج) ، والليزوسومات المتفرقة ، والريبوسومات الحرة. يمكن اكتشاف تراكم الجليكوجين بسهولة. يمكن رؤية الجليكوجين على أنه إما مشتت أو مجمع. غالبا ما يتم ملاحظة الخيوط الوسيطة في كل من السيتوبلازم والعمليات السيتوبلازمية للخلايا السرطانية. لا ترى الأنابيب الدقيقة. يمكن اكتشاف تقاطعات بدائية في حوالي نصف الحالات المتعلقة بتوصيلات الخلايا. تتكون هذه الهياكل من ديسموسومات متطورة مع خيوط توتونية إذا تم تحديد التقاطعات. يمكن التعرف على بعض تراكم المواد الشبيهة بالغشاء القاعدي وألياف الكولاجين في المصفوفة خارج الخلية. يمكن ملاحظة حبيبات أساسية كثيفة بقطر مشابه للحبيبات التي تظهر في الورم الأرومي العصبي. مثل الفحوصات الكيميائية المناعية للمؤلفين السابقين³¹ ، تميل الأورام المتمايزة جيدا إلى الحدوث خارج الهيكل العظمي ، بينما تنشأ الأورام ضعيفة التمايز في كثير من الأحيان في العظام أكثر من الأنسجة الرخوة.

في الختام ، TEM هي تقنية متميزة يمكن أن يكون لها إمكانات هائلة في المستقبل وهي بعيدة كل البعد عن الموت في الطب. يسلط إدخال تقنيات البيولوجيا الجزيئية مع أحدث تقدم مع تسلسل الجيل التالي الضوء على عدم اتساق سلسلة متصلة في التشخيص ولكن موجة تقدم تشبه الكنغر. يجب ألا يثني إدخال طرق جديدة علماء الأمراض عن استخدام المجهر الإلكتروني باستمرار لأن كلا من الكيمياء المناعية والتقنيات الجزيئية يمكن أن تكون خاطئة. بعض الأنماط الكيميائية المناعية والتشوهات الجينية ليست خاصة بالورم وقد ترتبط ارتباطا سيئا بالأنسجة. على حد علمنا ، يظل TEM طريقة قوية وصالحة وقابلة للتكرار في علم الأمراض والطب. TEM هي أداة مساعدة للتحقيق في أورام الخلايا الزرقاء المستديرة الصغيرة وهي دليل قوي على النتيجة الكيميائية المناعية. يمكن أن يوفر تطبيق TEM باستمرار في منشأة حديثة درجة اتفاقية عالية بين الأفراد وصلاحية عالية وموثوقية فعالة. في المستقبل القريب ، قد يبحث علماء الأحياء الجزيئية عن مختبرات مختصة وصالحة للفحص المجهري الإلكتروني قد تجيب على أسئلة محددة على مستوى البنية الفوقية. على وجه الخصوص ، نرى منظورا جديدا وتطبيقا ل TEM في البيولوجيا الجزيئية ، مثل اقتران TEM بالتجارب التي تهدف إلى فهم بعض الأبحاث الحالية أحادية الخلية.

يتلقى المؤلف الأول إتاوات من الناشرين التاليين: Springer (https://link-springer-com.bdigitaluss.remotexs.co/book/10.1007/978-3-662-59169-7; ISBN: 978-3-662-59169-7) و Nova (https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/; ردمك: 978-1-53619-816-4). تذهب جميع الإتاوات إلى الجمعيات الخيرية للأطفال.

لقد أعربنا عن تقديرنا للخبرة والدعم السخي للدكتور ريتشارد فريند ، الذي كان موظفا سابقا في الخدمات الصحية في ألبرتا في مستشفى جامعة ألبرتا ، وستيفن جوي (1972-2019) ، الذي كان أيضا موظفا سابقا في الخدمات الصحية في ألبرتا في مستشفى جامعة ألبرتا. نكرس هذا العمل لذكرى السيد جوي ، وهو خبير تقني كبير في تحقيقات البنية التحتية الذي توفي بشكل مأساوي وقبل الأوان قبل بضع سنوات. كان السيد جوي ركيزة لمعظم دراسات المجهر الإلكتروني في ألبرتا ، كندا. أفكارنا وصلواتنا من أجله ومن أجل عائلته. كما أننا مدينون للسيدة ليزلي بيرنت على مساعدتها ومشورتها. تم تمويل أبحاث الدكتور سي سيرجي من خلال كرم مستشفى الأطفال في شرق أونتاريو ، أوتاوا ، أونتاريو ، ومؤسسة مستشفى ستوليري للأطفال وداعمي مستشفى لويس هول للنساء من خلال معهد أبحاث صحة المرأة والطفل (WCHRI ، معرف المنحة #: 2096) ، مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة هوبي لجامعة هوبي للتكنولوجيا (منحة 100 موهبة لبرنامج توظيف الخبراء الأجانب التمويل الإجمالي: التشخيص الرقمي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل والتشخيص القائم على NGS للعدوى والأورام ، 2017-2022) ، Österreichische Krebshilfe Tyrol (Krebsgesellschaft Tirol ، المعهد النمساوي لأبحاث السرطان التيرولي ، 2007 و 2009 - "DMBTI وسرطان الخلايا الصفراوية" و "Hsp70 و HSPBP1 في سرطان البنكرياس") ، صندوق الأبحاث النمساوي (Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung ، FWF ، معرف المنحة L313-B13) ، المؤسسة الكندية لصحة المرأة ("قلب الجنين المبكر RES0000928") ، جمعية أبحاث السرطان (التعبير الجيني لعامل فون ويلبراند في الخلايا السرطانية) ، والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (أحماض أوميغا 3 الدهنية لعلاج أمراض الكبد المرتبطة بالفشل المعوي: دراسة بحثية انتقالية ، 2011-2014 ، CIHR 232514) ، والبيت الثقافي السعودي ، أوتاوا ، كندا. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطة.