מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה: כלי לפתולוגיה כירורגית לנוירובלסטומה

גידולי תאים כחולים עגולים קטנים בילדים הם אוסף מסקרן ומאתגר של ניאופלזמות. לכן, מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) וידע מקצועי בגידולי ילדים יכולים להיות בעלי ערך רב בפתולוגיה כירורגית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע TEM לאבחון נוירובלסטומה, אחד הגידולים המוצקים הנפוצים ביותר בילדות.

גידולי תאים כחולים עגולים קטנים בילדים (PSRBCT) הם אוסף מסקרן ומאתגר של ניאופלזמות. מיקרוסקופ אור של גידולי תאים כחולים עגולים קטנים מזהה תאים עגולים קטנים. הם מכילים גרעין היפרכרומטי בדרך כלל וציטופלזמה בזופילית דלה יחסית. גידולי תאים כחולים עגולים קטנים בילדים כוללים מספר ישויות. בדרך כלל, הם משלבים גידול וילמס, נוירובלסטומה, רבדומיוסרקומה, סרקומה יואינג, רטינובלסטומה, לימפומה ואוסטאוסרקומה של תאים קטנים, בין היתר. אפילו באמצעות אימונוהיסטוכימיה, האבחנה המבדלת של ניאופלזמות אלה עשויה להיות שנויה במחלוקת במיקרוסקופ אור. כתמים קלושים או רקע מעורפל יכולים להרתיע פתולוגים מלקבל את ההחלטה האבחנתית הנכונה. בנוסף, ביולוגיה מולקולרית עשויה לספק כמות עצומה של נתונים המאתגרים להבחין ביניהם, וניתן לראות כמה טרנסלוקציות ביותר מקטגוריה אחת. לפיכך, מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה (TEM) יכול להיות בעל ערך רב. כאן אנו מדגישים את הפרוטוקול המודרני לנתוני TEM של הנוירובלסטומה. תאי גידול עם סבכים של תהליכים ציטופלזמיים המכילים גרגירים נוירו-הפרשתיים יכולים לאבחן נוירובלסטומה.

עבודתו של פתולוג עשויה להיות מאתגרת למדי הן בתחומי האבחון הקליני והן בתחומי המחקר. האבולוציה של מיקרוסקופ האור במאות^{ה-18 וה-19} הייתה מדהימה. כוחו של מיקרוסקופ אלקטרונים מסתמך בעיקר על אורך הגל של האלקטרונים, שהוא קצר יותר מהאור ^1,2,3. לפני הופעת הנוגדנים הפוליקלונליים והחד-שבטיים ויישומם באימונוהיסטוכימיה, TEM מילא תפקיד משפיע באבחון גידולים קטנים של תאים כחולים עגולים.

החל משנות ה-90 של המאה הקודמת, הגישה האימונוהיסטוכימית החליפה את הכלי המורפולוגי באבחון⁴. נכון לעכשיו, ישנם אלפי נוגדנים רב-שבטיים וחד שבטיים חדשים המכוונים לאנטיגנים מקבוצת הגידול הקטן של התאים הכחולים העגולים 4,6,7,8. בעשור האחרון של המאה^ה-20 ובעשור הראשון של^{תחילת המאה} ה-21, נראה כי הביולוגיה המולקולרית, כולל הכלאה פלואורסצנטית באתרה, מבדיקות גנומיות ועד ריצוף הדור הבא, החליפה את תפקיד היישום המשמעותי של אימונוהיסטוכימיה במספר מעבדות⁴. מינהל המזון והתרופות (FDA) בארצות הברית של אמריקה, הסוכנות הקנדית לפיקוח על המזון (CFIA) של קנדה, הסוכנות להגנת הסביבה (EPA) או גופים ממשלתיים דומים במדינות אחרות לא תמיד מאשרים פרוטוקולים של ביולוגיה מולקולרית⁹. נראה שיש הרבה מידע די מאתגר להכניס לדוח פתולוגיה שיכול לשמש למטרות טיפוליות, והבחירה האוקולטית של מערכת מידע מעבדתית ממומנת היטב ופועלת היא קריטית¹⁰. בינתיים, אימונוהיסטוכימיה חשפה מלכודות רבות, כאשר גידולי אפיתל מראים סמנים מזנכימליים ולהיפך¹¹. המעבר האפיתלי-מזנכימלי בלבל כמה גבולות בקבוצות פתולוגיה^12,13. בשנים האחרונות התברר כי מיקרוסקופ אלקטרונים שגשג במספר מעבדות ברחבי העולם¹⁴. בפרט, זמן האספקה של דגימות הרקמה ירד משבועות ל-3 ימים בלבד או אפילו פחות באמצעות מספר פרוטוקולים המתקרבים לצביעה עם נוגדנים חד-שבטיים או רב-שבטיים ^4,10.

יתרה מכך, יישום מצלמה אלקטרונית בשילוב עם מיקרוסקופ האלקטרונים עזר לספק לפתולוגים תמונה מהירה, שהיא רב-תכליתית במערכות הפעלה שונות. לבסוף, חלק מהנוגדנים, גם לאחר שליפת אנטיגן, מאתגרים להתגלות באזורים מסוימים של נמק או שינויים הקשורים לאוטופגיה/איסכמיה. יחד עם זאת, מיקרוסקופ אלקטרונים בידיים בטוחות עדיין יכול לספק תוצאות מצוינות ורמזים לסיווג נכון של גידולים פתולוגיים לא ידועים¹⁵.

קבוצת גידולי התאים הכחולים העגולים הקטנים בילדים כוללת מספר גידולים, בעיקר נוירובלסטומה, גידול וילמס או נפרובלסטומה, רבדומיוסרקומה וסרקומה יואינג. נתוני הביולוגיה המולקולרית ביחס לקבוצת הילדים של גידולי תאים כחולים עגולים קטנים יכולים להיות מכריעים בגלל הטכניקות המיושמות. התאים הכחולים העגולים הקטנים עשויים שלא להיות שונים בהרבה בכתמים שגרתיים (צביעת המטוקסילין ואאוזין), וחלק מהגידולים עשויים להיות בעלי מאפיינים אימונופנוטיפיים חריגים. ההתקדמות בביולוגיה מולקולרית הייתה עצומה מאז גילוי TEM. בקבוצה של גידולי תאים כחולים עגולים קטנים, ניתן להיתקל בניאופלזמות מסוימות בתדירות גבוהה יותר מאחרות, אך יש לקחת אותן בחשבון. למרות שקרצינומה של תאי כליה פפילריים אינה בעצם גידול קטן של תאים כחולים עגולים אלא כוללת בעיקר פפילות, היא עשויה להראות כמה אזורי תאים עגולים שעשויים להיות נבדלים מגידולי תאים כחולים עגולים קטנים אחרים (למשל, גידול וילמס) באמצעות מספר טכניקות נלוות¹⁶. בסופו של דבר, ייתכן שיהיה צורך לקחת גם גידולים סטרומליים מטאנפריים לאבחנה מבדלת¹⁷. הגידול הרבדואיד הוא גידול ילדים ממאיר במיוחד המובחן בתת-סוג הכליה והחוץ-כליה¹⁸.

נוירובלסטומה היא אחת הממאירות המוצקות הנפוצות ביותר בינקות ובילדות. תאי נוירובלסטומה הם התאים הממאירים של הגידול המוצק הזה הנובעים בערמומיות מנגזרות של הפסגה העצבית הקדמונית. האבחנה והאבחנה המבדלת שלו עשויות להיות קשות. הביולוגיה הטבעית שלו ראתה התקדמות יוצאת דופן בשני העשורים האחרונים. משפחת גורמי השעתוק של ראש המזלג מאופיינת בתחום "ראש מזלג" מובהק (FOXO3/FKHRL1). גורמי שעתוק אלה מתפקדים כטריגר לאפופטוזיס (מוות תאי מתוכנת) באמצעות ביטוי גנים הנחוצים למוות תאי. FOXO3/FKHRL1 מופעל על ידי 5-aza-2-deoxycytidine וגורם לקספאז-8 מושתק, וקומפלקס זה ממלא תפקיד מכריע בנוירובלסטומה. FOXO3 גרעיני מנבא תוצאות קליניות שליליות ומקדם אנגיוגנזה של גידול בנוירובלסטומה ^7,19. למרות ההתקדמות בפתולוגיה המולקולרית, סיווג שימאדה נותר הסטנדרט של כל פתולוג ואונקולוג ילדים. זה קריטי בהבחנה בין היסטולוגיה חיובית לשלילית 20,21,22,23.

הרציונל לפיתוח פרוטוקול פשוט למיקרוסקופ אלקטרונים של גידולים החשודים בנוירובלסטומה קשור להיתכנות ולמוצקות של הבדיקה האולטרה-מבנית של דגימת הרקמה. לעתים רחוקות הוא משתנה על ידי בעיות נפוצות בשימוש באימונוהיסטוכימיה. הרציונל והפרוטוקול היו הבסיס למספר ספרי לימוד ותרומות מדעיות לפתולוגיה של ילדים ומיקרוסקופ אלקטרונים ^4,24,25. פרוטוקול זה משתרע על פני ניסיון של שלושה עשורים של המחבר ויתמקד בכמה PSRBCT, תוך שימת דגש על הניסיון האישי וסקירת הספרות.

כל ההליכים שבוצעו במחקרים שכללו משתתפים אנושיים היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת המחקר המוסדית ו/או הלאומית ועם הצהרת הלסינקי משנת 1964 והתיקונים המאוחרים יותר שלה או סטנדרטים אתיים דומים. בדיקת מיקרוסקופ אלקטרונים היא חלק משגרת החקירה המיקרוסקופית הרגילה של הדגימות המתקבלות לצרכי אבחון ואינה דורשת אישור של הוועדה לביואתיקה. מחקר זה הוא רטרוספקטיבי ומכבד את האנונימיות המוחלטת של המדגמים.

1. פרוטוקול TEM לאחזור FFPE (קבוע פורמלין ומשובץ פרפין) ודגימות רקמה קבועות בגלוטרלדהיד

1. אחזר את השקופיות האחרונות המוכתמות בהמטוקסילין ואאוזין ואת גוש הרקמה FFPE.
2. בעזרת טוש קבוע, בחר את אזור העניין בשקופית הרקמה והתאם אותו לאזור על גוש הרקמות.
3. גזרו את האזור שנבחר בעזרת סכין גילוח חדש מהבלוק וחתכו אותו במדויק לקוביות של 5 מ"מ על נייר פילטר.
4. הנח את נייר הסינון עם הטישו שנשלף בצלחת פטרי מסומנת. מכניסים את צלחת הפטרי לתנור של 60-70 מעלות למשך 15 דקות, כלומר עד שהפרפין נמס (שעוות פרפין מורכבת מתערובת של פחמימנים מוצקים בעלי שרשרת ישרה הנעים בנקודת התכה של 48 מעלות צלזיוס-66 מעלות צלזיוס (120 עד 150 מעלות צלזיוס)) ונספגת בנייר המסנן.
5. העבירו את הרקמה שאוחזרה ללא פרפין לבקבוקון נצנוץ מלא ב-4 מ"ל של 100% טולואן (מתילבנזן) v/v [100% טולואן פירושו 100 מ"ל טולואן]. ודא שהדגימות מסתובבות ברציפות בתהליך הדפרפיניזציה (מהירות סיבוב: 24 סיבובים/דקה).
6. עברו שני שינויים של טולואן, שעה כל אחד, ושינוי אחד של 4 מ"ל של 100% טולואן 30 דקות כל אחד, באמצעות מכשיר מסתובב בזווית.
7. המשך דרך שינוי אחד ב-4 מ"ל של 100% אתנול מוחלט (C₂H₅OH) למשך שעה, ולאחר מכן שני שינויים של 4 מ"ל של 100% אתנול מוחלט למשך 30 דקות כל אחד. לאחר מכן, שינוי נוסף של 30 דקות ב-4 מ"ל של 70% אתנול.
8. המשך בשינוי אחד של 4 מ"ל של מאגר נתרן קקודילאט 0.1 M, 30 דקות. העבירו את הדגימות ב-4 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד ושמרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
9. השתמש בשלבים הבאים במעבד רקמות אוטומטי כדי לתקנן את העיבוד: 0.1 M נתרן קקודילאט מאגר למשך 5 דקות, 2% אוסמיום טטרוקסיד למשך שעה ו-50 דקות, dH₂O למשך 5 דקות, 50% אתנול למשך 15 דקות, 70% אתנול למשך 30 דקות, 100% אתנול למשך 15 דקות (שלוש פעמים), 100% אתנול למשך 30 דקות (שלוש פעמים), 100% אתנול למשך 45 דקות, אצטון למשך 50 דקות, שרף למשך שעה (פעמיים) ושרף טרי למשך הלילה. נפח כל הפתרונות הוא 15 מ"ל.
10. הטמע עם שרף טרי היישר ממעבד הרקמות.
    1. מקם כמוסות פוליאתילן במחזיק עם רצועות נייר ממוספרות. זרוק שרף טרי בכמוסות, העביר את הדגימה לבלוקים המתאימים ושמור את הבלוקים למשך הלילה בתנור של 60 מעלות צלזיוס (140 מעלות צלזיוס).
11. מכתים חלקים דקים למחצה (500 ננומטר) עם 1% כחול טולואידין על הפלטה החמה, הגדרת חום מינימלית למשך 30 שניות, שוטפים ב-dH₂O ולאחר מכן מניחים כיסוי.
12. כאן, המיקרוטום Ultracut (UCM) משמש לחיתוך קטעים דקים למחצה.
    1. קח בלוק משובץ שרף והתקן אותו במחזיק הבלוק של ה-UCM. לאחר מכן, התקן את מחזיק הבלוק על הבמה של ה- UCM והדק אותו.
    2. חותכים עודפי שרף סביב הדגימה באמצעות סכין גילוח מצופה קצה יחיד באמצעות העיניים. חותכים את פני הבלוק בצורה טרפזית.
    3. הסר את מחזיק הבלוק מה-stagה והתקן אותו בזרוע ה-UCM, חזק. לאחר מכן, התקן את מחזיק הלהב על UCM stage. לבסוף, הדק סכין זכוכית על מחזיק הלהב.
    4. בעזרת העיניים והאור שמספק ה-UCM, החלק את קצה סכין הזכוכית לאט, קרוב ככל האפשר, לפני השטח של גוש השרף לחיתוך. הדק את מחזיק הלהב במקומו על ה-stagה.
    5. הגדר את עובי החיתוך של ה-UCM ל-500 ננומטר וחתוך את גוש השרף עד ל-75% פנים מלאות.
    6. החלף את סכין הזכוכית לחדשה. הוסף מים סטריליים למאגר סכין הזכוכית.
    7. סמן שקופית מיקרוסקופ עם מספר המארז והניח ארבע טיפות נפרדות של מים סטריליים על מגלשת הזכוכית.
    8. עדיין בהגדרה של 500 ננומטר, חתוך ארבעה חלקים מהבלוק. בעזרת מלקחיים עדינים, העבירו קטע אחד בכל פעם באחת מטיפות המים על מגלשת הזכוכית. כל טיפה בשקופית תכיל קטע אחד. יבש את השקופית על פלטה חמה בהגדרת החום הנמוכה ביותר עד לייבוש (30 שניות).
13. מכתים בשיטת הכחול טולואידין. שוטפים במים ומניחים כיסוי. בדוק חלקים כחולים של טולואידין תחת מיקרוסקופ אור. אם נראים מבני רקמה רצויים, חותכים חלקים דקים במיוחד. אם מבני הרקמה הרצויים אינם נראים לעין, חתכו חלקים עמוקים יותר וצבעו אותם באותם שלבים עד שהמבנים הרצויים נחשפים ומוצגים בשקופית הכחולה של טולואידין.
14. כאשר מזוהה האזור הרצוי למיקרוסקופ אלקטרונים מהחלקים הכחולים של הטולואידין, חותכים את החלקים הדקים במיוחד ברשתות הנחושת. חותכים פרוסות דקות במיוחד באמצעות אולטרה-מיקרוטום (יש לחתוך דגימות המיועדות לצפייה ב-TEM לפרוסות דקות מאוד (80 ננומטר)).
    1. קח בלוק משובץ שרף והתקן אותו במחזיק הבלוק של ה-UCM. לאחר מכן, התקן את מחזיק הבלוק על הבמה של ה- UCM והדק אותו.
    2. בעזרת העיניים חותכים את השרף סביב האזור הרצוי למיקרוסקופ אלקטרונים באמצעות סכין גילוח מצופה בקצה אחד. חותכים את פני הבלוק בצורת טרפז, לא יותר מ-1 מ"מ מרובע. אם האזור הרצוי למיקרוסקופ אלקטרונים מאתגר לראות בגלל בוהק האור, השתמש בטפטוף של כלורופורם כדי להדגיש את המבנים בגוש השרף.
    3. הסר את מחזיק הבלוק מה-stagה והתקן אותו בזרוע ה-UCM, חזק. לאחר מכן, התקן את מחזיק הלהב על UCM stage. לבסוף, הדק סכין יהלום על מחזיק הלהב.
    4. בעזרת העיניים והאור המסופק על ידי ה-UCM, החלק את קצה סכין היהלום לאט, קרוב ככל האפשר, אל פני גוש השרף לחיתוך. הדק את מחזיק הלהב במקומו על ה-stagה.
    5. התאם את הזוויות השונות של סכין היהלום באמצעות הברגים של ה-UCM. ודא שקצה סכין היהלום מיושר בצורה מושלמת ככל האפשר עם פני הבלוק לחיתוך. מלאו את מיכל סכין היהלום במים סטריליים.
    6. הגדר את ה-UCM בעובי 80 ננומטר ובמהירות של 1 מ"מ לשנייה. כאן, הפונקציה האוטומטית משמשת לחיתוך דק במיוחד. הגדר את חלון החיתוך על ה-UCM (החלק העליון והתחתון של פני הבלוק).
    7. לחץ על כפתור התחל של ה-UCM כדי להתחיל בחיתוך. החלקים יצופו על המאגר הסטרילי של סכין היהלום.
    8. כאשר חותכים מספיק חלקים, השתמש באדי כלורופורם כדי ליישר את החלקים. טובלים צמר גפן בכלורופורם ומעבירים אותו מעל החלקים מבלי לגעת בהם.
15. טבלו רשת נחושת ב-100% אלכוהול ולאחר מכן מים סטריליים בעזרת מלקחיים עדינים. נקה כל רשת לפני השימוש. בחר את החלקים בכמה רשתות.
16. השאירו את הרשתות עם קטעים על נייר סינון מסומן. מניחים את נייר הסינון הזה בצלחת פטרי ומכניסים לתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר לחלקים להתייבש על הרשתות.
17. לאחר מכן, בצע את צביעת הניגודיות.
    1. צבעו את הרשתות באורניל אצטט או בכל תחליף חלופי ידידותי לסביבה למשך דקה אחת. לאחר מכן, שטפו אותם במים סטריליים להזרקה (40 טבילות בארבעה מיכלי מים שונים לכל שטיפה לאחר אורניל אצטט וציטראט עופרת). שלב ציטראט עופרת הוא גם דקה אחת.
18. הכנס את הרשת ל-TEM, מה שמאפשר לקרן אלקטרונים במתח גבוה להיפלט על ידי קתודה וליצור על ידי עדשות מגנטיות. האלומה שהועברה חלקית דרך הדגימה הדקה (שקופה למחצה של אלקטרונים) יוצרת את מידע ה-TEM על המסך (ראה להלן).

2. פרוטוקול TEM לסריקה וצילום הדגימות

1. לאחר שהקטעים על הרשתות מוכתמים, סנן אותם במיקרוסקופ האלקטרונים. במיקרוסקופ האלקטרונים, הפעל את מתח ה-ACC להגדרה שנקבעה מראש (200-300 קילו וולט), התלויה במיקרוסקופ האלקטרונים בו נעשה שימוש.
2. במחשב, הפעל את תוכנת המצלמה הדיגיטלית והזן את מספר המארז. זה חשוב מכיוון שהמיקרו-תצלומים נשמרים בתיק המתאים.
3. טען את הרשת במיקרוסקופ האלקטרונים, משוך את דגימת האקדח באמצע הדרך החוצה והפוך את המתג ל-AIR כדי לאפשר לוואקום מתא אקדח הדגימה להתמלא באוויר הסביבה (חדר).
4. ברגע שהוא מלא באוויר, משוך החוצה את דגימת האקדח. הנח את דגימת האקדח על המחזיק המעוצב. לאחר מכן, פתח את מחזיק הרשת בקצה האקדח.
5. הנח את הרשת במקומה. סגור את מחזיק הרשת וודא שהרשת מאובטחת.
6. החזר את דגימת האקדח לתא הדגימה באמצע הדרך והפוך את המתג ל-EVAC כדי ליצור ואקום בתא הדגימה.
7. מחוון האור הירוק יידלק כאשר הוואקום יושג בתא הדגימה. לאחר מכן, דחפו את דגימת האקדח בזהירות לתוך עמודת מיקרוסקופ האלקטרונים והקפידו לא לאפשר לה לעבור מהר מדי. אחרת, זה יפגע בחפץ בקצה דגימת האקדח.
8. לאחר שהרשת נמצאת היטב במקומה בעמודת מיקרוסקופ האלקטרונים, הפעל את החוט להגדרת הרוויה הבינונית (שנקבעה מראש).
9. הפעל את המצלמה דרך מתג ההפעלה/כיבוי . במחשב, לחץ על תמונה חיה בתוכנת ההדמיה.
10. במיקרוסקופ האלקטרונים, לחץ על כפתור ההגדלה הנמוכה ופתח את צמצם המטרה. זה מאפשר לבחור את אזור ההקרנה הרצוי. לאחר מכן, מקם את האזור הרצוי של הקטע באמצע מסך המחשב, באמצעות שני הבקרים משני צידי העמודה של מיקרוסקופ האלקטרונים.
11. במיקרוסקופ האלקטרונים, לחץ על כפתור הזום וסגור את צמצם המטרה כדי להשיג ניגודיות טובה יותר.
12. התחל את הקרנת הקטע על ידי צילום מיקרו-תמונות בהגדלה של פי 2,500. לאחר מכן, כוונן את המיקוד באמצעות כפתור הוובלר וכפתור הבהירות במיקרוסקופ האלקטרונים כדי להבטיח את איכות המיקרופוטו.
13. לחץ על תמונה סופית במחשב כדי לצלם את המיקרו-תצלום. אם הצבעים אינם אחידים, בצע תיקון רקע בתוכנת המצלמה. כמו כן, התאם את הניגודיות בתמונה הסופית באמצעות התוכנה לפני שמירת המיקרופוטו.
14. כאשר המיקרופוטו נשמר, בדוק שוב את מספר המארז וההגדלה כדי להבטיח זיהוי נכון של המיקרו-תצלומים שצולמו.
    הערה: במקרים מסוימים, המשתמש יכול גם להזין כיתובים נוספים, וגם ראשי התיבות של טכנולוג מיקרוסקופ האלקטרונים מוזנים.
15. בצע את תהליך המיקרוגרף בכל שטח החלק המיועד להקרנה. לאחר הגדלה מספקת של פי 2,500, נשמרים מיקרו-תצלומים כדי לכסות את אזור העניין, ללכוד מיקרו-צילומים בהגדלה של פי 4,000 ו-8,000x ולשמור אותם במחשב עם זיהוי מספר המקרה המתאים.
16. בצע תקריב על הקטע לפרטים אולטרה-מבניים ספציפיים אם ניתנות הוראות סינון ספציפיות מאוד. לאחר מכן, שמור את המדידות של פרטים אולטרה-מבניים ספציפיים במחשב תוך התחשבות בהגדלות גבוהות יותר במידת הצורך.
17. לאחר השלמת בדיקת הדגימה, כבה את הנימה, המצלמה, המתח הגבוה ותוכנת המצלמה ברצף. לאחר מכן, הסר את הרשת מעמודת מיקרוסקופ האלקטרונים, ואפשר אוויר בתא דגימת האקדח.
18. תייק את הרשת בקפסולת ג'לטין ואחסן את הקפסולה בקופסה מסומנת כהלכה, יחד עם גושי השרף של אותו מארז. החזר את דגימת האקדח לתא האקדח ואחסן אותה בסביבה קרירה ויבשה כדי לשמר את החומר בו נעשה שימוש.
19. העבר את המיקרו-צילומים הדיגיטליים בפלטפורמות שיתופיות נפוצות (למשל, SharePoint) או בשרתים פנימיים כדי לאפשר לפתולוג לצפות בהם.
20. יש להזין את יחידות העבודה במערכת המידע המעבדתי (LIS).
21. אם נדרשים מיקרו-צילומים ספציפיים יותר, משוך את רשת השדה והשתמש בהם שוב לצורך סינון נוסף או שאלות ספציפיות.

תכונות ה- TEM הייחודיות של הנוירובלסטומה מוצגות כאן. כאן נדגים את מאפייני ה-TEM הייחודיים של הנוירובלסטומה.

נוירובלסטומה היא אחת הממאירות המוצקות הנפוצות ביותר בינקות ובילדות. תאי נוירובלסטומה הם התאים הממאירים של הגידול המוצק הזה הנובעים בערמומיות מנגזרות של הפסגה העצבית הקדמונית. היסטוגנזה זו מסבירה כמה מאפיינים ביוכימיים ומורפולוגיים של גידול כחול זה. עם זאת, המאפיינים הציטו-וההיסטופתולוגיים הדטרמיניסטיים של נוירובלסטומה יכולים להשתנות באופן ספציפי בהתאם למידת ההתמיינות המשתנה. לכן, האבחנה והאבחנה המבדלת שלה עשויות להיות קשות. ההבחנה בין נוירובלסטומה לאלמנטים דמויי תאי גנגליון מוצגת על ידי כמות הולכת וגדלה של ציטופלזמה תאית עם התפתחות של תהליך ציטופלזמי ושינוי של התמונה הגרעינית (איור 1A-D). הגדלה גרעינית וגרעין גלוי אופייניים להתמיינות נוירובלסטומה. ניתן להבחין גם בהתמיינות לאלמנטים דמויי תא שוואן. החקירה המיקרוסקופית של האלקטרונים מגלה גרגירים נוירו-הפרשתיים (קוטר ממוצע 100 ננומטר) הקיימים כל הזמן עם או בלי הקרנות ציטופלזמיות דמויות נויריט המכילות מיקרו-צינורות וחוטי ביניים דקים²⁶. מיעוט הגליקוגן מאפיין נוירובלסטומה, ואם הוא נראה לעתים רחוקות, הוא לעולם לא בונה אגרגטים. מידת ההתמיינות מבדילה את המבנה האולטרה-מבני של נוירובלסטומה. גרגירי נוירו-הפרשה או קטכולאמין אופייניים לניאופלזמה זו, בקוטר של כ -150 ננומטר. יש להבדיל בין הגרגירים הנוירו-הפרשתיים ממבנים דמויי דסמוזום. ניתן לראות גרגירים נוירו-הפרשתיים קרוב לחוטים תוך-ציטופלזמיים (נוירופילמנטים). תהליכי התא הם לרוב שמנמנים וגליליים ומכונים בדרך כלל נויריטים (אקסונים ודנדריטים). חלק מתהליכי התא מכילים מיטוכונדריה, שהם קריטיים לתנועת התא הניאופלסטי. נויריטים מכילים מיקרו-צינורות, אך ייתכן שיש להם גם מיטוכונדריה נפוחה. במקרה של נוירובלסטומה מובחנת בצורה גרועה, לעתים קרובות ניתן למצוא כמה תכונות. הם כוללים אי סדירות משמעותית יותר של מורפולוגיה גרעינית, מיטוזות רבות ודמויות אפופטוטיות, מחסור במיקרו-צינורות ותהליכים תאיים, בניגוד לנוכחות כמעט קבועה של נוירופילמנטים, מחסור בנויריטים, המכילים לעתים קרובות יותר מיטוכונדריה מאשר מיקרו-צינורות, ללא או מעט מאוד צמתים סינפטיים, ללא גליקוגן, אזורים של פוליריבוזומים רבים ומחסור בגרגירים נוירו-הפרשות. גרגירים נוירו-הפרשתיים הם קריטיים כדי להבדיל בין נוירובלסטומה ל-PSRBCT אחר, כולל רבדומיוסרקומה עוברית, גרנולומה אאוזינופילית, אוסטאוסרקומה של תאים קטנים וסרקומה של תאי רשתית, מה שעלול לגרום לאתגרי אבחון בגלל נוכחות גרעיניות ציטופלזמית.

איור 1: TEM של נוירובלסטומה. (A-C) תאי נוירובלסטומה מסוג מובחן בצורה גרועה עם יחס גרעין לציטופלזמה גבוה וכמה אברונים. הכרומטין מפוזר בגרעין אך מרוכז גם בפריפריה הקרובה לקרום הגרעין. גרעין נראה בגרעין בפינה הימנית העליונה (סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר). (D) תאי נוירובלסטומה עם גרגירים נוירו-הפרשתיים שמציגים ממברנה כפולה אופיינית (סרגל קנה מידה: 200 ננומטר). חיצים אדומים מצביעים על הגרעין, חיצים כחולים חושפים הטרוכרומטין, חיצים כתומים מזהים אאוכרומטין, חיצים ירוקים מתמקדים במיטוכונדריה, וחצים צהובים מצביעים על שלפוחיות הדומות לטרמינלים הפרה-סינפטיים הרגילים. עם זאת, השלפוחיות בנוירובלסטומה גדולות ולא סדירות יותר מהמסופים הפרה-סינפטיים הקלאסיים. לבסוף, החצים השחורים חושפים מספר רב של גרגירים נוירו-הפרשתיים צפופים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

בסקירה נרטיבית זו עם פרוטוקול נלווה, הדגשנו את המאפיינים האולטרה-מבניים הייחודיים של הנוירובלסטומה. בסופו של דבר, אנו מציעים שמיקרוסקופ אלקטרונים רחוק מלהיות טכניקה "מתה" או עתיקה, ומניח גילוי של תפקיד חדש בשילוב עם טכנולוגיות אומיקס של תא בודד. תרומה זו רוצה להדגיש את התפקיד המעולם לא העתיק של מיקרוסקופ אלקטרונים בפתולוגיה של ילדים ^4,27. השלבים הקריטיים, השינויים ופתרון הבעיות של הטכניקה והמגבלות מפורטים להלן.

ישנם כמה שלבים קריטיים לפרוטוקול זה. ראשית, חיוני לחתוך את האזור הרצוי למיקרוסקופ אלקטרונים. יש לכוונן את קצה היהלום כך שיפנה אל פני הבלוק קרוב ככל האפשר. זה דורש יד יציבה מאוד. יש לנקוט בזהירות בעת הרמת החלק הצף עם רשתות הנחושת.

שינויים ופתרון בעיות בטכניקה כוללים כמה היבטים שיש לקחת בחשבון. כל דגימה שונה עם איכויות, כגון צפיפות וטבע, שהן משתנות. בהתחשב באופי ובצפיפות החומר, לא כל דגימות הרקמה נחתכות באותו אופן. לדוגמה, חלק מדגימות הנוירובלסטומה עשויות להיות לא מובחנות או מובחנות בצורה גרועה, בעוד שאחרות עשויות לחשוף רמה גבוהה של התמיינות ודרגה משתנה של הסתיידויות. מדי פעם, יש לחתוך מספר קטעים כדי לקבל כמה טובים לעיבוד נוסף. חיוני להימנע מכל סוג של רעידות: נשימה, שולחן, מדחסים מטווחי EM. אם נתקלים בהתנפצות על החלקים, ייתכן שיהיה זה המפתח להדק את ברגי ה-UCM. אם נראים שריטות על החלקים, החלף את סכין היהלום שתשמש לחיתוך. לפעמים, חפצי חיתוך נראים רק בשלב האחרון. אם מתגלים חפצי חיתוך תחת מיקרוסקופ האלקטרונים, יש לחתוך מחדש חלקים דקים במיוחד לאחר זיהוי הגורם לחפץ.

ל-TEM יש מגבלות ברורות, וחלון התצפית קטן אפילו יותר מהנוף שנלכד במיקרוסקופ אור קונבנציונלי. השטח הרצוי למיקרוסקופ אלקטרונים לא יכול להיות גדול מריבוע של 1 מ"מ. לפעמים, שטח גדול יותר יועיל להקרנה, אבל אי אפשר לקצץ. זה לא יתאים לרשת הנחושת, זה יפגע בסכין היהלום, ואיכות הקטע בהחלט תהיה נחותה. יש לבצע כמה בחירות, ויש לבחור את המבנה או האזור החשוב ביותר בזמן ההקרנה. לא ניתן להגביר את מהירות החיתוך; זה יגרום לחפצי חיתוך על החלקים. ה-1 מ"מ לשנייה נשאר קריטי.

בנוסף למאפיינים הקלאסיים המפורטים לעיל (למשל, גרגירים נוירו-הפרשות), המבנה האולטרה-מבני של המיטוכונדריה בתאי נוירובלסטומה שנבדקו על ידי TEM מראה לעתים קרובות רמות יוצאות דופן של מיטופגיה, מנגנון תאי סלקטיבי של בקרת איכות מיטוכונדריאלית המאפשר פירוק של מיטוכונדריה, הנחשבים על ידי התאים כפגומים ו/או מיותרים^28,29. כתוצאה מכך, המיטוכונדריה מכילים נפיחות, קרע קריסטה והיעלמות קריסטה. למעשה, רדוניה ועמיתיו מצאו מיטופגיה יעילה כמנגנון הקריטי המוביל לכישלון ההפעלה של מסלול המוות התאי הפרוגרמטי שהגביר את העמידות של SK-N-AS, קו תאי נוירובלסטומה עם סינתזה משופרת של גורם גדילה דמוי אינסולין II (IFG-II) ו-IGF-II RNA ומכיל קולטני IGF מסוג I ל-UNBS1450, קרדנוליד חצי סינתטי השייך למשפחת הגליקוזידים הלבביים, מעורר נקרופטוזיס במינונים מעט גבוהים יותר³⁰.

רלוונטי במיוחד לאבחנה המבדלת הוא תפקידו של TEM לסרקומה של יואינג. סרקומה של יואינג נחשבת שווה ערך לגידול תאי נוירואקטודרמלי היקפי, אם כי בילה ויכוח מסוים ב-31,32,33 האחרונים. מבחינה מעשית, בתאים הפרימיטיביים של סרקומה יואינג, גליקוגן ציטופלזמי בשפע, צמתים תאיים מפותחים בצורה גרועה וללא מאפיינים עצביים הם המאפיינים העיקריים. יש דמיון בולט בגידול הנוירואקטודרמלי ההיקפי לסרקומה של יואינג במיקרוסקופ אלקטרונים. למעשה, שני הגידולים נחשבים לאותה ישות ומטופלים באותם פרוטוקולים טיפוליים הן ב-SIOP (האגודה הבינלאומית לאונקולוגיה של ילדים) והן ב-COG (קבוצת אונקולוגיה לילדים) כמו גם ב-UKCCSG (קבוצת המחקר של סרטן ילדים בבריטניה) מכיוון שהם חולקים את אותה טרנסלוקציה כרומוזומלית. עם זאת, ב-PNET, קיימים כמה מאפיינים עצביים, כולל גרגירים נוירו-הפרשתיים שכמעט ולא קיימים בסרקומה של יואינג. מפרט זה משקף גם את הפנוטיפ האימונוהיסטוכימי. יש חיוביות לפחות לסמן עצבי אחד או שניים, למשל, אנולאז ספציפי לנוירונים, S-100, סינפטופיזין או נוירופילמנטים. פרנקי ועמיתיו חקרו את ה-ES-PNET³¹. ברוב המקרים, לתאים ניאופלסטיים היה מבנה אולטרה טיפוסי, כולל תאים ארוזים היטב, מובחנים בצורה גרועה, צורה אליפסה עד מצולעת. תאים אלה מכילים גרעין עגול או סגלגל עם כרומטין מפוזר דק וגרעין אחד או שניים. בציטופלזמה, אברונים זעירים המשקפים את ההתמיינות הגרועה של התאים הניאופלסטיים הללו. עם זאת, תשומת הלב הרבה לפרטים עשויה לחשוף נוכחות של מיטוכונדריה, כמה מבני רשתית אנדופלזמית מחוספסים (מה שנקרא ציסטרנה), ליזוזומים ספורדיים וריבוזומים חופשיים. ניתן לזהות הצטברות גליקוגן בקלות. ניתן לראות גליקוגן כמפוזר או מאוגד. חוטי ביניים נצפים לעתים קרובות הן בציטופלזמה והן בתהליכים הציטופלזמיים של תאי הגידול. מיקרו-צינורות אינם נראים. ניתן לזהות צמתים ראשוניים בכמחצית מהמקרים על חיבורי התאים. מבנים אלה עשויים דסמוזומים מפותחים היטב עם טונופילמנטים אם מזוהים הצמתים. ניתן לזהות הצטברות מסוימת של חומר דמוי קרום בסיסי וסיבי קולגן במטריצה החוץ-תאית. ניתן להבחין בגרגירי ליבה צפופים בקוטר דומה לגרגירים הנראים בנוירובלסטומה. בדומה לחקירות האימונוהיסטוכימיות של המחברים הקודמים³¹, ניאופלזמות מובחנות היטב נוטות להתרחש מחוץ לשלד, בעוד שגידולים מובחנים בצורה גרועה מתעוררים לעתים קרובות יותר בעצם מאשר ברקמות רכות.

לסיכום, TEM היא טכנולוגיה יוצאת דופן שיכולה להיות בעלת פוטנציאל עצום בעתיד והיא רחוקה מלהיות מתה ברפואה. הכנסת טכניקות ביולוגיה מולקולרית עם ההתקדמות האחרונה עם ריצוף הדור הבא מדגישה את חוסר העקביות של רצף באבחון אך גל התקדמות דמוי קנגורו. הצגת שיטות חדשות לא אמורה להניא פתולוגים משימוש במיקרוסקופ אלקטרונים באופן עקבי מכיוון שגם האימונוהיסטוכימיה וגם הטכניקות המולקולריות יכולות להיות מוטעות. חלק מהדפוסים האימונוהיסטוכימיים והחריגות הגנטיות אינם ספציפיים לגידול ועשויים להיות בקורלציה גרועה עם היסטולוגיה. למיטב ידיעתנו, TEM נותרה שיטה חזקה, תקפה וניתנת לשחזור בפתולוגיה וברפואה. TEM הוא כלי עזר לחקירת גידולים קטנים ועגולים של תאים כחולים ומהווה הוכחה מוצקה לתוצאה האימונוהיסטוכימית. יישום TEM באופן עקבי במתקן מודרני יכול לספק ציון הסכם בין-אישי גבוה, תוקף גבוה ואמינות יעילה. בעתיד הקרוב, ביולוגים מולקולריים עשויים לחפש מעבדות מוסמכות ותקפות של מיקרוסקופ אלקטרונים שעשויות לענות על שאלות ספציפיות ברמה האולטרה-מבנית. בפרט, אנו רואים פרספקטיבה חדשה ויישום של TEM בביולוגיות מולקולריות, כגון צימוד של TEM עם ניסויים שמטרתם להבין חלק מהמחקר הנוכחי של תא בודד.

המחבר הראשון מקבל תמלוגים מהמו"לים הבאים: Springer (https://link-springer-com.bdigitaluss.remotexs.co/book/10.1007/978-3-662-59169-7; מסת"ב: 978-3-662-59169-7) ונובה (https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/; מסת"ב: 978-1-53619-816-4). כל התמלוגים הולכים לארגוני צדקה לילדים.

הכרנו במומחיות ובתמיכה הנדיבה של ד"ר ריצ'רד פרינד, לשעבר עובד שירותי הבריאות של אלברטה בבית החולים של אוניברסיטת אלברטה, וסטיבן ג'וי (1972-2019), גם הוא לשעבר עובד שירותי הבריאות של אלברטה בבית החולים של אוניברסיטת אלברטה. אנו מקדישים עבודה זו לזכרו של מר ג'וי, טכנולוג בכיר מומחה לחקירות אולטרה-מבניות שהלך לעולמו באופן טרגי ובטרם עת לפני מספר שנים. מר ג'וי היה עמוד התווך של רוב מחקרי המיקרוסקופיה האלקטרונית באלברטה, קנדה. מחשבותינו ותפילותינו עבורו ועבור משפחתו. אנו אסירי תודה גם לגב' לזלי ברנט על עזרתה ועצתה. המחקר של ד"ר סרג'י מומן על ידי בית החולים לילדים של מזרח אונטריו, אוטווה, אונטריו, וקרן בית החולים לילדים סטולרי ותומכים בבית החולים לויס הול לנשים באמצעות מכון המחקר לבריאות האישה והילד (WCHRI, מזהה מענק #: 2096), קרן מדעי הטבע של מחוז חוביי עבור האוניברסיטה הטכנולוגית של חוביי (מענק 100 כישרונות לתוכנית גיוס מומחים זרים מימון כולל): אבחון דיגיטלי מבוסס PCR ו-NGS לזיהום ואונקולוגיה, 2017-2022), Österreichische Krebshilfe Tyrol (Krebsgesellschaft Tirol, המכון האוסטרי לחקר הסרטן בטירול, 2007 ו-2009 - "DMBTI וקרצינומות כולנגיו-תאיות" ו-"Hsp70 ו-HSPBP1 בקרצינומות של הלבלב"), קרן המחקר האוסטרית (Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, FWF, מזהה מענק L313-B13), הקרן הקנדית לבריאות האישה ("Early Fetal Heart-RES0000928"), האגודה לחקר הסרטן (ביטוי גנים של גורם פון ווילברנד בתאים סרטניים), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (חומצות שומן אומגה 3 לטיפול במחלת כבד הקשורה לאי ספיקת מעיים: מחקר תרגומי, 2011-2014, CIHR 232514), ולשכת התרבות הסעודית, אוטווה, קנדה. למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף הנתונים וניתוחם, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.