투과 전자 현미경: 신경모세포종을 위한 외과 병리학 도구

소아의 소아 소원형 청색 세포 종양은 흥미롭고 도전적인 신생물 집합체입니다. 따라서 투과전자현미경(TEM)과 소아 종양에 대한 전문 지식은 외과 병리학에서 매우 중요할 수 있습니다. 여기에서는 소아기에 가장 흔한 고형 종양 중 하나인 신경모세포종을 진단하기 위한 TEM을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

소아 소원형 청색 세포 종양(PSRBCT)은 흥미롭고 도전적인 신생물 모음입니다. 작은 둥근 청색 세포 종양에 대한 광학 현미경은 작은 둥근 세포를 식별합니다. 그들은 일반적으로 hyperchromatic nucleus와 상대적으로 부족한 호염기성 세포질을 가지고 있습니다. 소아 소원형 청색 세포 종양에는 여러 개체가 포함됩니다. 일반적으로 윌름스 종양, 신경모세포종, 횡문근 육종, 유잉 육종, 망막모세포종, 림프종, 소세포 골육종 등이 있습니다. 면역조직화학을 사용하더라도 이러한 신생물의 감별 진단은 광학 현미경에서 논란의 여지가 있을 수 있습니다. 희미한 염색이나 모호한 배경은 병리학자가 적절한 진단 결정을 내리는 데 방해가 될 수 있습니다. 또한 분자 생물학은 이를 구별하기 어려운 압도적인 양의 데이터를 제공할 수 있으며 일부 전좌는 둘 이상의 범주에서 볼 수 있습니다. 따라서 투과 전자 현미경(TEM)은 매우 중요할 수 있습니다. 여기서 우리는 신경모세포종의 TEM 데이터에 대한 최신 프로토콜을 강조합니다. 신경분비 과립을 포함하는 세포질 돌기가 엉킨 종양 세포는 신경모세포종을 진단할 수 있습니다.

병리학자의 작업은 임상 진단과 연구 분야 모두에서 매우 어려울 수 있습니다. 18^세기와 19^세기에 광학 현미경의 진화는 주목할 만했습니다. 전자 현미경의 힘^{은 주로 빛의 1,2,3}보다 짧은 전자의 파장에 의존합니다. 다클론 및 단클론 항체의 출현과 면역조직화학에 적용되기 전에 TEM은 작고 둥근 청색 세포 종양을 진단하는 데 영향력 있는 역할을 했습니다.

지난 세기의 90년대를 시작으로 면역조직화학적 접근법은 진단⁴에서 형태학적 도구를 대체했습니다. 현재 작은 둥근 청색 세포 종양 그룹 ^4,6,7,8의 항원으로 향하는 수천 개의 새로운 다클론 및 단클론 항체가 있습니다. 20세기의 마지막 10년과 21세기 초반의 첫 10년 동안, 게놈 프로브에서 차세대 염기서열분석에 이르기까지 형광 제자리 교잡법을 포함한 분자생물학은 여러 실험실에서 면역조직화학의 중요한 응용 역할을 대체한 것으로 보입니다⁴. 미국 식품의약국(FDA), 캐나다 식품검사청(CFIA), 환경보호국(EPA) 또는 기타 국가의 유사한 정부 기관이 분자생물학 프로토콜⁹을 항상 승인하는 것은 아니다. 치료 목적으로 사용될 수 있는 병리학 보고서에 삽입하는 것은 매우 어려운 많은 정보인 것으로 보이며, 충분한 자금이 지원되고 운영되는 실험실 정보 시스템의 oculate 선택은 매우 중요합니다¹⁰. 한편, 면역조직화학(immunohistochemistry)은 상피 종양이 중간엽 마커(mesenchymal marker)를 나타내고 그 반대의 경우도 마찬가지인 등 수많은 함정을 밝혀냈습니다¹¹. 상피-중간엽 전이는 병리학 그룹^12,13의 일부 경계를 혼동했습니다. 지난 몇 년 동안 전자 현미경이 전 세계 여러 실험실에서 번창했다는 것이 분명해졌습니다¹⁴. 특히, 조직 표본의 처리 시간은 단클론 또는 다클론 항체로 염색에 접근하는 여러 프로토콜을 사용하여 몇 주에서 단 3일 또는 그 이하로 단축되었습니다 ^4,10.

또한 전자 현미경에 연결된 전자 카메라를 적용하면 병리학자에게 다양한 운영 체제에서 다용도로 사용할 수 있는 빠른 이미지를 제공하는 데 도움이 되었습니다. 마지막으로, 일부 항체는 항원 채취 후에도 괴사 또는 자가포식/허혈 관련 변화의 일부 영역에서 밝혀지기 어렵습니다. 동시에 안전한 손에 전자 현미경을 투여하면 알려지지 않은 병리학적 종양을 올바르게 분류할 수 있는 우수한 결과와 힌트를 제공할 수 있습니다¹⁵.

소아 소원형 청색 세포 종양 그룹에는 주로 신경모세포종, 윌름스 종양 또는 신모세포종, 횡문근육 육종 및 유잉 육종 등 여러 종양이 포함됩니다. 소아 그룹과 관련된 작고 둥근 청색 세포 종양과 관련된 분자 생물학 데이터는 적용된 기술로 인해 압도적일 수 있습니다. 작고 둥근 파란색 세포는 일상적인 염색(헤마톡실린 및 에오신 염색)에서 크게 다르지 않을 수 있으며 일부 종양은 비정상적인 면역표현형 특징을 가질 수 있습니다. TEM의 발견 이후 분자 생물학의 발전은 엄청났습니다. 작고 둥근 청색 세포 종양 그룹에서 일부 신생물은 다른 종양보다 더 자주 발생할 수 있지만 고려해야 합니다. 유두 신세포암종(papillary renal cell carcinoma)은 본질적으로 작은 원형 청색 세포 종양이 아니며 대부분 유두를 특징으로 하지만, 몇 가지 보조 기술을 사용하여 잘 알려진 다른 작은 원형 청색 세포 종양(예: Wilms 종양)과 구별해야 할 수 있는 일부 원형 세포 영역을 보일 수 있습니다¹⁶. 궁극적으로, 후신기질 종양(metanephric stromal tumors)도 감별 진단(differential diagnosis)에 포함시켜야 할 수도 있다¹⁷. 횡문근종양(rhabdoid tumor)은 특히 악성 소아 종양으로, 신장 및 신장 외 아형(subtype¹⁸)에서 뚜렷이 구별된다.

신경모세포종은 유아기와 아동기에 가장 흔한 고형 악성 종양 중 하나입니다. 신경모세포종 세포(neuroblastoma cell)는 이 고형 종양의 악성 세포로, 원시 신경능선(primordial neural crest)의 유도체에서 은밀하게 발생합니다. 진단 및 감별 진단이 어려울 수 있습니다. 이곳의 자연 생물학은 지난 수십 년 동안 괄목할 만한 발전을 이뤘습니다. 전사 인자의 포크헤드 계열은 뚜렷한 "포크헤드" 영역(FOXO3/FKHRL1)을 특징으로 합니다. 이러한 전사 인자는 세포 사멸에 필요한 유전자의 발현을 통해 세포사멸(프로그래밍된 세포 사멸)을 유발하는 역할을 합니다. FOXO3/FKHRL1은 5-aza-2-deoxycytidine에 의해 활성화되고 침묵된 caspase-8을 유도하며, 이 복합체는 신경모세포종에서 중요한 역할을 합니다. 핵 FOXO3는 신경모세포종에서 불리한 임상 결과를 예측하고 종양 혈관 신생을 촉진합니다 ^7,19. 분자 병리학의 발전에도 불구하고 Shimada 분류는 모든 병리학자 및 소아 종양 전문의의 진료 표준으로 남아 있습니다. 유리한 조직학과 불리한 조직학을 구별하는 데 중요하다 20,21,22,23.

신경모세포종이 의심되는 종양의 전자 현미경을 위한 간단한 프로토콜을 개발하는 근거는 조직 표본의 초미세 구조 검사의 타당성 및 견고성과 관련이 있습니다. 면역조직화학을 사용하여 일반적으로 발생하는 문제에 의해 거의 변경되지 않습니다. 이 이론적 근거와 프로토콜은 소아 병리학 및 전자 현미경 검사에 대한 여러 교과서와 과학적 기여의 기초가 되었습니다 ^4,24,25. 이 프로토콜은 저자의 30년 간의 경험을 아우르며 개인적인 경험과 문헌 검토를 강조하면서 몇 가지 PSRBCT에 초점을 맞출 것입니다.

인간 참가자를 대상으로 한 연구에서 수행된 모든 절차는 기관 및/또는 국가 연구 위원회의 윤리 기준과 1964년 헬싱키 선언 및 그 이후의 수정 또는 이에 상응하는 윤리 기준을 따랐다. 전자 현미경 검사는 진단 목적으로 받은 샘플의 현미경 검사를 위한 정상적인 루틴의 일부이며 생명윤리위원회의 승인이 필요하지 않습니다. 이 연구는 후향적이며 샘플의 완전한 익명성을 존중합니다.

1. FFPE(포르말린 고정 및 파라핀 내장) 회수 및 글루타르알데히드 고정 조직 표본을 위한 TEM 프로토콜

1. 마지막 헤마톡실린 및 에오신 염색 슬라이드와 FFPE 조직 블록을 검색합니다.
2. 영구 마커를 사용하여 조직 슬라이드에서 관심 영역을 선택하고 조직 블록의 영역과 일치시킵니다.
3. 블록에서 새 면도날로 선택한 영역을 잘라내고 여과지에 5mm 입방체로 정확하게 자릅니다.
4. 검색된 조직이 있는 여과지를 라벨이 붙은 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 60-70 °C 오븐에 15 분 동안, 즉 파라핀이 녹을 때까지 (파라핀 왁스는 48 ° C-66 ° C (120 - 150 ° F)의 융점 범위의 고체 직쇄 탄화수소의 혼합물로 구성됨) 여과지에 흡수됩니다.
5. 파라핀이 없는 채취한 조직을 100% 톨루엔(메틸벤젠) v/v 4mL[100% 톨루엔은 톨루엔 100mL를 의미함]로 채워진 섬광 바이알에 옮깁니다. 샘플이 파라핀화 제거 공정(회전 속도: 24회전/분)을 통해 계속 회전하는지 확인합니다.
6. 각진 회전 장치를 사용하여 톨루엔을 각각 1시간씩 2회, 100% 톨루엔 4mL를 각각 30분 동안 한 번 변경합니다.
7. 100% 앱솔루트 에탄올 4mL(C₂H₅OH)를 1시간 동안 1회 변경한 다음 100% 앱솔루트 에탄올 4mL를 각각 30분 동안 두 번 변경합니다. 그런 다음 70% 에탄올 4mL에서 30분 동안 또 다른 변화를 줍니다.
8. 4mL의 0.1M 카코딜산 나트륨 완충액을 1회 교체하여 30분 동안 진행합니다. 2.5% 글루타르알데히드 4mL에 검체를 옮기고 처리할 때까지 4°C를 유지합니다.
9. 자동 조직 처리기에서 다음 단계를 사용하여 공정을 표준화하십시오: 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액 5분, 2% 오스뮴 테트록사이드(1시간 및 50분), dH_2O(5분), 50% 에탄올 15분, 70% 에탄올 30분, 100% 에탄올 15분(3회), 100% 에탄올 30분(3회), 100% 에탄올 45분, 아세톤 50분, 수지 1시간(2회), 신선한 수지를 하룻밤 동안 사용합니다. 모든 용액의 부피는 15mL입니다.
10. 티슈 프로세서에서 바로 꺼낸 새 수지를 끼워 넣습니다.
    1. 폴리에틸렌 캡슐을 번호가 매겨진 종이 조각이 있는 홀더에 놓습니다. 캡슐에 새 수지를 떨어뜨리고 표본을 적절한 블록으로 옮긴 다음 블록을 60°C(140°F) 오븐에서 밤새 보관합니다.
11. 핫 플레이트에 500% 톨루이딘 블루가 있는 반박형(1nm) 부분을 염색하고 최소 열 설정을 30초 동안 하고 dH_2O로 헹군 다음 커버슬립을 놓습니다.
12. 여기서 Ultracut 마이크로톰(UCM)은 반박형 절편을 절단하는 데 사용됩니다.
    1. 수지가 내장된 블록을 UCM의 블록 홀더에 설치합니다. 그런 다음 UCM의 스테이지에 블록 홀더를 설치하고 조입니다.
    2. 접안렌즈를 사용하여 단일 가장자리로 코팅된 면도날을 사용하여 샘플 주변의 과도한 수지를 자릅니다. 블록의 면을 사다리꼴 모양으로 자릅니다.
    3. 스테이지에서 블록 홀더를 제거하고 UCM 암에 단단히 고정합니다. 그런 다음 UCM 스테이지에 블레이드 홀더를 설치합니다. 마지막으로 칼날 홀더에 유리 칼을 조입니다.
    4. 접안렌즈와 UCM에서 제공하는 빛을 사용하여 유리 나이프의 가장자리를 절단할 수지 블록의 표면에 최대한 가깝게 천천히 밉니다. 스테이지에서 칼날 홀더를 제자리에 조입니다.
    5. UCM의 절단 두께를 500nm로 설정하고 75% 전면이 될 때까지 수지 블록을 자릅니다.
    6. 유리 칼을 새 것으로 교체하십시오. 유리 나이프의 저장통에 멸균수를 추가합니다.
    7. 현미경 슬라이드에 케이스 번호를 적고 유리 슬라이드에 멸균수 4방울을 떨어뜨립니다.
    8. 여전히 500nm 설정에서 블록에서 4개의 섹션을 자릅니다. 가는 집게를 사용하여 유리 슬라이드의 물방울 중 하나에 한 번에 1 섹션씩 옮깁니다. 슬라이드의 각 드롭에는 하나의 섹션이 포함됩니다. 가장 낮은 열 설정에서 건조될 때까지(30초) 핫 플레이트의 슬라이드를 건조시킵니다.
13. 톨루이딘 블루 방식으로 염색합니다. 물로 헹구고 커버슬립을 놓습니다. 광학 현미경으로 톨루이딘 블루 단면을 검사합니다. 원하는 조직 구조가 보이면 초박형 부분을 자릅니다. 원하는 조직 구조가 보이지 않으면 더 깊은 부분을 자르고 원하는 구조가 노출되어 톨루이딘 블루 슬라이드에 표시될 때까지 동일한 단계를 사용하여 염색합니다.
14. toluidine blue 섹션에서 전자 현미경을 위한 원하는 영역이 확인되면 구리 그리드의 초박형 부분을 자릅니다. 초박 절편을 사용하여 초박막 절편을 절단합니다(TEM에서 볼 수 있는 샘플은 매우 얇은 절편(80nm)으로 절단해야 함).
    1. 수지가 내장된 블록을 UCM의 블록 홀더에 설치합니다. 그런 다음 UCM의 스테이지에 블록 홀더를 설치하고 조입니다.
    2. 접안렌즈를 사용하여 단면 코팅된 면도날을 사용하여 전자 현미경을 위해 원하는 부위 주위의 수지를 자릅니다. 블록의 면을 1mm 정사각형보다 크지 않은 공중그네 모양으로 자릅니다. 빛의 눈부심으로 인해 전자 현미경을 위해 원하는 영역을 보기 어려운 경우 클로로포름을 약간 사용하여 수지 블록의 구조를 강조 표시합니다.
    3. 스테이지에서 블록 홀더를 제거하고 UCM 암에 단단히 고정합니다. 그런 다음 UCM 스테이지에 블레이드 홀더를 설치합니다. 마지막으로 블레이드 홀더에 다이아몬드 나이프를 조입니다.
    4. 접안렌즈와 UCM에서 제공하는 빛을 사용하여 다이아몬드 나이프의 가장자리를 절단할 수지 블록의 표면에 최대한 가깝게 천천히 밉니다. 스테이지에서 칼날 홀더를 제자리에 조입니다.
    5. UCM의 나사를 사용하여 다이아몬드 나이프의 다양한 각도를 조정하십시오. 다이아몬드 나이프의 가장자리가 절단할 블록의 표면과 가능한 한 완벽하게 정렬되었는지 확인하십시오. 다이아몬드 나이프의 물통을 멸균수로 채웁니다.
    6. UCM을 80nm 두께와 1mm/s 속도로 설정합니다. 여기서 자동화 기능은 초박형 절편에 사용됩니다. UCM(블록 면의 상단 및 하단)에서 절단 창을 설정합니다.
    7. UCM의 시작 버튼을 눌러 단면화를 시작합니다. 섹션은 다이아몬드 나이프의 멸균 저장소에 떠 있습니다.
    8. 충분한 단면이 절단되면 클로로포름 연기를 사용하여 단면을 곧게 펴십시오. 면봉을 클로로포름에 담그고 건드리지 않고 섹션 위로 통과시킵니다.
15. 구리 그리드를 100% 알코올에 담근 다음 미세한 집게를 사용하여 멸균 물을 만듭니다. 사용하기 전에 각 그리드를 청소하십시오. 몇 개의 그리드에서 단면을 선택합니다.
16. 레이블이 지정된 여과지에 섹션이 있는 그리드를 그대로 둡니다. 이 여과지를 페트리 접시에 넣고 60°C 오븐에 30분 동안 넣어 그리드에서 섹션이 건조되도록 합니다.
17. 그런 다음 대비 염색을 수행합니다.
    1. 그리드를 우라닐 아세테이트 또는 환경 친화적 인 대안으로 1 분 동안 염색합니다. 그런 다음 주사를 위해 멸균수로 헹굽니다(우라닐 아세테이트와 구연산납 후 헹굴 때마다 4개의 다른 물통에 40회 담그기). 납 구연산염 단계도 1 분입니다.
18. TEM에 그리드를 삽입하여 고전압 전자빔이 음극에 의해 방출되고 자기 렌즈에 의해 생성되도록 합니다. 얇은(전자 반투명) 표본을 통해 부분적으로 투과된 빔은 화면에 TEM 정보를 형성합니다(아래 참조).

2. 표본을 스캔하고 사진을 찍기 위한 TEM 프로토콜

1. 그리드의 단면을 염색한 후 전자 현미경으로 스크리닝합니다. 전자 현미경에서 ACC 전압을 사용하는 전자 현미경에 따라 미리 설정된 설정(200-300kV)으로 켭니다.
2. 컴퓨터에서 디지털 카메라 소프트웨어를 켜고 케이스 번호를 입력합니다. 이것은 현미경 사진이 해당 케이스 파일에 저장되기 때문에 중요합니다.
3. 전자 현미경에 그리드를 로드하고 건 샘플을 반쯤 당겨 빼낸 다음 스위치를 AIR 로 전환하여 표본 건 챔버의 진공이 주변(방) 공기로 채워지도록 합니다.
4. 공기가 가득 차면 총 샘플을 꺼냅니다. 총 s를 놓습니다.amp설계된 홀더에 le. 그런 다음 건 끝에 있는 그리드 홀더를 뒤집어 엽니다.
5. 그리드를 제자리에 배치합니다. 그리드 홀더를 닫고 그리드가 고정되어 있는지 확인합니다.
6. 건 샘플을 시료 챔버에 반쯤 다시 넣고 스위치를 VAC 로 전환하여 시료 챔버에 진공을 만듭니다.
7. 녹색 표시등은 시편 챔버에서 진공이 달성되면 켜집니다. 그런 다음 건 샘플을 전자 현미경 컬럼에 조심스럽게 밀어 넣고 너무 빨리 진행되지 않도록 합니다. 그렇지 않으면 총 샘플의 끝에 있는 물체가 손상될 수 있습니다.
8. 그리드가 전자 현미경 컬럼에 잘 배치되면 필라멘트를 중간(사전 설정된) 포화 설정으로 켭니다.
9. ON/OFF 스위치를 통해 카메라를 켭니다. 컴퓨터의 이미징 소프트웨어에서 Live Image를 클릭합니다.
10. 전자 현미경에서 저배율 버튼을 누르고 대물렌즈 조리개를 엽니다. 이를 통해 원하는 스크리닝 영역을 선택할 수 있습니다. 다음으로, 전자 현미경 기둥의 양쪽에 있는 두 개의 컨트롤러를 사용하여 섹션의 원하는 영역을 컴퓨터 화면의 중앙에 배치합니다.
11. 전자 현미경에서 줌 버튼을 누르고 대물렌즈 조리개를 닫으면 더 나은 대비를 얻을 수 있습니다.
12. 2,500배 배율로 현미경 사진을 촬영하여 섹션 상영을 시작합니다. 그런 다음 전자 현미경의 워블러 버튼과 밝기 버튼을 사용하여 초점을 조정하여 현미경 사진의 품질을 확인합니다.
13. 컴퓨터에서 최종 이미지를 클릭하여 현미경 사진을 촬영합니다. 색상이 균일하지 않으면 카메라 소프트웨어에서 배경 보정을 수행합니다. 또한 현미경 사진을 저장하기 전에 소프트웨어를 사용하여 최종 이미지의 대비를 조정하십시오.
14. 현미경 사진을 저장할 때 케이스 번호와 배율을 다시 확인하여 촬영된 현미경 사진이 제대로 식별될 수 있도록 하십시오.
    참고: 경우에 따라 사용자는 추가 캡션을 입력할 수도 있으며 전자 현미경 기술자의 이니셜도 입력됩니다.
15. 스크리닝할 섹션의 전체 영역을 통해 현미경 사진 프로세스를 수행합니다. 충분한 2,500배 배율 후 관심 영역을 커버하기 위해 현미경 사진을 저장하고 4,000배 및 8,000배 배율 현미경 사진을 캡처한 다음 적절한 케이스 번호 ID와 함께 컴퓨터에 저장합니다.
16. 매우 구체적인 스크리닝 지침이 제공되는 경우 특정 초구조적 세부 사항에 대한 섹션을 클로즈업하십시오. 그런 다음 필요한 경우 더 높은 배율을 고려하여 특정 초구조 세부 사항의 측정값을 컴퓨터에 저장합니다.
17. 표본 스크리닝이 완료되면 필라멘트, 카메라, 고전압, 카메라 소프트웨어를 차례로 끕니다. 다음으로, 전자 현미경 컬럼에서 그리드를 제거하여 건 샘플 챔버에 공기를 허용합니다.
18. 젤라틴 캡슐에 그리드를 정리하고 캡슐을 동일한 케이스의 수지 블록과 함께 적절하게 라벨이 붙은 상자에 보관하십시오. 총 샘플을 총 챔버에 다시 넣고 사용된 재료를 보존하기 위해 서늘하고 건조한 환경에 보관하십시오.
19. 디지털 현미경 사진을 일반적인 협업 플랫폼(예: SharePoint) 또는 내부 서버로 전송하여 병리학자가 볼 수 있도록 합니다.
20. LIS(Laboratory Information System)에 작업 단위를 입력합니다.
21. 보다 구체적인 현미경 사진이 필요한 경우 필드 그리드를 꺼내 추가 스크리닝 또는 특정 질문에 재사용할 수 있습니다.

신경모세포종의 독특한 TEM 특징이 여기에 표시됩니다. 여기에서는 신경모세포종의 독특한 TEM 특징을 설명하겠습니다.

신경모세포종은 유아기와 아동기에 가장 흔한 고형 악성 종양 중 하나입니다. 신경모세포종 세포(neuroblastoma cell)는 이 고형 종양의 악성 세포로, 원시 신경능선(primordial neural crest)의 유도체에서 은밀하게 발생합니다. 이 조직 형성은 이 청색 종양의 일부 생화학적, 형태학적 특성을 설명합니다. 그러나 신경모세포종의 결정론적 세포병리학적 특징과 조직병리학적 특징은 분화의 가변적인 정도에 따라 특이적으로 변동될 수 있습니다. 따라서 진단 및 감별 진단이 어려울 수 있습니다. 신경모세포종과 신경절 세포 유사 요소의 구별은 세포질 과정의 발달과 핵 이미지의 변경에 따라 세포 세포질의 양이 증가함에 따라 나타납니다(그림 1A-D). 핵 비대와 눈에 보이는 핵소체(nucleolus)는 신경모세포종 분화의 특징입니다. 슈반(Schwann) 세포와 같은 요소로의 분화도 관찰될 수 있습니다. 전자 현미경 조사는 미세소관과 얇은 중간 필라멘트를 포함하는 중성석과 같은 세포질 돌기의 유무에 관계없이 신경 분비 과립(평균 직경 100nm)이 지속적으로 존재함을 보여줍니다²⁶. 글리코겐의 부족은 신경모세포종의 특징이며, 드물게 볼 수 있는 경우 응집체를 형성하지 않습니다. 분화의 정도는 신경모세포종의 미세구조를 구별합니다. 신경 분비 또는 카테콜아민 과립은 직경이 약 150nm인 이 신생물의 특징입니다. 신경 분비 과립은 데스모솜과 같은 구조와 구별되어야 합니다. 신경분비 과립은 세포질 내 필라멘트(neurofilaments) 근처에서 볼 수 있습니다. 세포 돌기는 종종 통통하고 원통형이며 일반적으로 신경돌기(축삭돌기 및 수상돌기)라고 합니다. 일부 세포 돌기에는 미토콘드리아가 포함되어 있는데, 이는 종양 세포의 움직임에 매우 중요합니다. 신경돌림은 미세소관을 포함하고 있지만 미토콘드리아가 부풀어 오를 수도 있습니다. 잘 분화되지 않은 신경모세포종의 경우, 일부 특징이 더 자주 발견됩니다. 여기에는 핵 형태의 더 심각한 불규칙성, 수많은 유사분열 및 자가사멸 수치, 미세소관 및 세포 돌기의 부족, 거의 일정한 신경 필라멘트의 존재와 대조를 이루는 미세소관의 부족, 미세소관보다 미토콘드리아를 더 자주 포함하는 신경돌기의 부족, 시냅스 접합부가 없거나 매우 적고, 글리코겐이 없으며, 수많은 폴리리보솜 영역, 신경 분비 과립의 부족이 포함됩니다. 신경분비 과립은 신경모세포종을 배아 횡문근 육종, 호산구성 육아종, 소세포 골육종, 망상 세포 육종을 포함한 다른 PSRBCT와 구별하는 데 중요하며, 이는 세포질 입도의 존재로 인해 진단에 어려움을 일으킬 수 있습니다.

그림 1: 신경모세포종의 TEM.(A-C) 핵 대 세포질 비율이 높고 소기관이 적은, 잘 분화되지 않은 유형의 신경모세포종 세포. 염색질은 핵에 흩어져 있지만 핵막에 가까운 주변부에도 집중되어 있습니다. nucleolus는 오른쪽 상단 모서리의 핵에서 볼 수 있습니다(눈금 막대: 2μm). (D) 특징적인 이중막(스케일 바: 200nm)을 나타내는 신경분비 과립을 가진 신경모세포종 세포. 빨간색 화살표는 핵을 가리키고, 파란색 화살표는 이염색질을, 주황색 화살표는 유크로마틴을, 녹색 화살표는 미토콘드리아를, 노란색 화살표는 정상적인 시냅스전 말단을 닮은 소포를 가리킵니다. 그러나 신경모세포종의 소포는 고전적인 시냅스전 말단보다 더 크고 불규칙합니다. 마지막으로, 검은색 화살표는 수많은 조밀한 코어 신경 분비 과립을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

관련 프로토콜과 함께 이 서술적 검토에서 우리는 신경모세포종의 독특한 초구조적 특징을 강조했습니다. 결국, 우리는 전자 현미경이 "죽은" 기술이나 고대 기술과는 거리가 멀다고 제안하며, 단일 세포 오믹스 기술과 결합될 경우 새로운 역할의 발견을 가정합니다. 이 논문은 소아 병리학에서 전자 현미경의 고대 역할이 결코 오래되지 않았다는 점을 강조하고자 한다 ^4,27. 중요한 단계, 기술의 수정 및 문제 해결, 제한 사항은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 전자 현미경을 위해 원하는 영역을 절단하는 것이 필수적입니다. 다이아몬드의 가장자리는 블록의 면을 향하도록 가능한 한 가깝게 조정해야 합니다. 이를 위해서는 매우 꾸준한 손이 필요합니다. 구리 그리드가 있는 플로팅 섹션을 집는 동안 주의해야 합니다.

이 기술의 수정 및 문제 해결에는 고려해야 할 몇 가지 측면이 포함됩니다. 모든 샘플은 밀도와 자연과 같은 품질에 따라 다르며 이는 가변적입니다. 재료의 특성과 밀도를 감안할 때 모든 조직 표본이 동일한 방식으로 절단되는 것은 아닙니다. 예를 들어, 일부 신경모세포종 표본은 분화가 없거나 제대로 분화되지 않을 수 있는 반면, 다른 표본은 높은 수준의 분화와 다양한 정도의 석회화를 나타낼 수 있습니다. 때로는 몇 가지 좋은 섹션을 추가로 처리하기 위해 여러 섹션을 잘라내야 합니다. 모든 종류의 진동을 피하는 것이 중요합니다 : 호흡, 테이블, EM 범위의 압축기. 섹션에서 부서지는 부분이 발견되면 UCM 나사를 조이는 것이 중요할 수 있습니다. 단면에 흠집이 보이면 절단에 사용할 다이아몬드 나이프를 교체하십시오. 때로는 절단 아티팩트가 마지막 단계에서만 볼 수 있습니다. 전자 현미경에서 절단 인공물이 감지되면 인공물의 원인을 파악한 후 초박형 부분을 다시 절단해야 합니다.

TEM에는 명백한 한계가 있으며 관찰 창은 기존 광학 현미경을 사용하여 캡처한 시야보다 훨씬 작습니다. 전자 현미경을 위해 원하는 면적은 1mm 정사각형보다 클 수 없습니다. 때로는 더 넓은 영역이 스크리닝에 도움이 될 수 있지만 절단하는 것은 불가능합니다. 그것은 구리 그리드에 맞지 않을 것이고, 다이아몬드 나이프를 손상시킬 것이며, 섹션의 품질은 확실히 열등할 것입니다. 몇 가지 선택을 해야 하며, 상영 시 가장 중요한 구조 또는 영역을 선택해야 합니다. 절삭 속도를 높일 수 없습니다. 섹션에 절단 아티팩트가 발생합니다. 1mm/sec는 여전히 중요합니다.

위에 열거된 고전적인 특징(예: 신경분비 과립) 외에도, TEM에 의해 조사된 신경모세포종 세포에서 미토콘드리아의 미토콘드리아의 미세구조는 종종 세포에 의해 손상되거나 불필요한 것으로 간주되는 미토콘드리아의 분해를 가능하게 하는 미토콘드리아 품질 관리 선택적 세포 메커니즘인 미토파지(mitophagy)의 현저한 수준을 보여줍니다 ^28,29. 그 결과, 미토콘드리아는 팽창, 크리스테 파열, 크리스테 소실을 품고 있습니다. 실제로, Radogna 등은 인슐린 유사 성장 인자 II(IFG-II) 및 IGF-II RNA의 합성이 강화되고 심장 스테로이드 배당체 계열에 속하는 헤미 합성 카르데놀라이드인 UNBS1450에 대한 I형 IGF 수용체를 보유하는 신경모세포종 세포주인 SK-N-AS의 내성을 증가시키는 프로그램적 세포 사멸 경로의 활성화 실패로 이어지는 중요한 메커니즘으로 효율적인 미토파지를 발견했습니다. 다소 높은 용량으로 괴사를 유발³⁰.

감별 진단과 특히 관련이 있는 것은 유잉 육종에 대한 TEM의 역할입니다. 유잉 육종은 말초 신경외배엽 세포 종양과 동일한 것으로 간주되지만, 과거에 약간의 논쟁이 있었지만 ^31,32,33. 실제로, 유잉 육종 원시 세포에서는 풍부한 세포질 글리코겐, 제대로 발달하지 않은 세포 접합부, 신경 특징이 없는 것이 주요 특징입니다. 말초 신경외배엽 종양은 전자 현미경에서 유잉 육종(Ewing sarcoma)과 현저한 유사성을 가지고 있습니다. 실제로, 두 종양은 동일한 염색체 전좌를 공유하기 때문에 SIOP(International Society of Pediatric Oncology)와 COG(Children's Oncology Group) 및 UKCCSG(United Kingdom Children Cancer Study Group)에서 동일한 개체로 간주되며 동일한 치료 프로토콜로 치료됩니다. 그러나 PNET에는 유잉 육종에는 거의 없는 신경 분비 과립을 포함하여 일부 신경 기능이 존재합니다. 이 사양은 또한 면역조직화학적 표현형을 반영합니다. 적어도 하나 또는 두 개의 신경 마커(예: 뉴런 특이적 에놀라제, S-100, 시냅토피신 또는 뉴로필라멘트)에 대한 양성이 있습니다. Franchi 등은 ES-PNET³¹을 연구했습니다. 대부분의 경우, 종양 세포는 단단히 포장되어 있고 분화가 잘 되지 않은 세포, 타원형에서 다각형 모양을 포함하는 전형적인 초미세 구조를 가지고 있었습니다. 이 세포는 미세하게 분산된 염색질과 하나 또는 두 개의 핵을 가진 원형 또는 타원형 핵을 포함합니다. 세포질(cytoplasm)에서는 이러한 종양 세포의 불량한 분화를 반영하는 작은 소기관이 있습니다. 그러나 세부 사항에 세심한 주의를 기울이면 미토콘드리아, 몇 가지 거친 소포체 구조(소위 수조), 산발적인 리소좀 및 유리 리보솜의 존재를 드러낼 수 있습니다. 글리코겐 축적은 쉽게 검출될 수 있습니다. 글리코겐은 분산되거나 풀링된 것으로 볼 수 있습니다. 중간 필라멘트는 종양 세포의 세포질과 세포질 과정 모두에서 종종 관찰됩니다. 미세소관은 보이지 않습니다. 기초적인 접합은 세포 연결에 관한 사례의 약 절반에서 감지될 수 있습니다. 이러한 구조는 접합부가 식별되면 토노필라멘트가 있는 잘 발달된 데스모솜으로 만들어집니다. 세포외 기질에 기저막과 같은 물질과 콜라겐 원섬유가 일부 축적되는 것을 인식할 수 있습니다. 신경모세포종에서 볼 수 있는 과립과 유사한 직경을 가진 조밀한 코어 과립이 관찰될 수 있습니다. 이전 저자³¹의 면역조직화학 연구와 마찬가지로, 잘 분화된 신생물은 골격 밖에서 발생하는 경향이 있는 반면, 제대로 분화되지 않은 종양은 연조직보다 뼈에서 더 자주 발생합니다.

결론적으로 TEM은 미래에 엄청난 잠재력을 가질 수 있는 뛰어난 기술이며 의학 분야에서는 아직 죽지 않았습니다. 가장 최근에 발전한 차세대 염기서열분석과 함께 분자생물학 기법의 도입은 진단의 연속체가 모순되지만 캥거루와 같은 진보의 물결이 있음을 강조합니다. 새로운 방법을 도입한다고 해서 병리학자들이 전자 현미경을 일관되게 사용하는 것을 단념시켜서는 안 되는데, 이는 면역조직화학과 분자 기술 모두 오류가 있을 수 있기 때문입니다. 일부 면역조직화학적 패턴과 유전적 이상은 종양에 특이적이지 않으며 조직학과의 상관관계가 낮을 수 있습니다. 우리가 아는 한, TEM은 병리학 및 의학에서 견고하고 유효하며 재현 가능한 방법으로 남아 있습니다. TEM은 작고 둥근 청색 세포 종양을 조사하기 위한 보조 도구이며 면역조직화학적 결과에 대한 확실한 증거입니다. 현대적인 시설에서 TEM을 일관되게 적용하면 높은 개인 간 일치 점수, 높은 타당성 및 효율적인 신뢰성을 제공할 수 있습니다. 가까운 장래에 분자 생물학자들은 초구조 수준에서 특정 질문에 답할 수 있는 유능하고 유효한 전자 현미경 실험실을 찾을 수 있습니다. 특히, 우리는 현재의 일부 단세포 연구를 이해하는 것을 목표로 하는 실험과 TEM의 결합과 같은 분자 생물학에서 TEM의 새로운 관점과 적용을 보고 있습니다.

제1저자는 다음 출판사로부터 로열티를 받는다: Springer (https://link-springer-com.bdigitaluss.remotexs.co/book/10.1007/978-3-662-59169-7; ISBN: 978-3-662-59169-7) 및 노바(https://novapublishers.com/shop/science-culture-and-politics-despair-and-hopes-in-the-time-of-a-pandemic/; ISBN: 978-1-53619-816-4). 모든 로열티는 소아과 자선 단체에 기부됩니다.

우리는 전 앨버타 대학교 병원의 앨버타 보건 서비스 직원인 Richard Vriend 박사와 전 앨버타 대학교 병원의 앨버타 보건 서비스 직원인 Steven Joy(1972-2019)의 전문성과 관대한 지원에 감사를 표했습니다. 우리는 몇 년 전 비극적이고 일찍 세상을 떠난 초미세 구조 조사 분야의 선임 기술자인 Joy 씨를 기리기 위해 이 작업을 바칩니다. Joy 씨는 캐나다 앨버타에서 대부분의 전자 현미경 연구의 기둥이었습니다. 그와 그의 가족을 위한 우리의 생각과 기도. 우리는 또한 그녀의 도움과 조언에 대해 Ms. Lesley Burnet에게 빚을 지고 있습니다. C. Sergi 박사의 연구는 온타리오주 오타와주 이스턴 온타리오 아동 병원과 Stollery 아동 병원 재단의 관대함, 여성 및 아동 건강 연구소(WCHRI, 보조금 ID #: 2096), 후베이성 자연 과학 재단을 통한 여성 로이스 홀 병원 후원자들의 후원으로 이루어졌습니다. 감염 및 종양학을 위한 디지털 PCR 및 NGS 기반 진단, 2017-2022), Österreichische Krebshilfe Tyrol (Krebsgesellschaft Tirol, Austrian Tyrolean Cancer Research Institute, 2007 및 2009 - "DMBTI 및 담관세포 암종" 및 "췌장 암종의 Hsp70 및 HSPBP1"), 오스트리아 연구 기금 (Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, FWF, 보조금 ID L313-B13), 캐나다 여성 건강 재단 ("Early Fetal Heart-RES0000928"), 암 연구 학회(von Willebrand factor gene expression in cancer cells), 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes of Health Research, Omega-3 Fatty Acids for Treatment of Intestinal Failure Associated Liver Disease: A Translational Research Study, 2011-2014, CIHR 232514), 사우디 문화국(Saudi Cultural Bureau, Ottawa, Canada). 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.