Производство гуманизированных мышей путем трансплантации почечной капсулы тимуса, инъекции CD34⁺ клеток и доставки цитокинов

Гуманизированные модели мышей обеспечивают более точное представление иммунного микроокружения человека. В данной рукописи описывается процесс, в ходе которого эти модели создаются с помощью почечного трансплантата тимуса человека, инъекции клеток CD34⁺ человека и адресной доставки трансгенов цитокинов человека для стимулирования пролиферации и дифференцировки клеток CD34⁺ .

Животные модели обеспечивают жизненно важную трансляцию биомедицинских исследований in vitro и in vivo . Гуманизированные мышиные модели обеспечивают мост в представлении человеческих систем, тем самым позволяя более точно изучать патогенез, биомаркеры и многие другие научные запросы. В описанном методе мышам с иммунодефицитом NOD-scid IL2Rγnull (NSG) имплантируют аутологичный тимус, вводят CD34⁺ клетки, полученные из печени, с последующей серией инъекций цитокинов. В отличие от других моделей аналогичного рода, описанная здесь модель способствует улучшенному восстановлению иммунных клеток путем доставки цитокинов и факторов роста через трансгены, кодируемые в векторах на основе ДНК AAV8 или pMV101. Кроме того, он обеспечивает долгосрочную стабильность у восстановленных мышей, средняя продолжительность жизни которых после инъекций CD34⁺ составляет 30 недель. С помощью этой модели мы надеемся обеспечить стабильный и эффективный метод изучения иммунотерапии и болезней человека на мышиной модели, тем самым демонстрируя потребность в прогностических доклинических моделях.

В то время как животные модели позволили глубже понять клеточные и молекулярные системы, проблема остается в выяснении тонкостей видоспецифичных систем, таких как иммунитет, физиология и другие области патологии. Нечеловекообразные приматы (НЧП), такие как шимпанзе, исторически использовались для компенсации недостающих пробелов в модельных исследованиях; Тем не менее, модель NHP может быть довольно дорогостоящей и недоступной, особенно с учетом того, что их использование запрещено в Европе¹.

После успешной процедуры трансплантации мышиная система воспроизводит иммунную систему человека, что проявляется в повторном заселении лимфоидных органов. Развитие мышей с функциональной иммунной системой человека дает возможность проводить трансляционные исследования иммунитета человека в самых разных контекстах. Иммунодефицитные мыши, привитые человеческим клеткам и тканям^{, которые} могут успешно воспроизводить действующую иммунную систему человека, облегчают изучение кроветворения, иммунитета, генной^{терапии2}, инфекционных заболеваний³, рака4 и регенеративной^{медицины5}. Наша группа и некоторые из наших сотрудников опубликовали результаты с использованием этой модели, которые демонстрируют доклинические модели меланомы кожи⁶. Эта модель достаточно универсальна, чтобы ее можно было применять в бесчисленных областях за пределами исследований меланомы и иммунотерапии.

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) обычно используются для гуманизации, поскольку они приводят к надежному восстановлению Т-клеток, которые играют определенную роль в иммунной толерантности; однако из-за их низкой скорости самообновления и высокой скорости созревания клеток, зафиксированных в линии, PBMC часто заменяют продуктами на основе стволовых клеток человека (HSC), которые могут быть получены из печени плода⁷. В сочетании с этими производными продуктами ГСК, добавление имплантата человеческого тимуса под почечные капсулы мышей NSG создает систему, способную поддерживать развитие Т-клеток человека. Эта модель, известная как костный мозг-печень-тимус (BLT), очень выгодна, поскольку она позволяет осуществлять многолинейное кроветворение, образование Т-клеток в аутологичном тимусе и рестрикцию HLA.

Модель, предложенная в данной рукописи, представляет собой модифицированную модель BLT с дополнительной доставкой цитокинов. Было показано, что провоспалительные цитокины усиливают способности эффекторных иммунных клеток, в частности, с помощью иммунотерапии на основе IL-15⁹. CD45⁺ лимфоциты наблюдаются в периферической крови гуманизированных мышей (Hu-мышей) примерно через 8-12 недель после инъекции CD34⁺ клеток человека, демонстрируя очевидное увеличение восстановления по сравнению с циркулирующей кровью обычных мышей NSG. При использовании аденоассоциированного вектора для доставки человеческих IL-3, IL-7 и GM-CSF уровни CD45⁺ клеток человека в циркуляции увеличивались по сравнению с теми мышами, которые не получали цитокины. Добавление цитокинов DNA Combo II (SCF, FLT3, CKIT и THPO) улучшает дифференцировку Т-клеток и миелоидных клеток¹⁰. Добавление доставки цитокинов отличает этот метод от других моделей Hu-мышей, что подтверждается опубликованными данными¹⁰.

Разработка данной модели с врожденным и адаптивным иммунным ответом человека позволила опубликовать данные о резистентности к терапии и микроокружении^{опухоли10}. При условии, что лаборатории могут получить доступ к образцам тканей для использования этого метода; Эта модель Hu-mice имеет большой потенциал для изучения аналогичных областей другими лабораториями, а также для расширения в других областях иммунотерапии и доклинических исследований.

Все протоколы, связанные с использованием животных, тщательно контролируются Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Института Вистар. Лаборатория придерживается руководящих принципов, установленных этим комитетом и лечащим ветеринарным врачом для обеспечения здоровья, безопасности и благополучия животных. Прежде чем следовать этому протоколу, требуется одобрение ветеринара и IACUC, и у людей могут быть различия в конкретных хирургических методах и обращении с животными по сравнению с протоколом в соответствии с рекомендациями вышеупомянутых сторон, занимающихся благополучием животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы тканей можно замораживать до тех пор, пока они не будут готовы к использованию. Кроме того, выделение CD34⁺ может быть выполнено в тот же день или на следующий день после операции по пересадке почки. Эта информация поможет вам узнать, когда будет вводиться бусульфан: если вы планируете провести операцию в тот же день, что и изоляция, бусульфан следует вводить заранее для подготовки принимающей ткани. Обработайте тридцать самок мышей в возрасте 5-7 недель 30 мг/кг (100 мкл, PBS 1x) свежеприготовленного миелоразрушающего препарата; Бусульфан вводился внутрь за 24 ч до операции.

1. Выделение CD34⁺ клеток

1. Приготовьте раствор для пищеварения, растворив 100 мг коллагеназы/диспазы в 50 мл RPMI1640. Используйте вакуумный фильтр 0,22 мкм для стерилизации раствора для сбраживания.
2. Печень плода (возраст >20 недель) обеспечивается в 50 мл RPMI1640 среды. Отсадите и выбросьте среду, оставив 10 мл внутри трубки, содержащей печень.
3. Промойте салфетку 45 мл RPMI1640 + 100 мкг/мл антибиотика Примоцин дважды в конической пробирке объемом 50 мл, откачивая среду между каждым промыванием. Обязательно дайте ткани осесть на дно пробирки, прежде чем пылесосить фильтрующий материал.
4. Поместите стерильное сито для салфеток в стерильный стакан объемом 200 мл.
5. Пролейте фетальную печень через сито и с помощью конца стерильного пластикового шприца объемом 10 мл измельчите ткань.
6. Промойте оставшиеся в сите клетки печени с использованием 50 мл RPMI1640 + 100 мкг/мл антибиотика Примоцин, а затем 50 мл среды RPMI1640 коллагеназы/диспазы (2 мг/мл). Стакан объемом 200 мл теперь содержит RPMI1640 с примоцином, RPMI1640 коллагеназой/диспазой и гомогенизированной печенью.
7. Разложите смесь по четырем коническим пробиркам объемом 50 мл и инкубируйте их на водяной бане (37 °C) в течение 1 ч. Встряхивайте конические трубки каждые 15 минут.
8. Добавьте 15 мл Ficoll в четыре конические пробирки по 50 мл.
9. Сверху аккуратно выложите гомогенизированный раствор печени, распределив примерно по 35 мл между каждой пробиркой. Не беспокойте интерфейс.
10. Поместите пробирки в центрифугу и вращайте при давлении 800 x g в течение 1 часа с минимальным ускорением/торможением.
11. Извлеките пробирки из центрифуги и соберите ячейки с границы раздела (10-15 мл) в две конические пробирки по 50 мл.
12. Добавьте PBS 1x до 50 мл для промывки гранул и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут. Выбросьте надосадочную жидкость.
13. Ресуспендируйте гранулу в 10 мл буфера для лизиса ACK (хлорид аммония-калий) и инкубируйте в течение 5-10 минут. Наполните пробирку 1x PBS.
14. Вручную подсчитайте клетки под микроскопом с помощью трипанового синего и гемоцитометра. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 5 минут.
    Примечание: При желании мононуклеарные клетки печени могут быть введены непосредственно отсюда, например, если количество клеток меньше 50 миллионов.
15. Вакуумируйте PBS и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 300 μл разделительного буфера (2 мМ ЭДТА, 5 мкг/мл BSA в 1x PBS) для 100 x 10⁶ элементов или менее. Для более чем 100 x 10⁶ ячеек используйте соотношение, основанное на указанном выше количестве ячеек, чтобы определить объем буфера (т. е. двойное количество ячеек, двойное увеличение буфера).
16. Добавьте 100 μл реагента-блокатора FcR и инкубируйте 2-5 минут.
17. Добавьте 100 μл антител к микрогранулам CD34, хорошо перемешайте и инкубируйте на льду в течение 30 минут; Механически встряхнуть рукой через 15 минут.
18. Добавьте 7-10 мл разделительного буфера и профильтруйте через сетчатые фильтры 100 мкм, 70 мкм и 40 мкм в указанном порядке.
19. Поместите колоночный сепаратор ячеек в магнитный сепаратор. Поместите коническую трубку объемом 15 мл под сепаратор для сбора проточного и буферного раствора.
20. Заполните колонку 500 мкл разделительного буфера.
21. Вылейте клеточную суспензию через колонку.
22. Заполните колонну проточным и буферным раствором, собранным в конической трубе.
23. Промойте колонку 3 раза 500 мкл разделительного буфера.
24. Выбросьте проточный раствор и замените трубку на полистирольную трубку объемом 15 мл.
25. Заполните колонку 1 мл разделительного буфера, снимите колонку с магнита и промойте поршень одним нажатием.
26. Подсчитайте клетки и ресуспендируйте в 1x PBS для инъекции. Выложите на лед до использования.

2. Обработка тимуса

1. Промойте аутологичный тимус (возраст >20 недель), добавив 5-8 мл RPMI1640, дайте ткани осесть. Осторожно удалите среду с помощью вакуума, избегая контакта с вилочковой железой. Повторите это еще раз.
2. Суспензию в 10 мл комнатной температуры RPMI1640 с Примоцином (100 мкг/мл).
3. Перенесите вилочковую железу в обработанную тканью чашку Петри. Убедитесь, что тимус полностью покрыт примоцином.
4. Выдерживать 30-45 минут при комнатной температуре.
5. Откачайте примоцин от среды. Промойте вилочковую железу 5-8 мл RPMI1640, удалите фильтрующий материал с помощью вакуума и повторите это еще раз.
6. Суспензируйте вилочковую железу в 5-8 мл RPMI1640.
7. Подготовьте инкубированный тимус к прививке, нарезав сегменты размером 1 мм х 2 мм с помощью двух скальпелей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Он будет привит мышам; Поэтому убедитесь, что срезы тимуса можно относительно легко вакуумировать как внутрь, так и из шприца и прикрепленной иглы Гамильтона 22 G.

3. Субпочечная капсульная пластика и инъекция клеток CD34

1. Перед операцией осмотрите мышей на предмет их общего состояния здоровья. Побрейте мышей, чтобы обнажить область (примерно 3 x 2 дюйма) на левой боковой стороне тела.
2. Обезболить мышей с помощью изофлурана (индукция 5%, поддерживающая 2%-3%) в камере, а затем перевести отдельных мышей из камеры на хирургическую стадию с помощью носового конуса.
3. Продезинфицируйте выбритый участок с помощью хлоргексидина и спиртовых тампонов. Обеспечьте индивидуальную анестезию с помощью щипкового теста.
4. Сделайте большой разрез (5-7 мм) сзади, сбоку от позвоночника мыши, и загните кожу назад.
5. Убедитесь, что на этом этапе селезенка видна под фасцией. Сделайте меньший разрез ~2 мм в фасции. Убедитесь, что разрез был как можно меньше, при этом почка была полностью обнажена.
6. Определите расположение этого разреза, визуально определив селезенку и используя ее в качестве маркера для почки, которая не видна.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиная почка расположена за группой жировых отложений в северо-восточном квадранте селезенки.
7. Отсюда расположите руку (хирурга) под стороной мыши напротив разреза и надавите, чтобы обнажить почку. Переместите жир, чтобы полностью обнажить почку.
8. Используйте пальцы той же руки, чтобы стабилизировать обнаженную почку. При необходимости используйте стерильный 1x PBS для смазки оголенной почки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что хирург должен использовать пальцы, отличные от тех, которые работали со стороной мыши, чтобы удерживать почку для поддержания стерильности. Проконсультируйтесь с ветеринарным врачом института относительно правильного поддержания стерильности.
9. Одновременно дайте помощнику приготовить тупой шприц с тканью тимуса плода. Аккуратно отсосите 2-3 куска тимуса среднего размера (1 мм x 2 мм) с минимальным количеством среды к кончику иглы, а затем передайте их хирургу для выполнения процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество кусочков тимуса зависит от размера ткани, обычно достаточно 2 кусков, чтобы получить очеловеченных мышей.
10. Позвольте хирургу ввести иглу через каудальный конец капсулы почки до тех пор, пока не будет достигнут дистальный конец (~ 2 мм), до точки, где игла видна, но она не прорвется через краниальную сторону капсулы почки. Пусть помощник погрузит шприц.
11. Поместите почку вместе с обнаженным жиром обратно в брюшину. Наложите один рассасывающийся шов (размер 4) и закройте поверхностный разрез ветеринарным клеем.
12. После операции введите дозу обезболивающего препарата, 25 мкл бупренорфина с пролонгированным высвобождением (1 мг/мл) путем подкожного введения (1 мг/кг).
13. Убедитесь, что мыши начинают восстанавливаться в течение 5 минут после операции.
14. Между клетками меняйте перчатки и стерилизуйте инструменты в стерилизаторе со стеклянными шариками.
15. Через 1-3 ч после операции введите 100 мкл человеческих CD34⁺ клеток (примерно 100 000 клеток) мышке путем внутривенной (IV) инъекции.
16. Проведите общий осмотр состояния здоровья мышей после завершения операции (обычно через 2 часа после первой клетки), затем через 24 часа и 48 часов после нее.
17. Если есть какие-либо отклонения в характере или жизненно важных показателях, понаблюдайте за мышами дальше. Как только они пройдут эти контрольные точки, контролируйте мышей менее строго (2-3 раза в неделю).
18. Через неделю после операции введите мышам 100 мкл человеческого цитокина AAV8 (IL-3, IL-7 и GM-CSF; 2 x 10⁹ копий генома/мл).
19. Через две недели после операции проведите внутримышечное введение плазмидной ДНК Combo II.
    1. Используйте аппарат для электропорации для проведения внутримышечных инъекций плазмидной ДНК Combo II: SCF, FLT3, CKIT и THPO. Для каждой мыши смешайте 25 мкл SCF (2 мг/мл), 25 мкл THPO (2 мг/мл), 25 мкл FLT3 (2 мг/мл) и 25 мкл CKIT (10 мг/мл).
    2. Выполните одну инъекцию на заднюю ногу, т.е. всего две, по 50 мкл на каждую ногу, с последующей электропорацией в каждую точку инъекции.

После успешного хирургического вмешательства и соответствующих послеоперационных инъекций дифференцировка CD34⁺ может быть подтверждена с помощью проточной цитометрии. Примерно через 8 недель после операции мышам проводят обескровливание для подготовки к FACS, повторяющееся каждые 2 недели до тех пор, пока не будет достигнут определенный порог иммунных клеток человека, как описано ранее¹⁰. Вкратце, 100 мл крови собирали в пробирки для сбора крови, покрытые литием и гепарином. После лизиса эритроцитов с использованием буфера для лизиса ACK клетки промывали буфером FACS (фосфатно-солевой буфер, 2% FBS и 0,1% азид натрия) и центрифугировали. Затем клеточную гранулу ресуспендировали в 100 мл буфера FACS и инкубировали с панелью антител (антимышиный CD45, античеловеческий CD45, анти-CD3, анти-CD4, анти-CD8 и анти-CD20). Для идентификации живых и мертвых клеток клетки окрашивали DAPI, а лимфоциты стробировали на основе параметров FSC-A и SSC-A. Был сгенерирован вентиль для выбора живых клеток и из них отдельных клеток. Из этой популяции одиночных живых лимфоцитов мы сначала отличили человеческие CD45⁺ клетки от мышиных. CD20⁺ и CD3⁺ клетки были идентифицированы из CD45⁺ клеток человека, и, наконец, CD4⁺ и CD8⁺ клетки были идентифицированы из CD3⁺ клеток (Т-клеток). В частности, Hu-мыши готовы к использованию в экспериментах по иммунотерапии, когда они достигают порога в >25% HuCD45⁺ в общем количестве лимфоцитов и >8%-10% CD8⁺ в клетках CD3⁺ человека (рис. 1). На ранних стадиях восстановления уровни CD20⁺ высоки, а уровни CD3⁺ низкие. По мере того, как клетки со временем пролиферируют и восстанавливаются, уровень CD20⁺ снижается по мере повышения уровня CD3⁺ . Это коррелирует с тем, когда тимус мыши, селезенка мыши и пересаженный из почечной капсулы Hu-thymus повторно заселяются лимфоидными клетками-предшественниками человека, которые подвергаются дифференцировке.

Рисунок 1: Анализ проточной цитометрии восстановленной мыши. Анализ основан на выделении различных популяций клеток, начиная с общей популяции лимфоцитов, затем проводится различие между живыми клетками, одиночными клетками и различными популяциями стволовых клеток, при этом особое внимание уделяется CD45⁺ и CD8⁺ для установления близости к пороговым значениям, как сообщалось ранее¹⁰. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

В данной рукописи здесь описано получение гуманизированных мышей с помощью тимуса человеческого плода, пересаженного под почечную капсулу, и последующей инъекции CD34⁺ для воссоздания иммунной системы человека.

В то время как протокол функционирует для создания наилучшей возможной модели, определенные шаги необходимы для обеспечения жизнеспособности. Например, во время выделения CD34⁺ важно, чтобы человек, смотрящий в микроскоп, мог идентифицировать клетки CD34⁺ . Хотя это может показаться излишним, автоматические счетные машины не всегда идентифицируют эти клетки из-за их морфологии, а сама машина может ошибочно идентифицировать мусор как положительные. Поэтому крайне важно идентифицировать эти клетки вручную. Кроме того, важно подтвердить, что тимус действительно входит в капсулу почки во время операции по пересадке почки. Это может быть визуализировано или пальпировано: хирург должен быть в состоянии прощупать части тимуса, поступающие в почку.

Важно отметить, что процесс имеет несколько предостережений, которые могут определить успех модели. Во-первых, качество ткани плода должно быть оценено индивидуально, чтобы определить, могут ли выделенные клетки потенциально быть токсичными для мыши. Например, ткань старше 20 недель выглядит более упругой и режется более аккуратно во время подготовки. В целом происходит меньшая деградация. Эти качества являются общими показателями лучшего калибра ткани. Второе предостережение метода касается количества и качества CD34⁺ клеток; Количество производимых клеток варьирует и иногда может не обеспечивать достаточного количества для инъекций. В этих случаях можно обойти проблему, введя мононуклеарные клетки печени, выделенные ранее в протоколе. В-третьих, после внедрения успешной модели, у мышей может начать развиваться реакция «трансплантат против хозяина» (GVH) в возрасте около 25 недель. В то время как модель может продержаться до 30 недель, исследователи должны обратить пристальное внимание на изменения в теле, выпадение волос и лицевые расстройства, похожие на мышей. В этот момент всегда следует проконсультироваться с лечащим ветеринаром, определить качество жизни и ухаживать за мышами по указанию или усыпить.

Основное различие между этим протоколом и другими гуманизированными моделями заключается в использовании цитокинов сначала для улучшения пролиферации и стабилизации гемопоэтических клеток, а затем для усиления дифференцировки иммунных клеток. Эффекты использования цитокинов устраняются повышенным уровнем CD45⁺ клеток человека в периферическом кровообращении мышей и способствуют дифференцировке Т-клеток и миелоидных клеток по сравнению с мышами, у которых цитокины отсутствовали,^{как сообщалось ранее}.

Таким образом, описанная модель обеспечивает гуманизированную мышь со стабильной продолжительностью жизни и функциональной рекапитуляцией иммунных клеток человека. Модель может быть воссоздана другими в попытке изучить множество вопросов, связанных с иммунотерапией, вирусными исследованиями, регенеративной медициной и многочисленными областями за пределами этих контекстов.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов с данной рукописью.

Спасибо Wistar Flow-Cytometry, Molecular Screening, Vector Core и Animal Facility за их поддержку. Эта работа стала возможной благодаря поддержке Фонда медицинских исследований доктора Мириам и Шелдона Г. Адельсона.