Method Article
I modelli murini umanizzati forniscono una rappresentazione più accurata del microambiente immunitario umano. Questo manoscritto descrive il processo in cui questi modelli vengono creati attraverso un trapianto renale di timo umano, l'iniezione di cellule CD34+ umane e la somministrazione mirata di transgeni di citochine umane per promuovere la proliferazione e la differenziazione delle cellule CD34+ .
I modelli animali forniscono una traduzione vitale tra la ricerca biomedica in vitro e quella in vivo . I modelli murini umanizzati forniscono un ponte nella rappresentazione dei sistemi umani, consentendo così uno studio più accurato della patogenesi, dei biomarcatori e di molte altre questioni scientifiche. In questo metodo descritto, a topi IL2Rγnull (NSG) immunodeficienti viene impiantato timo autologo, iniettato con cellule CD34+ derivate dal fegato seguite da una serie di consegne di citochine iniettate. A differenza di altri modelli di natura simile, il modello qui descritto promuove una migliore ricostituzione delle cellule immunitarie fornendo citochine e fattori di crescita tramite transgeni codificati in vettori basati su DNA AAV8 o pMV101. Inoltre, offre stabilità a lungo termine con topi ricostituiti che hanno una durata media di vita di 30 settimane dopo le iniezioni di CD34+ . Attraverso questo modello, speriamo di fornire un metodo stabile e di impatto per studiare l'immunoterapia e le malattie umane in un modello murino, dimostrando così la necessità di modelli preclinici predittivi.
Mentre i modelli animali hanno creato una comprensione più profonda dei sistemi cellulari e molecolari, la sfida rimane quella di chiarire le complessità dei sistemi specie-specifici, come l'immunità, la fisiologia e altre aree della patologia. I primati non umani (NHP), come gli scimpanzé, sono stati storicamente utilizzati per compensare le lacune mancanti nella ricerca sui modelli; tuttavia, il modello NHP può essere piuttosto costoso e inaccessibile, in particolare perché il loro uso è stato vietato in Europa1.
A seguito di una procedura di innesto riuscita, il sistema murino replica il sistema immunitario umano, come dimostrato attraverso il ripopolamento degli organi linfoidi. Lo sviluppo di topi con sistema immunitario umano funzionale offre l'opportunità di condurre ricerche traslazionali sull'immunità umana in una varietà di contesti. I topi immunodeficienti innestati con cellule e tessuti umani in grado di replicare con successo un sistema immunitario umano operativo facilitano lo studio dell'emopoiesi, dell'immunità, della terapia genica2, delle malattie infettive3, del cancro4 e della medicina rigenerativa5. Il nostro gruppo e alcuni dei nostri collaboratori hanno pubblicato i risultati utilizzando questo modello che dimostra modelli preclinici di melanoma cutaneo6. Questo modello è abbastanza versatile da essere applicato a innumerevoli campi al di fuori del contesto del melanoma e della ricerca sull'immunoterapia.
Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono comunemente utilizzate per l'umanizzazione in quanto provocano una robusta ricostituzione delle cellule T, che hanno ruoli stabiliti nella tolleranza immunitaria; tuttavia, a causa del loro basso tasso di auto-rinnovamento e del loro alto tasso di cellule mature impegnate nel lignaggio, le PBMC sono spesso sostituite con prodotti a base di cellule staminali umane (HSC), che possono essere derivati dal fegato fetale7. In combinazione con questi prodotti derivati dalle HSC, l'aggiunta dell'impianto del timo umano sotto le capsule renali dei topi NSG crea un sistema in grado di supportare lo sviluppo delle cellule T umane. Questo modello, noto come midollo osseo-fegato-timo (BLT), è molto vantaggioso perché consente l'emopoiesi multilineare, l'educazione delle cellule T nel timo autologo e la restrizione HLA8.
Il modello proposto in questo manoscritto è un modello BLT modificato con rilascio aggiuntivo di citochine. È stato dimostrato che le citochine proinfiammatorie rafforzano le capacità delle cellule immunitarie effettrici, in particolare attraverso immunoterapie basate su IL-159. I linfociti CD45+ sono stati osservati nel sangue periferico di topi umanizzati (topi Hu) circa 8-12 settimane dopo l'iniezione di cellule CD34+ umane, mostrando un evidente aumento della ricostituzione rispetto al sangue circolante dei topi NSG regolari. Utilizzando il vettore adeno-associato per veicolare IL-3, IL-7 e GM-CSF umani, i livelli di cellule CD45+ umane sono aumentati in circolazione rispetto a quei topi che non ricevono le citochine. L'aggiunta delle citochine DNA Combo II (SCF, FLT3, CKIT e THPO) migliora la differenziazione delle cellule T e delle cellule mieloidi10. L'aggiunta del rilascio di citochine distingue questo metodo tra gli altri modelli di topi Hu, come supportato dai dati pubblicati10.
Lo sviluppo di questo modello con una risposta immunitaria umana innata e adattativa ha permesso di pubblicare dati riguardanti la resistenza alla terapia e il microambiente tumorale10. I laboratori a condizione possano accedere a campioni di tessuto per utilizzare questo metodo; questo modello di Hu-mice ha un grande potenziale per altri laboratori per studiare campi simili e per espandersi in altre aree dell'immunoterapia e degli studi preclinici.
Tutti i protocolli che coinvolgono l'uso di animali sono attentamente monitorati dall'Institutional Animal Care and User Committee (IACUC) del Wistar Institute. Il laboratorio aderisce alle linee guida stabilite da questo comitato e dal veterinario curante per garantire la salute, la sicurezza e il benessere degli animali coinvolti. Prima di seguire questo protocollo, è richiesta l'approvazione del veterinario e dell'IACUC e le persone possono avere variazioni nelle tecniche chirurgiche specifiche e nella gestione degli animali rispetto al protocollo secondo il consiglio delle suddette parti coinvolte nel benessere degli animali.
NOTA: I campioni di tessuto possono essere congelati fino al momento dell'uso. Inoltre, l'isolamento del CD34+ può essere eseguito lo stesso giorno o il giorno successivo all'intervento di innesto renale. Queste informazioni informeranno quando Busulfan verrà iniettato: se si intende eseguire un intervento chirurgico lo stesso giorno dell'isolamento, Busulfan deve essere iniettato preventivamente in preparazione del tessuto ricevente. Trattare trenta topi femmina NSG di 5-7 settimane con 30 mg/kg (100 μL, PBS 1x) di un farmaco mielodepletivo appena prodotto; Busulfan iniettato IP 24 ore prima dell'intervento.
1. Isolamento delle cellule CD34+
2. Elaborazione del timico
3. Innesto di capsula sottorenale e iniezione di cellule CD34
Dopo un intervento chirurgico di successo e appropriate iniezioni postoperatorie, la differenziazione di CD34+ può essere confermata tramite citometria a flusso. Circa 8 settimane dopo l'intervento chirurgico, i topi vengono dissanguati in preparazione per la FACS, ricorrendo ogni 2 settimane fino a quando non viene raggiunta una soglia specifica di cellule immunitarie umane come descritto in precedenza10. In breve, 100 ml di sangue sono stati raccolti in provette per la raccolta del sangue rivestite con litio ed eparina. Dopo la lisi dei globuli rossi utilizzando il tampone di lisi ACK, le cellule sono state lavate con tampone FACS (soluzione salina tamponata con fosfato, FBS al 2% e sodio azide allo 0,1%) e centrifugate. Il pellet cellulare è stato quindi risospeso in 100 mL di tampone FACS e incubato con un pannello di anticorpi (anti-topo CD45, anti-umano CD45, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD20). Per identificare le cellule vive e morte, le cellule sono state colorate con DAPI e i linfociti sono stati controllati in base ai parametri FSC-A e SSC-A. È stato generato un gate per selezionare le celle vive e da queste le singole celle. Da quella singola popolazione di linfociti vivi, abbiamo prima distinto le cellule CD45+ umane da quelle di topo. Le cellule CD20+ e CD3+ sono state identificate dalle cellule CD45+ umane e, infine, le cellule CD4+ e CD8+ sono state identificate dalle cellule CD3+ (cellule T). Per approfondire, i topi Hu-topi sono pronti per essere utilizzati per esperimenti di immunoterapia quando raggiungono la soglia del >25% di HuCD45+ nei linfociti totali e del >8%-10% CD8+ nelle cellule CD3+ umane (Figura 1). Nelle prime fasi della ricostituzione, i livelli di CD20+ sono alti e i livelli di CD3+ sono bassi. Man mano che le cellule proliferano e si ricostituiscono con il tempo, i livelli di CD20+ diminuiscono all'aumentare dei livelli di CD3+ . Ciò è correlato a quando il timo di topo, la milza di topo e l'Hu-timo innestato con capsula renale vengono ripopolati con cellule precursori linfoidi umane che subiscono la differenziazione.
Figura 1: Analisi di citometria a flusso di un topo ricostituito. L'analisi è finalizzata ad isolare le diverse popolazioni di cellule, partendo dalla popolazione totale di linfociti, distinguendo poi tra cellule vive, singole cellule e varie popolazioni di cellule staminali con particolare attenzione rivolta al CD45+ e al CD8+ per accertare la vicinanza alle soglie, come precedentemente riportato10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Questo manoscritto ha qui descritto la generazione di topi umanizzati tramite timo fetale umano innestato sotto la capsula renale e la successiva iniezione di CD34+ per ricreare un sistema immunitario umano.
Sebbene il protocollo funzioni per creare il miglior modello possibile, alcuni passaggi sono essenziali per la fattibilità. Ad esempio, durante l'isolamento del CD34+ , è essenziale che chi guarda attraverso il microscopio possa identificare le cellule CD34+ . Anche se può sembrare ridondante, le macchine per il conteggio automatico non sempre identificano queste cellule a causa della loro morfologia e la macchina stessa può identificare erroneamente i detriti come cellule positive. Pertanto, è fondamentale identificare manualmente queste cellule. Inoltre, è essenziale confermare che il timo stia veramente entrando nella capsula renale durante l'intervento chirurgico di trapianto renale. Questo può essere visualizzato o palpato: il chirurgo dovrebbe essere in grado di sentire i pezzi di timo che entrano nel rene.
È importante sottolineare che il processo presenta alcune avvertenze che possono determinare il successo del modello. Il primo è che la qualità del tessuto fetale deve essere valutata individualmente per determinare se le cellule isolate potrebbero essere potenzialmente tossiche per il topo. Ad esempio, il tessuto di età superiore alle 20 settimane appare più sodo e si taglia in modo più preciso durante la preparazione. In genere il degrado è minore. Queste qualità sono indicatori generali di un tessuto di migliore calibro. Un secondo avvertimento della tecnica riguarda la quantità e la qualità delle cellule CD34+ ; Il numero di cellule prodotte è variabile e talvolta può non fornire abbastanza per le iniezioni. In questi casi, è possibile aggirare il problema iniettando le cellule mononucleate del fegato isolate in precedenza nel protocollo. In terzo luogo, dopo l'implementazione di un modello di successo, i topi possono iniziare a sviluppare la malattia del trapianto contro l'ospite (GVH) intorno alle 25 settimane di età. Mentre il modello può durare fino a 30 settimane, è intorno alle 25 settimane che gli investigatori dovrebbero prestare molta attenzione ai cambiamenti nell'aspetto dei topi nel punteggio corporeo, nella perdita di capelli e nell'angoscia facciale. A questo punto, si dovrebbe sempre consultare il veterinario curante, determinare la qualità della vita e occuparsi dei topi come dettato o soppresso.
La principale differenza tra questo protocollo e altri modelli umanizzati è l'uso di citochine per migliorare la proliferazione e la stabilizzazione delle cellule ematopoietiche prima e poi migliorare la differenziazione delle cellule immunitarie. Gli effetti dell'uso delle citochine sono affrontati dall'aumento dei livelli di cellule CD45+ umane nella circolazione sanguigna periferica del topo e favoriti nella differenziazione delle cellule T e delle cellule mieloidi rispetto a quei topi senza citochine, come precedentemente riportato10.
In sintesi, il modello descritto fornisce a un topo umanizzato una durata di vita stabile e una ricapitolazione funzionale delle cellule immunitarie umane. Il modello può essere ricreato da altri nel tentativo di studiare una miriade di domande relative all'immunoterapia, alla ricerca virale, alla medicina rigenerativa e a numerosi campi al di fuori di questi contesti.
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione con questo manoscritto.
Grazie a Wistar Flow-Cytometry, Molecular Screening, Vector Core, e Animal Facility per il loro supporto. Questo lavoro è stato reso possibile grazie al supporto della Dr. Miriam e della Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ACK lysis buffer | Life Technologies Corporation | ||
BD Microcontainer | BD | blood collection tubes | |
Busulfan | Sigma | B2635-25g | Irradiating drug; light sensitive |
CD34 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | antibody beads kit; stored at 4 °C |
CKIT | Aldevron | custom | cytokine; stored at -20 °C |
Collagenase/Dispase | Roche Diagnostics | 11097113001 | Stored at 4 °C |
FcR Blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | antibody beads kit; stored at 4 °C |
Fetal tissue (liver and thymus) | Advanced Bioscience Resources | Delivered same day or overnight | |
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-03 | Stored at room temperature |
FLT3 | Aldevron | 125964 | cytokine; stored at -20 °C |
Forceps | Various | Various | |
Hamilton syringe needle | Various | Various | 22 G; 3 point; 2" length |
Hemostats | Various | Various | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | magnetic separator |
PBS | Gibco | 14190-136 | Stored at room temperature |
Primocin | Invivogen | amt-pm1 | antibiotic; stored at 4 °C |
RPMI | Corning | 10-040-CM | Stored at 4 °C |
SCF | Aldevron | 125962 | cytokine; stored at -20 °C |
Surgical scissors | Various | Various | |
THPO | Aldevron | 125963 | cytokine; stored at -20 °C |
Tissue treated petri dish | Corning | 430167 | |
VetBond glue | 3M | 1469SB | glue |
Visorb suture | Stoelting Co | 5046 | absorbable suture, size 4, 19 mm cutting |
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