Produzione di topo umanizzato tramite innesto di capsula renale timica, iniezione di cellule CD34⁺ e somministrazione di citochine

I modelli murini umanizzati forniscono una rappresentazione più accurata del microambiente immunitario umano. Questo manoscritto descrive il processo in cui questi modelli vengono creati attraverso un trapianto renale di timo umano, l'iniezione di cellule CD34⁺ umane e la somministrazione mirata di transgeni di citochine umane per promuovere la proliferazione e la differenziazione delle cellule CD34⁺ .

I modelli animali forniscono una traduzione vitale tra la ricerca biomedica in vitro e quella in vivo . I modelli murini umanizzati forniscono un ponte nella rappresentazione dei sistemi umani, consentendo così uno studio più accurato della patogenesi, dei biomarcatori e di molte altre questioni scientifiche. In questo metodo descritto, a topi IL2Rγnull (NSG) immunodeficienti viene impiantato timo autologo, iniettato con cellule CD34⁺ derivate dal fegato seguite da una serie di consegne di citochine iniettate. A differenza di altri modelli di natura simile, il modello qui descritto promuove una migliore ricostituzione delle cellule immunitarie fornendo citochine e fattori di crescita tramite transgeni codificati in vettori basati su DNA AAV8 o pMV101. Inoltre, offre stabilità a lungo termine con topi ricostituiti che hanno una durata media di vita di 30 settimane dopo le iniezioni di CD34⁺ . Attraverso questo modello, speriamo di fornire un metodo stabile e di impatto per studiare l'immunoterapia e le malattie umane in un modello murino, dimostrando così la necessità di modelli preclinici predittivi.

Mentre i modelli animali hanno creato una comprensione più profonda dei sistemi cellulari e molecolari, la sfida rimane quella di chiarire le complessità dei sistemi specie-specifici, come l'immunità, la fisiologia e altre aree della patologia. I primati non umani (NHP), come gli scimpanzé, sono stati storicamente utilizzati per compensare le lacune mancanti nella ricerca sui modelli; tuttavia, il modello NHP può essere piuttosto costoso e inaccessibile, in particolare perché il loro uso è stato vietato in Europa¹.

A seguito di una procedura di innesto riuscita, il sistema murino replica il sistema immunitario umano, come dimostrato attraverso il ripopolamento degli organi linfoidi. Lo sviluppo di topi con sistema immunitario umano funzionale offre l'opportunità di condurre ricerche traslazionali sull'immunità umana in una varietà di contesti. I topi immunodeficienti innestati con cellule e tessuti umani in grado di replicare con successo un sistema immunitario umano operativo facilitano lo studio dell'emopoiesi, dell'immunità, della terapia genica², delle malattie infettive³, del cancro⁴ e della medicina rigenerativa⁵. Il nostro gruppo e alcuni dei nostri collaboratori hanno pubblicato i risultati utilizzando questo modello che dimostra modelli preclinici di melanoma cutaneo⁶. Questo modello è abbastanza versatile da essere applicato a innumerevoli campi al di fuori del contesto del melanoma e della ricerca sull'immunoterapia.

Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono comunemente utilizzate per l'umanizzazione in quanto provocano una robusta ricostituzione delle cellule T, che hanno ruoli stabiliti nella tolleranza immunitaria; tuttavia, a causa del loro basso tasso di auto-rinnovamento e del loro alto tasso di cellule mature impegnate nel lignaggio, le PBMC sono spesso sostituite con prodotti a base di cellule staminali umane (HSC), che possono essere derivati dal fegato fetale⁷. In combinazione con questi prodotti derivati dalle HSC, l'aggiunta dell'impianto del timo umano sotto le capsule renali dei topi NSG crea un sistema in grado di supportare lo sviluppo delle cellule T umane. Questo modello, noto come midollo osseo-fegato-timo (BLT), è molto vantaggioso perché consente l'emopoiesi multilineare, l'educazione delle cellule T nel timo autologo e la restrizione HLA⁸.

Il modello proposto in questo manoscritto è un modello BLT modificato con rilascio aggiuntivo di citochine. È stato dimostrato che le citochine proinfiammatorie rafforzano le capacità delle cellule immunitarie effettrici, in particolare attraverso immunoterapie basate su IL-15⁹. I linfociti CD45⁺ sono stati osservati nel sangue periferico di topi umanizzati (topi Hu) circa 8-12 settimane dopo l'iniezione di cellule CD34⁺ umane, mostrando un evidente aumento della ricostituzione rispetto al sangue circolante dei topi NSG regolari. Utilizzando il vettore adeno-associato per veicolare IL-3, IL-7 e GM-CSF umani, i livelli di cellule CD45⁺ umane sono aumentati in circolazione rispetto a quei topi che non ricevono le citochine. L'aggiunta delle citochine DNA Combo II (SCF, FLT3, CKIT e THPO) migliora la differenziazione delle cellule T e delle cellule mieloidi¹⁰. L'aggiunta del rilascio di citochine distingue questo metodo tra gli altri modelli di topi Hu, come supportato dai dati pubblicati¹⁰.

Lo sviluppo di questo modello con una risposta immunitaria umana innata e adattativa ha permesso di pubblicare dati riguardanti la resistenza alla terapia e il microambiente tumorale¹⁰. I laboratori a condizione possano accedere a campioni di tessuto per utilizzare questo metodo; questo modello di Hu-mice ha un grande potenziale per altri laboratori per studiare campi simili e per espandersi in altre aree dell'immunoterapia e degli studi preclinici.

Tutti i protocolli che coinvolgono l'uso di animali sono attentamente monitorati dall'Institutional Animal Care and User Committee (IACUC) del Wistar Institute. Il laboratorio aderisce alle linee guida stabilite da questo comitato e dal veterinario curante per garantire la salute, la sicurezza e il benessere degli animali coinvolti. Prima di seguire questo protocollo, è richiesta l'approvazione del veterinario e dell'IACUC e le persone possono avere variazioni nelle tecniche chirurgiche specifiche e nella gestione degli animali rispetto al protocollo secondo il consiglio delle suddette parti coinvolte nel benessere degli animali.

NOTA: I campioni di tessuto possono essere congelati fino al momento dell'uso. Inoltre, l'isolamento del CD34⁺ può essere eseguito lo stesso giorno o il giorno successivo all'intervento di innesto renale. Queste informazioni informeranno quando Busulfan verrà iniettato: se si intende eseguire un intervento chirurgico lo stesso giorno dell'isolamento, Busulfan deve essere iniettato preventivamente in preparazione del tessuto ricevente. Trattare trenta topi femmina NSG di 5-7 settimane con 30 mg/kg (100 μL, PBS 1x) di un farmaco mielodepletivo appena prodotto; Busulfan iniettato IP 24 ore prima dell'intervento.

1. Isolamento delle cellule CD34⁺

1. Preparare la soluzione digestiva sciogliendo 100 mg di collagenasi/dispasi in 50 ml di RPMI1640. Utilizzare un filtro sottovuoto da 0,22 μm per sterilizzare la soluzione digestiva.
2. Il fegato fetale (>20 settimane di età) viene fornito in 50 ml di RPMI1640 terreno. Aspirare ed eliminare il terreno, lasciando 10 ml all'interno della provetta contenente il fegato.
3. Lavare il fazzoletto con 45 mL di RPMI1640 + 100 μg/mL dell'antibiotico Primocin due volte in una provetta conica da 50 mL, aspirando il terreno tra un lavaggio e l'altro. Assicurarsi di lasciare che il fazzoletto si depositi sul fondo del tubo prima di aspirare il fluido.
4. Mettere un setaccio di tessuto sterile in un becher sterile da 200 mL.
5. Versare il fegato fetale attraverso il setaccio e utilizzare l'estremità di una siringa di plastica sterile da 10 ml per macinare il tessuto.
6. Sciacquare le cellule epatiche rimaste nel setaccio utilizzando 50 mL di RPMI1640 + 100 μg/mL dell'antibiotico Primocin seguiti da 50 mL di RPMI1640 Collagenasi/Dispasi (2 mg/mL). Il becher da 200 ml contiene ora il RPMI1640 con Primocin, RPMI1640 collagenasi/dispasi e fegato omogeneizzato.
7. Aliquotare la miscela in quattro provette coniche da 50 mL e incubarle a bagnomaria (37 °C) per 1 ora. Agitare i tubi conici ogni 15 minuti.
8. Aggiungere 15 mL di Ficoll in quattro provette coniche da 50 mL.
9. Sovrapporre accuratamente la soluzione epatica omogeneizzata, distribuendo circa 35 mL tra ciascuna provetta. Non disturbare l'interfaccia.
10. Posizionare le provette nella centrifuga e centrifugare a 800 x g per 1 ora con un'accelerazione/frenata minima.
11. Rimuovere le provette dalla centrifuga e raccogliere le cellule dall'interfaccia (10-15 mL) in due provette coniche da 50 mL.
12. Aggiungere PBS 1x fino a 50 mL per lavare il pellet e centrifugare a 300 x g per 5 min. Scartare il surnatante.
13. Risospendere il pellet in 10 mL di tampone di lisi ACK (Cloruro di Ammonio-Potassio) e incubare per 5-10 minuti. Riempi il tubo con 1x PBS.
14. Contare manualmente le cellule al microscopio utilizzando il blu di tripano e un emocitometro. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min.
    NOTA: Le cellule mononucleate del fegato possono essere iniettate direttamente da qui, se lo si desidera, ad esempio se la conta cellulare è inferiore a 50 milioni di cellule.
15. Aspirare il PBS e risospendere il pellet di cella in 300 μL del tampone di separazione (2 mM EDTA, 5 μg/mL di BSA in 1x PBS) per 100 x 10⁶ celle o meno. Per più di 100 x 10⁶ celle, utilizzare un rapporto basato sulla quantità di celle di cui sopra per determinare la quantità di buffer (ad esempio, raddoppiare le celle, raddoppiare il buffer).
16. Aggiungere 100 μl di reagente bloccante FcR e incubare 2-5 minuti.
17. Aggiungere 100 μl di anticorpi CD34 microbeads, mescolare bene e incubare su ghiaccio per 30 minuti; Agitare meccanicamente con la mano dopo 15 min.
18. Aggiungere 7-10 mL di tampone di separazione e filtrare attraverso filtri cellulari da 100 μm, 70 μm e 40 μm in quest'ordine.
19. Posizionare un separatore di celle a colonna in un separatore magnetico. Posizionare una provetta conica da 15 mL sotto il separatore per raccogliere il flusso e il tampone.
20. Riempire la colonna con 500 μl di tampone di separazione.
21. Versare la sospensione cellulare attraverso la colonna.
22. Riempire la colonna con il flusso passante e il tampone che è stato raccolto nel tubo conico.
23. Lavare la colonna 3 volte con 500 μl di tampone di separazione.
24. Eliminare il flusso continuo e sostituire la provetta con una provetta in polistirene da 15 mL.
25. Riempire la colonna con 1 mL di tampone di separazione, rimuovere la colonna dal magnete e lavare lo stantuffo verso il basso con una sola pressione.
26. Contare le cellule e risospendere in 1x PBS per l'iniezione. Mettere sul ghiaccio fino al momento dell'uso.

2. Elaborazione del timico

1. Lavare il timo autologo (>20 settimane di età) aggiungendo 5-8 ml di RPMI1640, lasciare che il tessuto si depositi. Rimuovere con cautela il fluido con l'aspirapolvere, evitando il contatto con il timo. Ripeti l'operazione ancora una volta.
2. Sospendere in 10 mL di RPMI1640 a temperatura ambiente con Primocin (100 μg/mL).
3. Trasferire il timo in una capsula di Petri trattata con tessuti. Assicurarsi che il timo sia completamente ricoperto di Primocin-media.
4. Incubare per 30-45 minuti a temperatura ambiente.
5. Aspirare il Primocin-media. Lavare il timo con 5-8 ml di RPMI1640, rimuovere il terreno con l'aspirapolvere e ripetere l'operazione ancora una volta.
6. Sospendere il timo in 5-8 ml di RPMI1640.
7. Preparare il timo incubato per l'innesto affettando segmenti di 1 mm x 2 mm con due bisturi.
   NOTA: Questo verrà innestato nei topi; pertanto, assicurarsi che le fette di timo possano essere aspirate sia dentro che fuori dalla siringa e dall'ago Hamilton da 22 G collegato con relativa facilità.

3. Innesto di capsula sottorenale e iniezione di cellule CD34

1. Esamina i topi per la loro salute generale prima dell'intervento chirurgico. Radere i topi per esporre un'area (circa 3" x 2") sul corpo laterale sinistro.
2. Anestetizzare i topi tramite isoflurano (induzione 5%, mantenimento 2%-3%) nella camera e quindi trasferire i singoli topi dalla camera a uno stadio chirurgico con un cono nasale.
3. Igienizzare l'area rasata con clorexidina e tamponi per la preparazione dell'alcol. Garantire l'anestesia individuale tramite il test di pizzicamento.
4. Praticare una grande incisione (5-7 mm) posteriormente, lateralmente alla colonna vertebrale del topo, e ripiegare la pelle.
5. Assicurati che a questo punto la milza sia visibile sotto la fascia. Praticare un'incisione più piccola di ~2 mm nella fascia. Assicurarsi che l'incisione sia la più piccola possibile, consentendo al rene di essere completamente esposto.
6. Determina la posizione di questa incisione, identificando visivamente la milza e usandola come marcatore per il rene, che non è visibile.
   NOTA: Il rene murino si trova dietro un raggruppamento di grasso nel quadrante nord-est fino alla milza.
7. Da qui, posiziona la mano (chirurgo) sotto il lato del topo opposto all'incisione e spingi per esporre il rene. Riposizionare il grasso per esporre completamente il rene.
8. Utilizzare le dita della stessa mano per stabilizzare il rene esposto. Se necessario, utilizzare 1x PBS sterile per lubrificare il rene esposto.
   NOTA: È importante notare che il chirurgo deve usare dita diverse da quelle che hanno maneggiato il lato del topo per tenere il rene e mantenere la sterilità. Consultare il veterinario dell'istituto per quanto riguarda il corretto mantenimento della sterilità.
9. Contemporaneamente, lascia che l'assistente prepari una siringa smussata con il tessuto del timo fetale. Aspirare delicatamente 2-3 pezzi di timo di medie dimensioni (1 mm x 2 mm) con un terreno minimo fino alla punta dell'ago e poi consegnarli al chirurgo per eseguire la procedura.
   NOTA: Il numero di pezzi di timo dipende dalle dimensioni del tessuto, di solito 2 pezzi sono sufficienti per ottenere topi umanizzati.
10. Lasciare che il chirurgo inserisca l'ago attraverso l'estremità caudale della capsula renale fino a raggiungere l'estremità distale (~2 mm), fino al punto in cui l'ago è visibile, ma non sfonda il lato cranico della capsula renale. Lascia che l'assistente immerga la siringa.
11. Rimetti il rene, insieme al grasso esposto, nel peritoneo. Posizionare una sutura riassorbibile (misura 4) e chiudere l'incisione superficiale con una colla veterinaria.
12. Dopo l'intervento, somministrare una dose del farmaco analgesico, 25 μL di buprenorfina a rilascio prolungato (1 mg/mL) tramite iniezione sottocutanea (1 mg/kg).
13. Verificare che i topi inizino a riprendersi entro 5 minuti dall'operazione.
14. Tra una gabbia e l'altra, cambiare i guanti e sterilizzare gli strumenti in uno sterilizzatore a microsfere di vetro.
15. Da 1 a 3 ore dopo l'intervento chirurgico, iniettare 100 μL di cellule CD34⁺ umane (circa 100.000 cellule) nel topo mediante iniezione endovenosa (IV).
16. Condurre un controllo generale della salute dei topi dopo aver concluso l'intervento chirurgico (di solito 2 ore dopo la prima gabbia), quindi 24 ore e 48 ore dopo.
17. Se ci sono anomalie nella disposizione o nei segni vitali, monitorare ulteriormente i topi. Una volta superati questi posti di blocco, monitora i topi in modo meno rigoroso (2x-3x a settimana).
18. Una settimana dopo l'intervento chirurgico, iniettare (IV) nei topi 100 μL di citochina umana AAV8 (IL-3, IL-7 e GM-CSF; 2 x 10⁹ copie del genoma/mL).
19. Due settimane dopo l'intervento, eseguire iniezioni IM del plasmidico DNA Combo II.
    1. Utilizzare una macchina per elettroporazione per eseguire iniezioni IM di DNA plasmidico Combo II: SCF, FLT3, CKIT e THPO. Per ogni topo, combinare 25 μL di SCF (2 mg/mL), 25 μL di THPO (2 mg/mL), 25 μL di FLT3 (2 mg/mL) e 25 μL di CKIT (10 mg/mL).
    2. Eseguire un'iniezione per zampa posteriore, cioè due in totale, con 50 μl per gamba, seguita da elettroporazione su ciascun sito di iniezione.

Dopo un intervento chirurgico di successo e appropriate iniezioni postoperatorie, la differenziazione di CD34⁺ può essere confermata tramite citometria a flusso. Circa 8 settimane dopo l'intervento chirurgico, i topi vengono dissanguati in preparazione per la FACS, ricorrendo ogni 2 settimane fino a quando non viene raggiunta una soglia specifica di cellule immunitarie umane come descritto in precedenza¹⁰. In breve, 100 ml di sangue sono stati raccolti in provette per la raccolta del sangue rivestite con litio ed eparina. Dopo la lisi dei globuli rossi utilizzando il tampone di lisi ACK, le cellule sono state lavate con tampone FACS (soluzione salina tamponata con fosfato, FBS al 2% e sodio azide allo 0,1%) e centrifugate. Il pellet cellulare è stato quindi risospeso in 100 mL di tampone FACS e incubato con un pannello di anticorpi (anti-topo CD45, anti-umano CD45, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD20). Per identificare le cellule vive e morte, le cellule sono state colorate con DAPI e i linfociti sono stati controllati in base ai parametri FSC-A e SSC-A. È stato generato un gate per selezionare le celle vive e da queste le singole celle. Da quella singola popolazione di linfociti vivi, abbiamo prima distinto le cellule CD45⁺ umane da quelle di topo. Le cellule CD20⁺ e CD3⁺ sono state identificate dalle cellule CD45⁺ umane e, infine, le cellule CD4⁺ e CD8⁺ sono state identificate dalle cellule CD3⁺ (cellule T). Per approfondire, i topi Hu-topi sono pronti per essere utilizzati per esperimenti di immunoterapia quando raggiungono la soglia del >25% di HuCD45⁺ nei linfociti totali e del >8%-10% CD8⁺ nelle cellule CD3⁺ umane (Figura 1). Nelle prime fasi della ricostituzione, i livelli di CD20⁺ sono alti e i livelli di CD3⁺ sono bassi. Man mano che le cellule proliferano e si ricostituiscono con il tempo, i livelli di CD20⁺ diminuiscono all'aumentare dei livelli di CD3⁺ . Ciò è correlato a quando il timo di topo, la milza di topo e l'Hu-timo innestato con capsula renale vengono ripopolati con cellule precursori linfoidi umane che subiscono la differenziazione.

Figura 1: Analisi di citometria a flusso di un topo ricostituito. L'analisi è finalizzata ad isolare le diverse popolazioni di cellule, partendo dalla popolazione totale di linfociti, distinguendo poi tra cellule vive, singole cellule e varie popolazioni di cellule staminali con particolare attenzione rivolta al CD45⁺ e al CD8⁺ per accertare la vicinanza alle soglie, come precedentemente riportato¹⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo manoscritto ha qui descritto la generazione di topi umanizzati tramite timo fetale umano innestato sotto la capsula renale e la successiva iniezione di CD34⁺ per ricreare un sistema immunitario umano.

Sebbene il protocollo funzioni per creare il miglior modello possibile, alcuni passaggi sono essenziali per la fattibilità. Ad esempio, durante l'isolamento del CD34⁺ , è essenziale che chi guarda attraverso il microscopio possa identificare le cellule CD34⁺ . Anche se può sembrare ridondante, le macchine per il conteggio automatico non sempre identificano queste cellule a causa della loro morfologia e la macchina stessa può identificare erroneamente i detriti come cellule positive. Pertanto, è fondamentale identificare manualmente queste cellule. Inoltre, è essenziale confermare che il timo stia veramente entrando nella capsula renale durante l'intervento chirurgico di trapianto renale. Questo può essere visualizzato o palpato: il chirurgo dovrebbe essere in grado di sentire i pezzi di timo che entrano nel rene.

È importante sottolineare che il processo presenta alcune avvertenze che possono determinare il successo del modello. Il primo è che la qualità del tessuto fetale deve essere valutata individualmente per determinare se le cellule isolate potrebbero essere potenzialmente tossiche per il topo. Ad esempio, il tessuto di età superiore alle 20 settimane appare più sodo e si taglia in modo più preciso durante la preparazione. In genere il degrado è minore. Queste qualità sono indicatori generali di un tessuto di migliore calibro. Un secondo avvertimento della tecnica riguarda la quantità e la qualità delle cellule CD34⁺ ; Il numero di cellule prodotte è variabile e talvolta può non fornire abbastanza per le iniezioni. In questi casi, è possibile aggirare il problema iniettando le cellule mononucleate del fegato isolate in precedenza nel protocollo. In terzo luogo, dopo l'implementazione di un modello di successo, i topi possono iniziare a sviluppare la malattia del trapianto contro l'ospite (GVH) intorno alle 25 settimane di età. Mentre il modello può durare fino a 30 settimane, è intorno alle 25 settimane che gli investigatori dovrebbero prestare molta attenzione ai cambiamenti nell'aspetto dei topi nel punteggio corporeo, nella perdita di capelli e nell'angoscia facciale. A questo punto, si dovrebbe sempre consultare il veterinario curante, determinare la qualità della vita e occuparsi dei topi come dettato o soppresso.

La principale differenza tra questo protocollo e altri modelli umanizzati è l'uso di citochine per migliorare la proliferazione e la stabilizzazione delle cellule ematopoietiche prima e poi migliorare la differenziazione delle cellule immunitarie. Gli effetti dell'uso delle citochine sono affrontati dall'aumento dei livelli di cellule CD45⁺ umane nella circolazione sanguigna periferica del topo e favoriti nella differenziazione delle cellule T e delle cellule mieloidi rispetto a quei topi senza citochine, come precedentemente riportato¹⁰.

In sintesi, il modello descritto fornisce a un topo umanizzato una durata di vita stabile e una ricapitolazione funzionale delle cellule immunitarie umane. Il modello può essere ricreato da altri nel tentativo di studiare una miriade di domande relative all'immunoterapia, alla ricerca virale, alla medicina rigenerativa e a numerosi campi al di fuori di questi contesti.

Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione con questo manoscritto.

Grazie a Wistar Flow-Cytometry, Molecular Screening, Vector Core, e Animal Facility per il loro supporto. Questo lavoro è stato reso possibile grazie al supporto della Dr. Miriam e della Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation.