Produção de camundongo humanizado por meio de enxerto de cápsula renal tímica, injeção de células CD34⁺ e entrega de citocinas

Modelos de camundongos humanizados fornecem uma representação mais precisa do microambiente imunológico humano. Este manuscrito descreve o processo no qual esses modelos são criados por meio de um enxerto renal de timo humano, injeção de células CD34⁺ humanas e a entrega direcionada de transgenes de citocinas humanas para promover a proliferação e diferenciação de células CD34⁺ .

Os modelos animais fornecem uma tradução vital entre a pesquisa biomédica in vitro e in vivo . Modelos de camundongos humanizados fornecem uma ponte na representação de sistemas humanos, permitindo assim um estudo mais preciso da patogênese, biomarcadores e muitas outras consultas científicas. Neste método descrito, camundongos IL2Rγnull (NSG) com NOD-scid imunodeficiente são implantados com timo autólogo, injetados com células CD34⁺ derivadas do fígado, seguidas por uma série de entregas de citocinas injetadas. Em contraste com outros modelos de natureza semelhante, o modelo descrito aqui promove uma reconstituição aprimorada das células imunes, fornecendo citocinas e fatores de crescimento por meio de transgenes codificados em vetores baseados em DNA AAV8 ou pMV101. Além disso, oferece estabilidade a longo prazo com camundongos reconstituídos com uma vida útil média de 30 semanas após as injeções de CD34⁺ . Por meio desse modelo, esperamos fornecer um método estável e impactante de estudo de imunoterapia e doenças humanas em um modelo murino, demonstrando assim a necessidade de modelos pré-clínicos preditivos.

Embora os modelos animais tenham criado uma compreensão mais profunda dos sistemas celulares e moleculares, o desafio permanece em elucidar as complexidades dos sistemas específicos da espécie, como imunidade, fisiologia e outras áreas da patologia. Primatas não humanos (NHP), como chimpanzés, têm sido historicamente usados para compensar as lacunas na pesquisa de modelos; no entanto, o modelo de PNH pode ser bastante caro e inacessível, principalmente porque seu uso foi proibido na Europa¹.

Após um procedimento de enxerto bem-sucedido, o sistema murino replica o sistema imunológico humano, conforme demonstrado pelo repovoamento dos órgãos linfoides. O desenvolvimento de camundongos com sistema imunológico humano funcional oferece a oportunidade de realizar pesquisas translacionais sobre imunidade humana em uma variedade de contextos. Camundongos imunodeficientes enxertados com células e tecidos humanos que podem replicar com sucesso um sistema imunológico humano operativo facilitam o estudo da hematopoiese, imunidade, terapia gênica², doenças infecciosas³, câncer⁴ e medicina regenerativa⁵. Nosso grupo e alguns de nossos colaboradores publicaram resultados usando esse modelo que demonstra modelos pré-clínicos de melanoma cutâneo⁶. Este modelo é versátil o suficiente para ser aplicado a inúmeros campos além do contexto da pesquisa em melanoma e imunoterapia.

As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são comumente usadas para humanização, pois resultam em reconstituição robusta das células T, que estabeleceram papéis na tolerância imunológica; no entanto, devido à sua baixa taxa de auto-renovação e sua alta taxa de células maduras comprometidas com a linhagem, as PBMCs são frequentemente substituídas por produtos à base de células-tronco humanas (HSC), que podem ser derivados do fígado fetal⁷. Em combinação com esses produtos HSC derivados, a adição do implante do timo humano sob as cápsulas renais de camundongos NSG cria um sistema capaz de apoiar o desenvolvimento de células T humanas. Esse modelo, conhecido como medula óssea-fígado-timo (BLT), é altamente vantajoso porque permite hematopoiese multilinhagem, educação de células T no timo autólogo e restrição de HLA⁸.

O modelo proposto neste manuscrito é um modelo BLT modificado com entrega adicional de citocinas. As citocinas pró-inflamatórias demonstraram reforçar as habilidades das células imunes efetoras, especificamente por meio de imunoterapias baseadas em IL-15⁹. Os linfócitos CD45⁺ são observados no sangue periférico de camundongos humanizados (camundongos Hu) aproximadamente 8-12 semanas após a injeção de células CD34⁺ humanas, exibindo um aumento evidente na reconstituição em comparação com o sangue circulante de camundongos NSG regulares. Usando o vetor adeno-associado para fornecer IL-3, IL-7 e GM-CSF humanas, os níveis de células CD45 ⁺ humanas aumentaram em circulação em comparação com os camundongos que não receberam as citocinas. A adição das citocinas DNA Combo II (SCF, FLT3, CKIT e THPO) melhora as células T e a diferenciação das células mielóides¹⁰. A adição de entrega de citocinas distingue este método entre os outros modelos de camundongos Hu, conforme apoiado por dados publicados¹⁰.

O desenvolvimento desse modelo com uma resposta imune humana inata e adaptativa permitiu a publicação de dados sobre a resistência à terapia e o microambiente^{tumoral 10}. Os laboratórios fornecidos podem acessar amostras de tecido para utilizar este método; este modelo de camundongos Hu tem grande potencial para outros laboratórios estudarem campos semelhantes, bem como se expandirem para outras áreas de imunoterapia e estudos pré-clínicos.

Todos os protocolos que envolvem o uso de animais são monitorados de perto pelo Comitê Institucional de Cuidados e Usuários de Animais (IACUC) do Instituto Wistar. O laboratório segue as diretrizes estabelecidas por este comitê e pelo veterinário assistente para garantir a saúde, segurança e bem-estar dos animais envolvidos. Antes de seguir este protocolo, é necessária a aprovação do veterinário e da IACUC, e os indivíduos podem ter variações nas técnicas cirúrgicas específicas e no manejo dos animais em comparação com o protocolo, de acordo com o conselho das partes envolvidas no bem-estar animal.

NOTA: As amostras de tecido podem ser congeladas até que estejam prontas para uso. Além disso, o isolamento de CD34⁺ pode ser realizado no mesmo dia ou no dia seguinte à cirurgia de enxerto renal. Esta informação informará quando o Bussulfano será injetado: se pretende realizar a cirurgia no mesmo dia do isolamento, o Bussulfano deve ser injetado preventivamente na preparação do tecido receptor. Tratar trinta camundongos NSG fêmeas de 5 a 7 semanas de idade com 30 mg / kg (100 μL, PBS 1x) de um medicamento recém-esgotado do mielo; O bussulfano injetou IP 24 h antes da cirurgia.

1. Isolamento de células CD34⁺

1. Prepare a solução de digestão dissolvendo 100 mg de colagenase / dispase em 50 mL de RPMI1640. Use um filtro de vácuo de 0.22 μm para esterilizar a solução de digestão.
2. O fígado fetal (>20 semanas de idade) é fornecido em 50 mL de RPMI1640 meio. Aspire e descarte o meio, deixando 10 mL dentro do tubo que contém o fígado.
3. Lave o tecido com 45 mL de RPMI1640 + 100 μg/mL do antibiótico Primocin duas vezes em um tubo cônico de 50 mL, aspirando o meio entre cada lavagem. Certifique-se de deixar o tecido assentar no fundo do tubo antes de aspirar a mídia.
4. Colocar um peneiro de tecido estéril num copo esterilizado de 200 ml.
5. Despeje o fígado fetal pela peneira e use a ponta de uma seringa plástica estéril de 10 mL para triturar o tecido.
6. Lave as células hepáticas restantes na peneira usando 50 mL de RPMI1640 + 100 μg / mL do antibiótico Primocin seguido de 50 mL de RPMI1640 meio de colagenase / dispase (2 mg / mL). O béquer de 200 mL agora contém o RPMI1640 com Primocin, colagenase / dispase RPMI1640 e fígado homogeneizado.
7. Alicotar a mistura em quatro tubos cónicos de 50 ml e incubá-los em banho-maria (37 °C) durante 1 h. Agite os tubos cônicos a cada 15 min.
8. Adicione 15 mL de Ficoll em quatro tubos cônicos de 50 mL.
9. Coloque cuidadosamente a solução hepática homogeneizada por cima, distribuindo aproximadamente 35 mL entre cada tubo. Não perturbe a interface.
10. Coloque os tubos na centrífuga e gire a 800 x g por 1 h com o mínimo de aceleração/freio.
11. Remova os tubos da centrífuga e colete as células da interface (10-15 mL) em dois tubos cônicos de 50 mL.
12. Adicione PBS 1x até 50 mL para lavar o pellet e centrifugue a 300 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante.
13. Ressuspenda o pellet em 10 mL de tampão de lise ACK (cloreto de amônio-potássio) e incube por 5-10 min. Encha o tubo com 1x PBS.
14. Conte manualmente as células ao microscópio usando azul de tripano e um hemocitômetro. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min.
    NOTA: As células mononucleares do fígado podem ser injetadas diretamente daqui, se desejado, por exemplo, se a contagem de células for inferior a 50 milhões de células.
15. Aspire o PBS e ressuspenda o pellet celular em 300 μL do tampão de separação (2 mM EDTA, 5 μg/mL de BSA em 1x PBS) para 100 x 10⁶ células ou menos. Para mais de 100 x 10⁶ células, use uma proporção baseada na quantidade de células acima para determinar a quantidade de buffer (ou seja, dobre as células, dobre o buffer).
16. Adicione 100 μL de reagente bloqueador de FcR e incube por 2-5 min.
17. Adicione 100 μL de anticorpos de microesferas CD34, misture bem e incube no gelo por 30 min; agite mecanicamente com a mão após 15 min.
18. Adicione 7-10 mL do tampão de separação e filtre através de filtros de células de 100 μm, 70 μm e 40 μm nessa ordem.
19. Coloque um separador de células baseado em coluna em um separador magnético. Coloque um tubo cônico de 15 mL embaixo do separador para coletar o fluxo e o tampão.
20. Encher a coluna com 500 μL do tampão de separação.
21. Despeje a suspensão celular através da coluna.
22. Encha a coluna com o fluxo e o tampão que foram coletados no tubo cônico.
23. Lave a coluna 3 vezes com 500 μL do tampão de separação.
24. Descarte o fluxo e substitua o tubo por um tubo de poliestireno de 15 mL.
25. Encha a coluna com 1 mL do tampão de separação, remova a coluna do ímã e lave o êmbolo com um toque.
26. Conte as células e ressuspenda em 1x PBS para injeção. Coloque no gelo até usar.

2. Processamento tímico

1. Lave o timo autólogo (>20 semanas de idade) adicionando 5-8 mL de RPMI1640, deixe o tecido assentar. Remova cuidadosamente o meio por vácuo, evitando o contato com o timo. Repita isso mais uma vez.
2. Suspenda em 10 mL de RPMI1640 em temperatura ambiente com Primocin (100 μg / mL).
3. Transfira o timo para uma placa de Petri tratada com tecido. Certifique-se de que o timo esteja totalmente revestido com Primocin-media.
4. Incube por 30-45 min em temperatura ambiente.
5. Aspire o meio Primocin. Lave o timo com 5-8 mL de RPMI1640, remova o meio a vácuo e repita mais uma vez.
6. Suspenda o timo em 5-8 mL de RPMI1640.
7. Preparar o timo incubado para enxertia cortando segmentos de 1 mm x 2 mm com dois bisturis.
   NOTA: Isso será enxertado nos camundongos; portanto, certifique-se de que as fatias de timo possam ser aspiradas para dentro e para fora da seringa e da agulha Hamilton 22 G anexada com relativa facilidade.

3. Enxerto de cápsula sub-renal e injeção de células CD34

1. Examine os ratos quanto à sua saúde geral antes da cirurgia. Raspe os mouses para expor uma área (aproximadamente 3 "x 2") no corpo lateral esquerdo.
2. Anestesiar os camundongos via isoflurano (indução 5%, manutenção 2%-3%) na câmara e, em seguida, transferir camundongos individuais da câmara para um estágio cirúrgico com um cone nasal.
3. Higienize a área raspada com clorohexidina e cotonetes de preparação com álcool. Garanta a anestesia individual por meio do teste de pinça.
4. Faça uma grande incisão (5-7 mm) posterior, lateral à coluna do camundongo, e dobre a pele para trás.
5. Certifique-se de que, neste ponto, o baço esteja visível abaixo da fáscia. Faça uma incisão menor de ~ 2 mm na fáscia. Certifique-se de que a incisão seja a menor possível, permitindo que o rim fique totalmente exposto.
6. Determine a localização dessa incisão, identificando visualmente o baço e usando-o como marcador para o rim, que não é visível.
   NOTA: O rim murino está localizado atrás de um agrupamento de gordura no quadrante nordeste do baço.
7. A partir daqui, posicione a mão (cirurgião) sob o lado do mouse oposto à incisão e empurre para expor o rim. Reposicione qualquer gordura para expor totalmente o rim.
8. Utilize os dedos da mesma mão para estabilizar o rim exposto. Se necessário, use PBS 1x estéril para lubrificar o rim exposto.
   NOTA: É importante observar que o cirurgião deve usar dedos diferentes daqueles que manusearam o lado do camundongo para segurar o rim e manter a esterilidade. Consulte o veterinário do instituto sobre a manutenção adequada da esterilidade.
9. Simultaneamente, deixe o assistente preparar uma seringa romba com o tecido do timo fetal. Sugue suavemente 2-3 pedaços de timo de tamanho médio (1 mm x 2 mm) com o mínimo de meio até a ponta da agulha e, em seguida, entregue-o ao cirurgião para realizar o procedimento.
   NOTA: O número de pedaços de timo depende do tamanho do tecido, geralmente 2 pedaços são suficientes para obter camundongos humanizados.
10. Deixe o cirurgião inserir a agulha através da extremidade caudal da cápsula renal até que a extremidade distal seja alcançada (~ 2 mm), até o ponto em que a agulha seja visível, mas não rompa o lado cranial da cápsula renal. Deixe o assistente mergulhar a seringa.
11. Coloque o rim, junto com qualquer gordura exposta, de volta no peritônio. Coloque uma sutura absorvível (tamanho 4) e feche a incisão superficial com uma cola veterinária.
12. No pós-operatório, administrar uma dose do analgésico, 25 μL de buprenorfina de liberação sustentada (1 mg/mL) por injeção subcutânea (1 mg/kg).
13. Verifique se os camundongos começam a se recuperar dentro de 5 minutos após a operação.
14. Entre as gaiolas, troque as luvas e esterilize os instrumentos em um esterilizador de esferas de vidro.
15. De 1 a 3 h após a cirurgia, injete 100 μL de células CD34 ⁺ humanas (aproximadamente 100.000 células) no camundongo por injeção intravenosa (IV).
16. Realize uma verificação geral de saúde nos camundongos após concluir a cirurgia (geralmente 2 h após a primeira gaiola), depois 24 h e 48 h depois.
17. Se houver alguma anormalidade na disposição ou nos sinais vitais, monitore ainda mais os camundongos. Depois de limpar esses pontos de verificação, monitore os ratos com menos rigor (2x-3x por semana).
18. Uma semana após a cirurgia, injetar (IV) nos camundongos 100 μL de citocina humana AAV8 (IL-3, IL-7 e GM-CSF; 2 x 10⁹ cópias do genoma / mL).
19. Duas semanas após a cirurgia, realizar injeções IM do plasmídeo DNA Combo II.
    1. Use uma máquina de eletroporação para realizar injeções IM de DNA de plasmídeo Combo II: SCF, FLT3, CKIT e THPO. Para cada camundongo, combine 25 μL de SCF (2 mg / mL), 25 μL de THPO (2 mg / mL), 25 μL de FLT3 (2 mg / mL) e 25 μL de CKIT (10 mg / mL).
    2. Execute uma injeção por perna traseira, ou seja, duas no total, com 50 μL por perna, seguida de eletroporação em cada local de injeção.

Após cirurgia bem-sucedida e injeções pós-operatórias apropriadas, a diferenciação de CD34⁺ pode ser confirmada por citometria de fluxo. Aproximadamente 8 semanas após a cirurgia, os camundongos são sangrados em preparação para FACS, recorrendo a cada 2 semanas até que um limite específico de células imunes humanas seja atingido, conforme descrito anteriormente¹⁰. Resumidamente, 100 mL de sangue foram coletados em tubos de coleta de sangue revestidos com lítio e heparina. Após a lise dos glóbulos vermelhos usando tampão de lise ACK, as células foram lavadas com tampão FACS (solução salina tamponada com fosfato, 2% de FBS e 0,1% de azida sódica) e centrifugadas. O pellet celular foi então ressuspenso em 100 mL de tampão FACS e incubado com um painel de anticorpos (anti-CD45 de camundongo, anti-CD45 humano, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 e anti-CD20). Para identificar células vivas e mortas, as células foram coradas com DAPI e os linfócitos foram controlados com base nos parâmetros FSC-A e SSC-A. Uma porta foi gerada para selecionar as células vivas e, a partir destas, as células individuais. A partir dessa população de linfócitos vivos únicos, primeiro distinguimos as células CD45 ⁺ humanas das de camundongos. As células CD20⁺ e CD3⁺ foram identificadas a partir das células CD45⁺ humanas e, finalmente, as células CD4⁺ e CD8⁺ foram identificadas a partir das células CD3⁺ (células T). Para elaborar, os camundongos Hu estão prontos para serem usados em experimentos de imunoterapia quando atingirem o limiar de >25% HuCD45⁺ nos linfócitos totais e >8%-10% CD8⁺ nas células CD3⁺ humanas (Figura 1). Nos estágios iniciais da reconstituição, os níveis de CD20⁺ são altos e os níveis de CD3⁺ são baixos. À medida que as células proliferam e se reconstituem com o tempo, os níveis de CD20⁺ caem à medida que os níveis de CD3⁺ aumentam. Isso se correlaciona com quando o timo de camundongo, o baço de camundongo e o Hu-timo enxertado em cápsula renal são repovoados com células precursoras linfóides humanas que sofrem diferenciação.

Figura 1: Análise de citometria de fluxo de um camundongo reconstituído. A análise é fechada para isolar as diferentes populações de células, começando com a população total de linfócitos, distinguindo entre células vivas, células únicas e várias populações de células-tronco, com atenção específica aos CD45⁺ e CD8⁺ para verificar a proximidade dos limiares, como é relatado anteriormente¹⁰. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este manuscrito descreveu a geração de camundongos humanizados por meio de timo fetal humano enxertado sob a cápsula renal e subsequente injeção de CD34⁺ para recriar um sistema imunológico humano.

Embora o protocolo funcione para criar o melhor modelo possível, certas etapas são essenciais para a viabilidade. Por exemplo, durante o isolamento CD34⁺ , é essencial que alguém olhando ao microscópio possa identificar células CD34⁺ . Embora possa parecer redundante, as máquinas de contagem automática nem sempre identificam essas células devido à sua morfologia, e a própria máquina pode identificar erroneamente os detritos como células positivas. Portanto, é crucial identificar essas células manualmente. Além disso, é essencial confirmar que o timo está realmente entrando na cápsula renal durante a cirurgia de enxerto renal. Isso pode ser visualizado ou palpado: o cirurgião deve ser capaz de sentir os pedaços de timo entrando no rim.

É importante ressaltar que o processo tem algumas ressalvas que podem determinar o sucesso do modelo. A primeira é que a qualidade do tecido fetal deve ser avaliada individualmente para determinar se as células isoladas podem ser potencialmente tóxicas para o camundongo. Por exemplo, o tecido com mais de 20 semanas parece mais firme e corta com mais precisão durante o preparo. Geralmente há menos degradação. Essas qualidades são indicadores gerais de tecido de melhor calibre. Uma segunda ressalva da técnica diz respeito à quantidade e qualidade das células CD34⁺ ; O número de células produzidas é variável e às vezes pode não fornecer o suficiente para injeções. Nesses casos, é possível contornar o problema injetando as células mononucleares do fígado isoladas anteriormente no protocolo. Em terceiro lugar, após a implementação de um modelo bem-sucedido, os camundongos podem começar a desenvolver a doença do enxerto contra o hospedeiro (GVH) por volta das 25 semanas de idade. Embora o modelo possa durar até 30 semanas, é em torno de 25 semanas que os investigadores devem prestar muita atenção às mudanças na pontuação corporal, perda de cabelo e desconforto facial com aparência de camundongos. Nesse ponto, deve-se sempre consultar o veterinário assistente, determinar a qualidade de vida e atender os camundongos conforme ditado ou sacrificar.

A principal diferença entre este protocolo e outros modelos humanizados é o uso de citocinas para melhorar a proliferação e estabilização das células hematopoiéticas primeiro e depois aumentar a diferenciação das células imunes. Os efeitos do uso das citocinas são abordados pelo aumento dos níveis de células CD45⁺ humanas na circulação sanguínea periférica de camundongos e auxiliam na diferenciação de células T e células mieloides em comparação com aqueles camundongos sem citocinas, conforme relatado anteriormente¹⁰.

Em resumo, o modelo descrito fornece a um camundongo humanizado uma vida útil estável e recapitulação funcional das células imunes humanas. O modelo pode ser recriado por outros em um esforço para estudar uma infinidade de questões relacionadas à imunoterapia, pesquisa viral, medicina regenerativa e vários campos além desses contextos.

Os autores declaram não haver interesses conflitantes com este manuscrito.

Obrigado à Wistar Flow-Cytometry, Molecular Screening, Vector Core e Animal Facility por seu apoio. Este trabalho foi possível com o apoio da Fundação de Pesquisa Médica Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson.