胸腺腎カプセル移植、CD34⁺ 細胞注入、およびサイトカイン送達によるヒト化マウスの作製

ヒト化マウスモデルは、ヒトの免疫微小環境をより正確に表現します。この原稿では、ヒト胸腺の腎移植、ヒトCD34⁺ 細胞の注入、およびCD34⁺ 細胞の増殖と分化を促進するためのヒトサイトカイン導入遺伝子の標的送達を通じて、これらのモデルが作られるプロセスについて説明しています。

動物モデルは、 in vitro と in vivo の生物医学研究の間の重要な翻訳を提供します。ヒト化マウスモデルは、ヒトシステムの表現における架け橋となり、病因、バイオマーカー、その他多くの科学的研究をより正確に行うことができます。記載されているこの方法では、免疫不全NOD−scid IL2Rγnull(NSG)マウスに自家胸腺を移植し、肝臓由来のCD34⁺ 細胞を注入した後、一連のサイトカイン送達を注入する。同様の性質の他のモデルとは対照的に、ここで説明するモデルは、AAV8またはpMV101 DNAベースのベクターにコードされた導入遺伝子を介してサイトカインおよび成長因子を送達することにより、免疫細胞の再構成の改善を促進します。さらに、再構成マウスの平均寿命がCD34⁺ 注射後30週間で、長期的な安定性を提供します。このモデルを通じて、マウスモデルで免疫療法とヒト疾患を研究するための安定した影響力のある方法を提供し、予測的な前臨床モデルの必要性を実証したいと考えています。

動物モデルによって細胞系や分子系への理解が深まった一方で、免疫、生理学、その他の病理学領域など、種特異的なシステムの複雑さを解明するという課題が残っています。チンパンジーなどの非ヒト霊長類(NHP)は、歴史的にモデル研究の不足を補うために使用されてきました。ただし、NHPモデルは非常に高価で、特にヨーロッパでは使用が禁止されているため、アクセスできない場合があります¹。

移植手術が成功した後、マウス系は、リンパ器官の再増殖を通じて実証されるように、ヒトの免疫系を複製します。ヒト免疫系が機能しているマウスの開発は、さまざまな状況でヒト免疫に関するトランスレーショナルリサーチを行う機会を提供します。ヒトの細胞や組織を生着させた免疫不全マウスは、機能しているヒトの免疫系をうまく複製することができ、造血、免疫、遺伝子治療²、感染症³、がん⁴、再生医療⁵の研究を促進します。私たちのグループと一部の共同研究者は、皮膚黒色腫⁶ の前臨床モデルを示すこのモデルを使用した結果を発表しました。このモデルは、メラノーマや免疫療法の研究の文脈を超えて、無数の分野に適用できる汎用性を備えています。

末梢血単核細胞(PBMC)は、免疫寛容の役割を確立したT細胞の堅牢な再構成をもたらすため、ヒト化に一般的に使用されます。しかし、PBMCは自己複製率が低く、成熟した系統コミット細胞の割合が高いため、胎児の肝臓^に由来するヒト幹細胞(HSC)ベースの製品に置き換えられることがよくあります7。これらの派生HSC産物と組み合わせることで、NSGマウスの腎臓嚢の下にヒト胸腺を移植することで、ヒトT細胞の発生をサポートできるシステムが構築されます。骨髄-肝臓-胸腺(BLT)として知られるこのモデルは、多系統の造血、自家胸腺のT細胞教育、およびHLA制限を可能にするため、非常に有利^です8。

この原稿で提案されているモデルは、サイトカイン送達が追加された改変BLTモデルです。炎症誘発性サイトカインは、特にIL-15ベースの免疫療法を通じて、エフェクター免疫細胞の能力を強化することが示されています⁹。ヒトCD34⁺細胞注入の約8-12週間後にヒト化マウス(Hu-mice)の末梢血中にCD45⁺リンパ球が観察され、通常のNSGマウスの循環血液と比較して再構成が明らかに増加していることが示されています。アデノ随伴ベクターを使用してヒトIL-3、IL-7、およびGM-CSFを送達すると、ヒトCD45⁺細胞のレベルは、サイトカインを投与されないマウスと比較して循環が増加しました。DNA Combo IIサイトカイン(SCF、FLT3、CKIT、およびTHPO)の添加により、T細胞および骨髄細胞の分化が改善されます¹⁰。サイトカイン送達の追加は、公開されたデータ¹⁰によって裏付けられているように、この方法を他のHuマウスモデルと区別する。

自然的で適応的なヒト免疫応答を持つこのモデルの開発により、治療抵抗性と腫瘍微小環境に関するデータを公開することができました¹⁰。ただし、ラボはこの方法を利用するために組織サンプルにアクセスできます。このHuマウスモデルは、他の研究室が同様の分野を研究するだけでなく、免疫療法や前臨床研究の他の分野にも拡大する大きな可能性を秘めています。

動物の使用を含むすべてのプロトコルは、ウィスター研究所の動物管理およびユーザー委員会(IACUC)によって綿密に監視されています。研究所は、この委員会と担当獣医師が定めたガイドラインを遵守し、関係する動物の健康、安全、福祉を確保しています。このプロトコルに従う前に、獣医師とIACUCの承認が必要であり、動物福祉に関与する前述の関係者のアドバイスに従って、個々の個人がプロトコルと比較して特定の外科的技術と動物の取り扱いにばらつきを持つ場合があります。

注:組織サンプルは、使用する準備ができるまで凍結できます。さらに、CD34⁺ の単離は、腎移植手術と同じ日または翌日に行うことができます。この情報は、ブスルファンがいつ注射されるかを知らせます:隔離と同じ日に手術を行う予定の場合、ブスルファンは組織を受け取る準備として先制的に注射されるべきです。30匹の雌の5〜7週齢のNSGマウスを、新しく作られた骨髄枯渇薬の30 mg / kg(100μL、PBS 1x)で治療します。ブスルファンは手術の24時間前にIPを注射しました。

1. CD34⁺ 細胞の単離

1. 100 mgのコラゲナーゼ/ディスパーゼを50 mLのRPMI1640に溶解して消化溶液を調製します。0.22 μmの真空フィルターを使用して、消化液を滅菌します。
2. 胎児の肝臓(>20週齢)は、50mLのRPMI1640培地で提供されます。.培地を吸引して廃棄し、肝臓の入ったチューブ内に10mLを残します。
3. 組織を45 mLのRPMI1640 + 100 μg/mLの抗生物質プリモシンで50 mLのコニカルチューブで2回洗浄し、各洗浄の間に培地を掃除機で吸い取ります。メディアを掃除機で吸い取る前に、必ず組織をチューブの底に落ち着かせてください。
4. 滅菌組織ふるいを200mLの滅菌ビーカーに入れます。
5. 胎児の肝臓をふるいに通し、10mLの滅菌プラスチック注射器の端を使用して組織を粉砕します。
6. ふるいに残っている肝細胞を、50 mLのRPMI1640 + 100 μg/mLの抗生物質Primocin、続いて50 mLのRPMI1640コラゲナーゼ/ディスパーゼ培地(2 mg/mL)を使用してすすぎます。200mLのビーカーには、プリモシン、RPMI1640コラゲナーゼ/ジスパーゼ、均質化された肝臓を含むRPMI1640が含まれています。
7. 混合物を4本の50 mLコニカルチューブに分注し、水浴(37°C)で1時間インキュベートします。15分ごとに円錐形のチューブを振ってください。
8. 50 mLのコニカルチューブ4本に15 mLのFicollを加えます。
9. 均質化された肝臓溶液を慎重に重ね、各チューブ間に約35 mLを分配します。インターフェースを邪魔しないでください。
10. チューブを遠心分離機に入れ、800 x g で1時間回転させ、加速/ブレーキを最小限に抑えます。
11. 遠心分離機からチューブを取り外し、界面(10〜15 mL)から細胞を2本の50 mLコニカルチューブに集めます。
12. PBSを1回最大50mLまで加えてペレットを洗浄し、300 x g で5分間遠心分離します。上清を捨てます。
13. ペレットを10 mLのACK(Ammonium-Chloride-Potassium)溶解緩衝液に再懸濁し、5〜10分間インキュベートします。チューブに1xPBSを入れます。
14. トリパンブルーと血球計算盤を使用して、顕微鏡下で細胞を手動でカウントします。細胞を300 x g で5分間遠心分離します。
    注:肝臓単核細胞は、細胞数が5000万細胞未満の場合など、必要に応じてここから直接注入できます。
15. PBSを真空引きし、細胞ペレットを分離バッファー300 μL(2 mM EDTA、1x PBS中の5 μg/mL BSA)に再懸濁して、100 x^{10 6} 細胞以下について調製します。100 x 10⁶ セルを超える場合は、上記のセル量に基づく比率を使用してバッファーの量を決定します(つまり、セルを2倍にし、バッファーを2倍にします)。
16. 100 μLのFcRブロッキング試薬を添加し、2〜5分間インキュベートします。
17. 100 μLのCD34マイクロビーズ抗体を加え、よく混合して氷上で30分間インキュベートします。15分後に手で機械的に振とうします。
18. 7〜10 mLの分離バッファーを加え、100 μm、70 μm、40 μmのセルストレーナの順にろ過します。
19. カラムベースのセルセパレーターをマグネティックセパレーターに入れます。セパレーターの下に15 mLの円錐チューブを置き、フロースルーとバッファーを収集します。
20. カラムに500 μLの分離バッファーを充填します。
21. 細胞懸濁液をカラムに注ぎます。
22. コニカルチューブに集められたフロースルーとバッファーをカラムに充填します。
23. カラムを500 μLの分離バッファーで3回洗浄します。
24. フロースルーを廃棄し、チューブを15mLポリスチレンチューブと交換します。
25. カラムに分離バッファー 1 mL を充填し、カラムを磁石から取り出し、プランジャーを 1 回のプッシュで洗い流します。
26. 細胞をカウントし、1x PBSに再懸濁して注射します。使用するまで氷の上に置きます。

2.胸腺処理

1. 自家胸腺(>20週齢)を5〜8mLのRPMI1640を加えて洗浄し、組織を落ち着かせます。胸腺との接触を避けながら、真空で培地を慎重に取り出します。これをもう一度繰り返します。
2. 10 mLの室温RPMI1640にプリモシン(100 μg/mL)で懸濁します。
3. 胸腺を組織処理したペトリ皿に移します。胸腺がプリモシン培地で完全にコーティングされていることを確認してください。
4. 室温で30〜45分間インキュベートします。
5. プリモシン培地を掃除機で吸い取ります。胸腺を5〜8mLのRPMI1640で洗い、媒体を真空で取り除き、これをもう一度繰り返します。
6. 胸腺を5〜8mLのRPMI1640に懸濁します。
7. 2つのメスを使用して1 mm x 2 mmのセグメントをスライスすることにより、移植用のインキュベート胸腺を準備します。
   注:これはマウスに移植されます。したがって、胸腺スライスをシリンジと付属の22Gハミルトン針の内外で比較的簡単に掃除機をかけることができることを確認してください。

3. 腎下カプセル移植とCD34細胞注入

1. 手術前にマウスの一般的な健康状態を調べてください。マウスを剃って、左側の体の外側の領域(約3 "x 2")を露出させます。
2. チャンバー内でイソフルラン(誘導5%、維持2%-3%)を介してマウスを麻酔し、次に個々のマウスをチャンバーからノーズコーンを備えた手術段階に移します。
3. 剃った部分をクロロヘキシジンとアルコール調製綿棒で消毒します。ピンチテストで個々の麻酔を確認します。
4. マウスの背骨の外側、後方に大きな切開(5〜7 mm)を行い、皮膚を折り返します。
5. この時点で、脾臓が筋膜の下に見えることを確認します。筋膜に~2mmの切開を小さくします。腎臓が完全に露出するようにしながら、切開部ができるだけ小さくなるようにしてください。
6. この切開の位置を決定し、脾臓を視覚的に識別し、目に見えない腎臓のマーカーとして使用します。
   注:マウスの腎臓は、脾臓の北東象限の脂肪のグループの後ろにあります。
7. ここから、手(外科医)を切開部の反対側のマウスの側の下に置き、腎臓を露出させるために押します。腎臓が完全に露出するように脂肪を再配置します。
8. 同じ手の指を使って、露出した腎臓を安定させます。必要に応じて、滅菌済みの1x PBSを使用して、露出した腎臓を潤滑します。
   注:外科医は、無菌性を維持するために腎臓を保持するために、マウスの側を扱った指とは異なる指を使用する必要があることに注意することが重要です。無菌性の適切な維持については、研究所の獣医師に相談してください。
9. 同時に、助手に胎児胸腺組織で鈍い注射器を準備させます。中型の胸腺の塊(1 mm x 2 mm)を2〜3個、最小限の媒体で針の先端まで優しく吸い上げ、それを外科医に渡して手順を行います。
   注:胸腺のチャンクの数は組織のサイズによって異なりますが、通常、ヒト化マウスを得るには2チャンクで十分です。
10. 外科医は、遠位端(~2 mm)に達するまで、腎臓嚢の尾側から針を挿入し、針が見える点まで挿入しますが、針は腎臓嚢の頭蓋側を突き破りません。アシスタントに注射器を突っ込ませます。
11. 腎臓を露出した脂肪と一緒に腹膜に戻します。吸収性縫合糸(サイズ4)を1つ入れ、獣医用ボンド接着剤で表面的な切開を閉じます。
12. 術後、鎮痛薬である徐放性ブプレノルフィン 25 μL (1 mg/mL) を皮下注射 (1 mg/kg) で投与します。
13. マウスが術後5分以内に回復し始めることを確認してください。
14. ケージ間で手袋を交換し、ガラスビーズ滅菌器で器具を滅菌します。
15. 手術後1〜3時間後から、ヒトCD34⁺ 細胞100μL(約100,000細胞)をマウスに静脈内(IV)注射して注射します。
16. 手術終了後(通常は最初のケージの2時間後)、次に24時間後と48時間後にマウスの一般的な健康診断を実施します。
17. 気質やバイタルサインに異常がある場合は、マウスをさらに監視してください。これらのチェックポイントをクリアしたら、マウスの監視をそれほど厳しくしないでください(週に2〜3回)。
18. 手術の1週間後、マウスに100μLのAAV8ヒトサイトカイン(IL-3、IL-7、およびGM-CSF;2 x 10⁹ ゲノムコピー/mL)を注入(IV)します。
19. 手術の2週間後、プラスミドDNA Combo IIのIM注射を行います。
    1. エレクトロポレーション装置を使用して、プラスミドDNAコンボII(SCF、FLT3、CKIT、およびTHPO)のIM注入を行います。各マウスについて、25 μLのSCF(2 mg/mL)、25 μLのTHPO(2 mg/mL)、25 μLのFLT3(2 mg/mL)、および25 μLのCKIT(10 mg/mL)を組み合わせます。
    2. 後肢ごとに 1 回、つまり合計 2 回の注射を片足あたり 50 μL で行い、その後、各注射部位にエレクトロポレーションを行います。

手術が成功し、適切な術後注射が行われた後、CD34⁺の分化はフローサイトメトリーによって確認することができます。手術の約8週間後、マウスはFACSに備えて出血させ、前述のようにヒト免疫細胞の特定の閾値が満たされるまで2週間ごとに再発する¹⁰。簡単に説明すると、リチウムとヘパリンでコーティングされた採血管に100mLの血液を採取しました。ACK溶解バッファーを使用して赤血球を溶解した後、細胞をFACSバッファー(リン酸緩衝生理食塩水、2%FBS、および0.1%アジ化ナトリウム)で洗浄し、遠心分離しました。次いで、細胞ペレットを100mLのFACS緩衝液に再懸濁し、抗体(抗マウスCD45、抗ヒトCD45、抗CD3、抗CD4、抗CD8、および抗CD20)のパネルとインキュベートした。生細胞と死細胞を同定するために、細胞をDAPIで染色し、FSC-AおよびSSC-Aパラメータに基づいてリンパ球をゲートしました。生細胞を選択し、それらから単一細胞を選択するためのゲートが生成されました。これらの単一の生きたリンパ球集団から、まずヒトとマウスのCD45⁺細胞を区別しました。ヒトCD45⁺細胞からCD20⁺およびCD3⁺細胞を同定し、最後に、CD3⁺細胞(T細胞)からCD4⁺およびCD8⁺細胞を同定した。詳しく説明すると、Huマウスは、全リンパ球で>25%のHuCD45⁺、ヒトCD3⁺細胞で>8%〜10%のCD8⁺の閾値に達すると、免疫療法実験に使用する準備が整います(図1)。再構成の初期段階では、CD20⁺レベルは高く、CD3⁺レベルは低くなります。細胞が時間とともに増殖し、再構成されると、CD3⁺のレベルが上昇すると、CD20⁺のレベルは低下します。これは、マウスの胸腺、マウスの脾臓、および腎嚢移植されたHu-thymusに、分化を受けるヒトリンパ系前駆細胞が再増殖するタイミングと相関しています。

図1:再構成マウスのフローサイトメトリー解析。 この分析は、リンパ球の全集団から始めて、生細胞、単一細胞、およびCD45⁺ およびCD8⁺ に特に注意を払ってさまざまな幹細胞集団を区別し、以前に報告されているように、閾値への近接性を確認するために、細胞の異なる集団を分離するようにゲート化されています¹⁰。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

本稿では、腎嚢の下に移植されたヒト胎児胸腺を介してヒト化マウスを作製し、その後のCD34⁺ 注射によりヒト免疫系を再作成することを記載しています。

プロトコルは可能な限り最良のモデルを作成するように機能しますが、生存可能性には特定のステップが不可欠です。例えば、CD34⁺ の単離中、顕微鏡を覗くことでCD34⁺ 細胞を同定できることが不可欠です。冗長に思えるかもしれませんが、自動計数機は、その形態のためにこれらの細胞を常に識別するわけではなく、機械自体が破片を陽性細胞と誤認する可能性があります。したがって、これらの細胞を手動で識別することが重要です。さらに、腎移植手術中に胸腺が本当に腎臓嚢に入っていることを確認することが不可欠です。これは視覚化または触診することができます:外科医は腎臓に入る胸腺の部分を感じることができるべきです。

重要なのは、このプロセスには、モデルの成功を決定できるいくつかの注意点があることです。1つ目は、分離された細胞がマウスに対して潜在的に毒性があるかどうかを判断するために、胎児組織の品質を個別に評価する必要があるということです。例えば、20週齢以上の組織は、調製中により硬く見え、より正確に切断されます。一般的に劣化は少なくなります。これらの品質は、より優れた口径の組織の一般的な指標です。この技術の2番目の注意点は、CD34⁺ 細胞の量と質に関するものです。産生される細胞の数は変動し、時には注射に十分な量が得られない場合があります。これらの場合、プロトコルの早い段階で単離された肝臓単核細胞を注入することにより、問題を回避することが可能です。第三に、成功したモデルの実装後、マウスは生後25週頃から移植片対宿主病(GVH)を発症し始める可能性があります。モデルは最大30週間持続する可能性がありますが、研究者がボディスコアのマウスのような変化、脱毛、顔面の苦痛に細心の注意を払う必要があるのは約25週間です。この点については、常に主治医に相談し、生活の質を判断し、指示どおりにマウスの世話をするか、安楽死させる必要があります。

このプロトコルと他のヒト化モデルとの主な違いは、最初に造血細胞の増殖と安定化を改善し、次に免疫細胞の分化を促進するためにサイトカインを使用することです。サイトカインの使用の影響は、マウス末梢血循環中のヒトCD45⁺ 細胞のレベルの増加によって対処され、以前に報告されたように、サイトカインを持たないマウスと比較してT細胞および骨髄細胞の分化を助けます¹⁰。

要約すると、記載されたモデルは、ヒト化マウスにヒト免疫細胞の安定した寿命および機能的な再現を提供する。このモデルは、免疫療法、ウイルス研究、再生医療、およびこれらのコンテキストを超えた多数の分野に関連する無数の問題を研究するために、他の人が再現することができます。

著者らは、この原稿と競合する利益がないことを宣言しています。

Wistar Flow-Cytometry、Molecular Screening、Vector Core、Animal Facilityのご支援に感謝いたします。この研究は、ミリアム博士とシェルドンG.アデルソン医学研究財団の支援を受けて可能になりました。