Получение макрофагов из моноцитов человека для оценки скорости инфицирования Leishmania braziliensis и врожденного иммунного ответа хозяина

Этот протокол описывает процесс получения макрофагов человека из моноцитов для инфицирования Leishmania braziliensis. Это также позволяет исследователям оценивать частоту инфекции и жизнеспособность паразитов, продукцию АФК с помощью флуоресцентной микроскопии и выработку медиаторов воспаления в надосадочной жидкости культуры для изучения реакции макрофагов на инфекцию.

Макрофаги являются многофункциональными клетками, необходимыми для функционирования иммунной системы, и основной клеткой-хозяином при инфекции Leishmania braziliensis (Lb). Эти клетки специализируются на распознавании микроорганизмов и фагоцитозе, но также активируют другие иммунные клетки и присутствующие антигены, а также способствуют воспалению и восстановлению тканей. В этой статье мы описываем протокол получения мононуклеарных клеток из периферической крови (PBMC) здоровых доноров для разделения моноцитов, которые затем дифференцируются в макрофаги. Затем эти клетки могут быть инфицированы in vitro в различных концентрациях Lb для оценки способности контролировать инфекцию, а также для оценки иммунного ответа клетки-хозяина, который может быть измерен несколькими методами. PBMC сначала выделяли центрифугированием с градиентом Фиколла-Гипака, а затем покрывали пластинами, чтобы моноциты могли прилипать к культуральным планшетам; Неадгезивные клетки удаляли путем промывки. Затем адгезивные клетки культивировали макрофагально-колониестимулирующим фактором (M-CSF) в течение 7 дней для индуцирования дифференцировки макрофагов. Мы предлагаем наносить 2 x 10⁶ клеток на лунку на 24-луночные планшеты с целью получения 2 x 10⁵ макрофагов. Полностью дифференцированные макрофаги могут быть инфицированы Lb в течение 4 или 24 часов. Этот протокол приводит к значительному проценту инфицированных клеток, который можно оценить с помощью оптической или флуоресцентной микроскопии. Помимо индекса заражения, паразитарную нагрузку можно измерить, подсчитав количество паразитов внутри каждой клетки. Дальнейшие молекулярные и функциональные анализы также могут быть выполнены в культуральных надосадочных зонтах или внутри самих макрофагов, что позволяет применять этот протокол в различных контекстах, а также адаптировать к другим внутриклеточным видам паразитов.

Внутриклеточный простейший паразит рода Leishmania является возбудителем забытого комплекса заболеваний, известного как лейшманиоз¹. Эти тропические болезни имеют широкий спектр клинических проявлений, которые могут варьироваться от поражений кожи до осложнений, возникающих в результате висцеральной формы заболевания, которые при отсутствии лечения могут привести к летальному исходу. Кожный лейшманиоз (КЛ) является наиболее частой формой лейшманиоза и характеризуется одним или несколькими изъязвленными поражениями кожи с обострением хронического воспаления². Развитие заболевания зависит от вида Leishmania, в дополнение к комбинации факторов, связанных с иммунным ответом хозяина, которые определяют клинические исходы ^3,4. Leishmania braziliensis является основным видом, вызывающим CL в Бразилии, при этом случаи зарегистрированы во всех штатах страны⁵. Иммунный ответ против L. braziliensis считается защитным, поскольку он ограничивает паразита до места инокуляции, и включает несколько типов иммунных клеток, таких как макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты ^4,6,7.

Макрофаги являются многофункциональными клетками, необходимыми для иммунной системы, поскольку они специализируются на обнаружении и фагоцитозе микроорганизмов, а также могут представлять антигены и активировать другие типы клеток. Макрофаги способны регулировать процессы от воспаления до восстановления тканей и поддержания гомеостаза ^8,9. Эти клетки играют важную роль в раннем иммунном ответе против внутриклеточных паразитов, таких как Leishmania, что важно для их уничтожения 10,11,12.

Во время инфекции L. braziliensis макрофаги могут реагировать с помощью различных механизмов элиминации паразита, таких как производство активных форм кислорода (АФК) и медиаторов воспаления^13,14. Иммунные реакции могут определяться выработкой провоспалительных или противовоспалительных цитокинов, которые способствуют обострению воспалительного состояния или процессам восстановления тканей ^6,15,16. Пластичность макрофагов имеет основополагающее значение для иммунопатогенеза КЛ, а также для взаимодействия паразита и хозяина, и эти клетки считаются критически важными для выяснения механизмов заболевания и разработки новых терапевтических подходов.

Поскольку ХЛ является сложным заболеванием, исследования требуют от исследователей изучения типов клеток, которые имитируют те, которые обнаружены у человека. Иммунные реакции, наблюдаемые в различных экспериментальных моделях, могут варьироваться и давать результаты, которые не отражают иммунный ответ, наблюдаемый у естественно инфицированных людей. Таким образом, представленный здесь протокол был разработан для изучения макрофагов человека и их иммунных реакций во время КЛ, вызванных L. braziliensis.

Институциональный наблюдательный совет по этике в исследованиях человека при Институте Гонсалу Мониша (Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Сальвадор, Баия-Бразилия) одобрил это исследование (номер протокола: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Изоляция МПМП человека

1. Убедитесь, что образцы крови, градиент плотности 1,077 г/мл (например, Ficoll-Histopaque) и солевой раствор имеют комнатную температуру.
2. Образцы крови разбавляют физиологическим раствором в соотношении 1:1.
3. Перенесите 10-12 мл градиента плотности в пробирки объемом 50 мл.
4. Осторожно наложите до 40 мл разбавленной крови на градиент плотности. Отделите слои градиента крови и плотности.
5. Первое центрифугирование: центрифужные пробирки, содержащие слои крови и градиента плотности при 400 x g в течение 30 мин при 24 ºC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выключите тормоз перед запуском центрифуги.
6. Удалите плазму над кольцом PBMC с помощью пипетки (охристый слой оболочки расположен между плазмой и слоями градиента плотности; ниже него находятся эритроциты/гранулы гранул гранул эритроцитов).
7. Перенесите облачный слой PBMC (слой охристого покрытия) с помощью пипетки в пробирку объемом 15 мл и заполните холодным физиологическим раствором (храните на льду или при температуре 4 °C).
8. Второе центрифугирование: центрифужные пробирки при давлении 300 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
9. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу, заполнив трубку холодным физиологическим раствором.
10. Третье центрифугирование: центрифужные пробирки при давлении 250 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
11. Выбросьте надосадочную жидкость и снова суспендируйте гранулу, заполнив трубку холодным физиологическим раствором.
12. Четвертое центрифугирование: центрифугирование пробирки при давлении 200 x g в течение 10 мин при 4 °C с включенным тормозом.
13. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл холодной среды RPMI.
14. Подсчитайте ячейки, чтобы определить количество полученных ячеек.

2. Дифференцировка в макрофаги человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Для 24-луночного планшета рассчитайте общее количество клеток, необходимое для планшета 2 x 10⁶ клеток на лунку, что даст 2 x 10⁵ макрофагов. Этот выход основан на среднем 10% моноцитов в крови человека. В качестве альтернативы, моноциты также могут быть высвобождены неферментативными методами, а затем подсчитаны для осаждения.

1. На 24-луночную пластину поместите на дно каждой лунки круглые стеклянные покровные стекла диаметром 13 мм. Наложите эквивалент 2×10⁶ клеток в 1 мл РПМИ неполного состава на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте количество клеток в каждой лунке, так как завышенное количество может препятствовать адгезии клеток и поставить под угрозу культивирование. Кроме того, все покровные стекла должны быть чистыми и стерильными.
2. Инкубируйте планшеты в течение 30 минут при 37 ºC при 5%_CO2 для адгезии клеток.
3. Удалите надосадочную жидкость и промойте один раз 0,9% физиологическим раствором при комнатной температуре, чтобы удалить любые неадгезивные клетки.
4. После промывания удалите физиологический раствор и добавьте в каждую лунку 250 μл дополненной среды RPMI комнатной температуры (10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 μг/мл стрептомицина и 50 нг/мл M-CSF).
5. Инкубируйте клетки в течение 7 дней при 37 ºC при 5%_CO2.
   1. Добавляйте 125 мкл добавленной среды RPMI в каждую лунку каждые два дня. В конце дифференцировки клеток конечный объем составит 500 мкл на лунку.
   2. Чтобы проанализировать жизнеспособность клеток, параллельно проведите еще одну культуру на 96-луночном планшете (2 x 10⁵ на лунку).
   3. После дифференцировки в макрофаги (7 дней) добавьте 20 мкл реагента AlamarBlue.
   4. Через 7 часов инкубации считывают показания планшетов на спектрофотометре на длинах волн 570 нм и 600 нм.

3. Бактериологическое исследование и инфекция лейшмании

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе использовались промастиготы L. braziliensis из двух разных штаммов (MHOM/BR/01/BA788 и MHOM/BR88/BA-3456).

1. Подсчитайте Lb паразитов и рассчитайте объем, чтобы получить 5 x 10⁵/мл паразитов.
2. Приготовьте с добавок среду Schneider's Insect (10% FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина).
3. Инкубировать паразитов в общем объеме 5 мл в инкубаторе с температурой 24 ºC до достижения стационарной фазы (от 4 до 6 дней).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подсчитывайте паразитов каждый день, чтобы оценить рост.
4. После достижения стационарной фазы центрифугируйте культуры Leishmania при 100 x g в течение 10 минут при 4 ºC, чтобы удалить всех мертвых паразитов (осажденных на дне пробирки).
5. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугуйте при давлении 1 800 x g в течение 10 минут при 4 ºC для извлечения жизнеспособных паразитов. Выбросьте надосадочную жидкость.
6. Повторно суспендируйте гранулу с 1 мл добавленной среды RPMI для подсчета паразитов.
7. Рассчитайте количество паразитов, чтобы получить соотношение паразит:клетка 10:1. Перенесите паразитов в культуральные планшеты, содержащие макрофаги, предварительно культивированные в дополненной среде RPMI (~300 мкл/лунка) при комнатной температуре.
8. Удалите надосадочную жидкость из каждой лунки, содержащей дифференцированные макрофаги.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как можно скорее замените среду в каждой лунке, чтобы клетки не проводили длительные периоды без среды. Мы предлагаем удалять и заменять среду в трех лунках за один раз.
9. Перенесите рассчитанное количество Lb в каждую лунку, содержащую дифференцированные макрофаги.
10. Заражайте клетки в течение 4 или 24 часов при температуре 37 ºC при 5%_CO2.
    1. Через 4 часа промойте макрофаги 3 раза физиологическим раствором комнатной температуры, чтобы удалить любых неинтернализованных паразитов.
    2. В течение 24-часового периода заражения добавьте по 300 мкл добавленной среды RPMI в каждую лунку после промывки, а затем повторно инкубируйте еще 20 часов при 37 °C при 5%_CO2.
11. Удалите надосадочную жидкость для измерения медиаторов воспаления с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), следуя инструкциям производителя.
    1. Собранную надосадочную жидкость центрифугировать при 1800 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Эта процедура проводится для удаления любых неинтернализованных паразитов. Надосадочная жидкость может быть заморожена и храниться при температуре -80^°C до момента проведения будущего анализа.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть использованы для оценки уровня инфекции, жизнеспособности паразитов или продукции АФК.

4. Оценка инфекции

1. Количественная оценка уровня инфицирования
   1. Добавьте по 300 мкл метанола в каждую лунку после удаления надосадочной жидкости. Дайте 15 минут закрепить ячейки, прилипшие к покровным стеклам.
   2. Снимите покровные стекла с лунок и положите на подставку, чтобы замочить в растворе для окрашивания клеток (например, Quick Panoptic 2) на 1 минуту.
   3. Дважды погрузите покровные стекла в раствор для окрашивания клеток (например, Quick Panoptic 3) и подождите, пока они высохнут.
   4. Поместите 15 μL монтажного носителя (например, Entellan) на предметные стекла, а затем наденьте на носитель покровные стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все макрофаги, прикрепленные к покровным стеклам, должны находиться в контакте с монтажной средой.
   5. Подсчитайте 100 клеток случайным образом под оптическим микроскопом с помощью 100-кратного объектива, чтобы количественно оценить скорость инфицирования и количество интернализованных амастиготов.
2. Жизнеспособность паразитов
   1. Через 4 часа заражения промойте клетки физиологическим раствором комнатной температуры 3 раза.
   2. Добавьте 300 мкл добавленной среды Schneider's Insect.
   3. Инкубируйте в инкубаторе с температурой 24 ºC.
   4. Количественно оценивайте рост паразитов через 48, 72, 96 и 120 часов.

5. Оценка продукции АФК методом флуоресцентной микроскопии

1. После периода заражения удалите надосадочную жидкость и промойте клетки 500 мкл физиологического раствора.
2. Добавьте в каждую лунку по 300 мкл реагента флуорогенного зонда (например, зеленого реагента CellROX в концентрации 5 мкМ).
3. Инкубируйте клетки в течение 30 минут при 37 ºC и 5%_CO2.
4. Промойте ячейки 3 раза 500 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS).
5. Зафиксируйте клетки 300 мкл 3,7% формальдегида и оставьте на 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте сигнал цветения в течение 24 часов.
6. Добавьте 5 μЛ окрашивающего агента DAPI (например, DAPI ProLong Gold antifade) для окрашивания клеток. Поместите покровное стекло с поверхностью, содержащей макрофаги, в непосредственный контакт с красителем DAPI.
7. Анализ сигнала флуоресценции с помощью флуоресцентной микроскопии на длине волны возбуждения 485/520 нм.
8. Рассчитайте скорректированную общую флуоресценцию клеток (CTCF) по 30 ячейкам для каждого покровного стекла с помощью ImageJ.
   CTCF = Интегрированная плотность (Площадь выбранной ячейки x Средняя флуоресценция фоновых показаний)

6. Статистический анализ

1. Используйте тест Манна-Уитни для сравнения двух групп с непарными выборками. Выполняйте статистический анализ с помощью GraphPad Prism 7.0. Учитывайте статистически значимые различия при p < 0,05.

Понимание взаимодействия паразитов и клеток хозяина имеет решающее значение для выяснения механизмов, участвующих в патогенезе некоторых заболеваний. Несмотря на то, что культивируемые клетки человека используются реже из-за ограничений клеточной культуры по сравнению с клеточными линиями, представленный здесь протокол демонстрирует надежную и воспроизводимую дифференцировку макрофагов человека. Этот протокол позволяет анализировать несколько аспектов иммунного ответа и клеточной биологии, от выработки медиаторов воспаления до восприимчивости к инфекционному агенту в макрофагах человека.

Первым доказательством того, что происходит клеточная дифференцировка, является морфология макрофагов (рис. 1А). В день посева клетки округлые и мелкие по сравнению с морфологией после семи дней культивирования. Клеточное распространение наблюдается при обработке культур макрофагальным колониестимулирующим фактором (М-КСФ). В отсутствие M-CSF дифференцировка клеток занимает больше времени и приводит к образованию гетерогенной популяции макрофагоподобных клеток (данные не показаны). После 7 дней дифференцировки макрофаги инкубировали с реагентом Alamarblue в течение 24 часов до считывания. Этот метод позволяет количественно оценить клеточную способность восстанавливать резазурин до резоруфина, тем самым дифференцируя жизнеспособные клетки от мертвых. Группа «ctrl» относится к макрофагам, культивируемым в течение 7 дней в дополненной среде, в то время как «мертвая» группа относится к макрофагам, подвергнутым осмотическому лизису во время дифференцировки, которая служит контролем для методики. После завершения дифференцировки (в течение семи дней) макрофаги, полученные из моноцитов человека, остаются жизнеспособными и требуют дальнейших анализов, которые могут продолжаться до 24 часов после дифференцировки (рисунок 1B) или нескольких дней (данные не показаны).

Первые моменты взаимодействия между Leishmania и фагоцитом отмечены тесным контактом, который завершится фагоцитозом и интернализацией паразита. Понять процесс заражения поможет объяснить механизмы, участвующие в уничтожении паразитов или восприимчивости к определенному патогену. Согласно полученным результатам, в течение первых четырех часов после заражения был отмечен самый высокий уровень инфицирования L. braziliensis (оба штамма были протестированы как на BA788, так и на BA3456). Через 24 часа после заражения наблюдается снижение частоты инфицирования обоих штаммов, но мы обнаружили статистическую значимость только для BA788 (рис. 2A, D). Учитывая более длительные периоды инфекции, через 72 часа в клетках не было обнаружено интернализованных паразитов (данные не показаны), что позволяет предположить, что макрофаги человека способны контролировать инфекцию L. braziliensis in vitro. Уровень заражения измеряется количеством 100 клеток и среди них инфицированных. Это позволяет оценить процент инфицирования, который может варьироваться из-за иммунного ответа донора клеток, количества паразитов Leishmania в стационарной фазе, а также из-за смещения экспериментатора. На рисунке 2Н показаны репрезентативные изображения с низким уровнем инфицирования (слева) и более высоким уровнем инфицирования (справа), полученными с помощью оптического микроскопа.

Еще одним данным, которые могут быть оценены в культивируемых макрофагах человека, является паразитарная нагрузка, которая важна для определения способности макрофагов контролировать инфекцию. Он измеряется средним значением интернализованных паразитов в каждой клетке, и по прошествии разных моментов времени можно определить, увеличилось или уменьшилось количество паразитов (рис. 2B, E). Наконец, результаты определения жизнеспособности паразитов дополнительно собирают информацию о контроле инфекции. Его измеряют по количеству жизнеспособных паразитов в культуре после замены RPMI на среду Schneider. Что касается инфекции L. braziliensis , мы уже протестировали различные временные точки, такие как 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч, чтобы количественно определить жизнеспособных паразитов. Результаты показывают, что для оценки жизнеспособности паразитов в этих условиях рекомендуется 72 часа (рисунок 2G).

На основании нашего протокола также можно измерить воспалительную реакцию на инфекцию L. braziliensis в супернатанте культуры уже через 4 часа после заражения. Нам удалось обнаружить ИЛ-6, ФНО-α и ЛТБ₄ (рис. 3A-C), но продукция ИЛ-10 и ИЛ-1β была ниже уровня обнаружения (данные не показаны).

Другим важным аспектом иммунного ответа против L. braziliensis является производство макрофагами активных видов кислорода (АФК). Это один из основных механизмов уничтожения паразитов. Представленный здесь протокол показывает, что продукция АФК из макрофагов значительно увеличивается через 4 часа после заражения (рисунок 4A). Количественное определение АФК на основе скорректированной общей флуоресценции клеток (CTCF) позволило обнаружить почти в два раза больше продукции АФК между инфицированными и неинфицированными макрофагами (рис. 4B).

В совокупности результаты показывают, что макрофаги, полученные из моноцитов человека, позволяют изучать несколько аспектов иммунного ответа против инфекции L. braziliensis in vitro. Таким образом, этот протокол позволяет исследовательским группам глубже изучить роль макрофагов человека в лейшманиозе, сводя к минимуму смещение моделей линий или мышиных клеток.

Рисунок 1. Морфология клеток при дифференцировке макрофагов человека in vitro. (A) Репрезентативные изображения морфологии адгезивных клеток в первый день культивирования (слева) и после семи дней дифференцировки. (В) Жизнеспособность клеток после культивирования в течение семи дней для дифференцировки. Ctrl = макрофаги в культуре с дополненной средой; Мертвые = макрофаги, подвергнутые осмотическому лизису; Цель 60x; n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2. С помощью оптической микроскопии можно оценить несколько параметров инфекции, вызванной двумя штаммами Leishmania braziliensis.(А, Г) Частота инфицирования (B, E), паразитарная нагрузка (через четыре и 24 часа после заражения) и (C, F) репрезентативные изображения макрофагов, инфицированных L. braziliensis из штаммов BA5456 (A-C) или BA788 (D-E) (четыре часа заражения). (G) Жизнеспособный L. braziliensis из макрофагов после четырех часов заражения штаммом BA788. (H) Репрезентативные изображения макрофагов человека, инфицированных L. braziliensis (штамм BA788), показывающих низкий (слева) и высокий уровень инфицирования (справа). Стрелки = внутриклеточные амастиготы; Масштабная линейка 10 мкм; *p < 0,05; (А,В) n = 3; (D,E) n = 6; (G) n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3. Индуцированная L. braziliensis продукция медиаторов воспаления макрофагами человека через четыре часа после инфицирования. (A) LTB₄, (B) IL-6 и (C) продукция TNF-α в надосадочной жидкости культуры после четырехчасового заражения штаммом L. braziliensis (штамм BA788), измеренная методом иммуноферментного анализа. **p < 0,01; n = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4. Продукция АФК макрофагами человека после инфицирования in vitro L. braziliensis. (A) Репрезентативные изображения флуоресцентного мечения АФК в культивируемых макрофагах человека после четырех часов заражения штаммом L. braziliensis (BA788). (B) Количественная оценка продукции АФК на основе скорректированной общей флуоресценции клеток (CTCF) с использованием изображения J. Green = АФК; Синий = ядро; Масштабная линейка 10 мкм; * p < 0,05; n = 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Представленный в данной работе протокол дифференцировки моноцитов человека в макрофаги с последующим заражением двумя штаммами L. braziliensis позволяет оценить несколько аспектов взаимодействия паразита с клеткой. Эти инструменты могут иметь решающее значение для прояснения оставшихся без ответа вопросов о CL. С созданием этого протокола наша группа смогла раскрыть некоторые аспекты иммунного ответа макрофагов, полученных от людей с диабетом и CL¹⁴.

Процесс дифференцировки моноцитов в макрофаги человека сложен и требует внимания с первого дня культивирования. Исследователь должен следить за дифференцировкой, ежедневно проверяя развитие культуры по клеточной морфологии. Обычно для полной дифференцировки достаточно посева моноцитов в течение семи дней с М-КСФ, содержащей среду. Важно отметить, что морфология клеток зависит от донора, поэтому у доноров можно наблюдать несколько стадий клеточной дифференцировки. Это может быть преодолено за счет увеличения числа доноров, что позволит выявить выбросы. Кроме того, использование M-CSF имеет решающее значение для полной дифференцировки в макрофаги¹⁷; В противном случае это приведет к образованию крайне неоднородной популяции дендритных клеток, макрофагоподобных клеток и моноцитов. Другие факторы роста или их комбинация были использованы в качестве толлингов для дальнейшей поляризации макрофагов в профиль М1 или М2^17,18. Несколько исследований показали, что макрофаги, культивируемые с помощью M-CSF, развивают профиль M2, в то время как клетки, обработанные GM-CSF, демонстрируют профиль M1¹⁹. Однако макрофаги, культивируемые с помощью M-CSF, могут поляризоваться в профиль M1 после стимуляции²⁰. Основываясь на полученных результатах, мы не смогли определить профиль макрофагов до заражения, но предполагаем, что он, вероятно, имел тенденцию к профилю M2. С другой стороны, через 4 часа после инфекции макрофаги продуцировали высокие уровни провоспалительных цитокинов и АФК, что характерно для классического профиля макрофагов. Еще одним важным аспектом инфицирования макрофагов лейшманией является наблюдаемая дисперсия в процентном соотношении инфицированных клеток (коэффициент инфицирования). Это заметная особенность анализов с человеческими макрофагами, в том числе из-за чувствительности каждого донора. Чтобы свести к минимуму этот эффект, следует подтвердить стационарную фазу культур Leishmania и рассмотреть методы очистки метациклических промастигот 21,22,23. Кроме того, наши результаты показывают, что увеличение периодов инфекции приводит к снижению уровня инфекции, поскольку макрофаги человека, по-видимому, способны контролировать L. braziliensis.

Взаимодействие макрофагов и Leishmania включает в себя выработку медиаторов, которые представляют собой комбинацию защитной реакции клетки-хозяина на уничтожение паразита и механизмов побега, разработанных каждым видом Leishmania. Таким образом, для определения профиля медиаторов, вырабатываемых во время инфекции, важно понимать патогенез CL²⁴. На основании нашего протокола можно измерить провоспалительные медиаторы через 4 часа после заражения L. braziliensis. С помощью этого метода мы также смогли показать эту воспалительную реакцию макрофагов у лиц с сахарным диабетом после инфицирования in vitro L. braziliensis¹⁴. Возможность оценки различных медиаторов воспаления имеет решающее значение для лучшего понимания КЛ как хронического воспалительного заболевания кожи 24,25,26.

Продукция медиаторов, участвующих в уничтожении паразитов, также играет важную роль в развитии и исходе заболевания. Уже было описано, что продукция АФК является одним из наиболее эффективных механизмов борьбы с инфекцией L. braziliensis ^13,14. Представленный здесь протокол позволяет оценить продукцию АФК в макрофагах, инфицированных L. braziliensis, с помощью флуоресцентного микроскопа. Продукция АФК, по-видимому, является ключевым фактором для определения восприимчивости к инфекции^14,25. В отличие от других методов, количественная оценка АФК с помощью флуоресцентной микроскопии имеет преимущество в том, что она позволяет локально идентифицировать продукцию внутри клетки. Другие методы позволяют проводить только косвенную количественную оценку продукции АФК от всей клеточной популяции, не принимая во внимание, что клетки могут по-разному реагировать на один и тот же стимул^13,25.

Таким образом, результаты показывают, что описанный здесь протокол позволяет проводить исследования, направленные на изучение взаимодействия между макрофагами и L. braziliensis, оценивая такие аспекты, как уровень инфицирования, уничтожение паразитов и производство медиаторов. Это позволяет экстраполировать полученные данные и соотнести их с естественными механизмами.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Эта работа была поддержана Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) в рамках гранта No PET0009/2016 и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil (CAPES) в соответствии с Финансовым кодексом 001.