Leishmania braziliensis感染率と自然宿主免疫応答を評価するためのヒト単球からのマクロファージの取得

このプロトコルは、 Leishmania braziliensisに感染するために単球からヒトマクロファージを取得するためのプロセスを説明しています。また、研究者は感染率と寄生虫の生存率、蛍光顕微鏡によるROS産生、および感染に対するマクロファージ応答を調査するための培養上清での炎症性メディエーターの産生を評価することもできます。

マクロファージは、免疫系の機能に不可欠な多機能細胞であり、リーシュマニア・ブラジリエンシス(Lb)感染における主要な宿主細胞です。これらの細胞は、微生物の認識と食作用に特化しているだけでなく、他の免疫細胞を活性化して抗原を提示し、炎症と組織修復を促進します。ここでは、健康なドナーの末梢血(PBMC)から単核細胞を採取し、単球を分離してマクロファージに分化するプロトコールについて述べます。次に、これらの細胞をin vitroで異なるLb濃度で感染させることができ、感染を制御する能力を評価するとともに、宿主細胞の免疫応答を評価することができます。これはいくつかの方法で測定できます。PBMCは、最初にFicoll-Hypaqueグラジエントで遠心分離することにより単離され、次に単球が培養プレートに付着するようにプレーティングされました。非接着性細胞は洗浄により除去した。次に、接着細胞をマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)とともに7日間培養し、マクロファージの分化を誘導しました。2 x 10⁵マクロファージを得るためには、24ウェルプレートにウェルあたり2 x 10⁶セルをプレーティングすることをお勧めします。その後、完全に分化したマクロファージをLbに4時間または24時間感染させることができます。このプロトコルは、かなりの割合の感染細胞をもたらし、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で評価することができます。感染指数に加えて、各細胞内の寄生虫の数をカウントすることで寄生虫の負荷を測定できます。さらに、培養上清またはマクロファージ自体内でも分子アッセイおよび機能アッセイを行うことができるため、このプロトコルをさまざまな状況に適用し、他の細胞内寄生虫種にも適応させることができます。

リーシュマニア属の細胞内原虫は、リーシュマニア症¹として知られる顧みられない疾患複合体の原因物質です。これらの熱帯病には、皮膚病変から内臓疾患から生じる合併症まで、幅広い臨床症状があり、治療しないと致命的となる可能性があります。皮膚リーシュマニア症(CL)は、リーシュマニア症の中で最も頻度の高い疾患であり、慢性炎症の悪化を伴う単一または少数の潰瘍性皮膚病変を特徴としています²。疾患の発症は、リーシュマニア種に加えて、宿主の免疫応答に関連する因子の組み合わせに依存しており、これらの両方が臨床転帰を定義します^3,4。Leishmania braziliensis は、ブラジルで CL を引き起こす主な種であり、国のすべての州で症例が報告されています⁵.L. braziliensisに対する免疫応答は、寄生虫を接種部位に制限し、マクロファージ、好中球、リンパ球などのいくつかの免疫細胞タイプを含むため、保護的であると考えられています^4,6,7。

マクロファージは、微生物の検出と食作用に特化しており、抗原を提示して他の細胞タイプを活性化できるため、免疫系に不可欠な多機能細胞です。マクロファージは、炎症から組織修復、および恒常性の維持までのプロセスを調節することができます^8,9。これらの細胞は、リーシュマニアなどの細胞内寄生虫に対する初期の免疫応答において重要な役割を果たしており、その排除に重要である10,11,12。

L. braziliensis感染中、マクロファージは、活性酸素種(ROS)および炎症性メディエーター13,14の産生など、寄生虫を排除するための異なるメカニズムを通じて応答することができる。免疫応答は、炎症状態または組織^{修復過程の}悪化に寄与する炎症誘発性または抗炎症性サイトカインの産生によって導かれることができる^6,15,16。マクロファージの可塑性は、CLの免疫病因や寄生虫と宿主の相互作用の基本であり、これらの細胞は疾患メカニズムの解明や新しい治療法の開発に重要であると考えられています。

CLは複雑な疾患であるため、研究者はヒトに見られる細胞型を模倣した細胞型を探索する必要があります。異なる実験モデルで観察される免疫応答は異なり、自然に感染したヒトで観察された免疫応答を反映しない結果を生成する可能性があります。したがって、本明細書に提示されたプロトコルは、 L. braziliensisによって引き起こされるCL中のヒトマクロファージおよびそれらの免疫応答の研究を可能にするように設計されました。

ゴンサロ・モニス研究所(Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ、サルバドール、バイーア-ブラジル)のヒト研究における倫理に関する機関審査委員会は、この研究を承認しました(プロトコル番号:CAAE 95996618.8.0000.0040)。

1. ヒトPBMCの単離

1. 血液サンプル、1.077 g/mL 密度勾配(Ficoll-Histopaque など)、生理食塩水が室温にあることを確認します。
2. 血液サンプルを生理食塩水で1:1の比率で希釈します。
3. 10〜12mLの密度勾配を50mLチューブに移します。
4. 希釈した血液サンプルを最大40 mLまで慎重に密度勾配の上に重ねます。血液勾配層と密度勾配層を分離します。
5. 最初の遠心分離:血液と密度勾配層を含む遠心分離チューブを400 x g で24°Cで30分間遠心分離します。
   注意: 遠心分離機を始動する前にブレーキを切ってください。
6. PBMCリングの上の血漿をピペットで除去します(バフィーコート層は血漿と密度勾配層の間にあり、その下には赤血球/顆粒球ペレットがあります)。
7. 雲状のPBMC層(バフィーコート層)をピペットで15mLチューブに移し、冷たい生理食塩水(氷上または4°Cに保持)で満たします。
8. 2回目の遠心分離:ブレーキをオンにした状態で、チューブを300 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
9. 上清を捨て、チューブに冷たい生理食塩水を入れてペレットを再懸濁します。
10. 3回目の遠心分離:ブレーキをオンにした状態で、チューブを250 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
11. 上清を捨ててペレットを再懸濁し、チューブに冷たい生理食塩水を入れます。
12. 4回目の遠心分離:ブレーキをオンにした状態で、チューブを200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
13. 上清を捨て、ペレットを1 mLの冷たいRPMI培地で再懸濁します。
14. セルをカウントして、取得されたセルの数を決定します。

2. ヒトマクロファージへの分化

注:24ウェルプレートの場合、ウェルあたり2 x 10⁶細胞をプレートするのに必要な総細胞量を計算し、2 x 10⁵マクロファージを生成します。この収量は、ヒトの血液中の平均10%の単球に基づいています。あるいは、単球を非酵素的方法によって放出し、その後、プレーティングにカウントすることもできます。

1. 24ウェルプレートに、各ウェルの底に13mmの丸いガラスカバースリップを置きます。ウェルあたり2×10個の⁶細胞に相当するものを1mLのRPMI不完全中にプレートします。
   注:量を過大評価すると細胞の接着が妨げられ、培養が損なわれる可能性があるため、各ウェルの細胞数を制限してください。さらに、すべてのカバーガラスは清潔で滅菌されている必要があります。
2. プレートを5%_CO2未満で37°Cで30分間インキュベートし、細胞接着を行います。
3. 上清を取り除き、室温で0.9%生理食塩水で一度洗浄して、付着していない細胞を取り除きます。
4. 洗浄後、生理食塩水を取り除き、室温で補充したRPMI培地250μL(10%ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、50 ng/mL M-CSF)を各ウェルに加えます。
5. 細胞を5%_CO2の下で37°Cで7日間インキュベートします。
   1. 2日おきに、補充したRPMI培地125 μLを各ウェルに加えます。細胞分化の終了時には、最終容量はウェルあたり500μLになります。
   2. 細胞生存率を解析するには、96ウェルプレート(ウェルあたり2 x 10⁵)で別の培養を並行して行います。
   3. マクロファージへの分化(7日間)後、20 μLのAlamarBlue試薬を添加します。
   4. 7時間のインキュベーション後、波長570 nmおよび600 nmの分光光度計でプレートを読み取ります。

3. リーシュマニア の培養と感染

注:このアッセイでは、2つの異なる株(MHOM/BR/01/BA788およびMHOM/BR88/BA-3456)の L. braziliensis promastigotesを使用しました。

1. Lb寄生虫をカウントし、容量を計算すると、5 x 10⁵/mL寄生虫が得られます。
2. 補充されたシュナイダーの昆虫培地(10%FBS、2 mM L-グルタミン、100 U / mLペニシリン、および100 mg / mLストレプトマイシン)を準備します。.
3. 寄生虫を24°Cのインキュベーターで総量5 mLでインキュベートし、固定相に達するまで(4〜6日)インキュベートします。
   注:毎日寄生虫を数えて、成長を評価します。
4. 固定相に到達した後、Leishmania培養物を100 x g で4°Cで10分間遠心分離し、死んだ寄生虫(チューブの底に沈殿)を除去します。
5. 上清を新しいチューブに移し、1,800 x g で4°Cで10分間遠心分離して、生存可能な寄生虫を回収します。上清を捨てます。
6. 寄生虫をカウントするために、1 mLのRPMI培地でペレットを再懸濁します。
7. 寄生虫の量を計算して、寄生虫と細胞の比率を10:1にします。以前に補充されたRPMI培地(~300 μL/well)で室温で培養したマクロファージを含む培養プレートに寄生虫を移します。
8. 分化したマクロファージを含む各ウェルから上清を取り除きます。
   注:できるだけ早く、各ウェルの培地を交換して、細胞が培地なしで長期間過ごすのを避けてください。一度に3つのウェルの培地を取り外して交換することをお勧めします。
9. 計算された量のLbを、分化したマクロファージを含む各ウェルに移します。
10. 細胞を37°Cで4時間または24時間、5%_CO2未満で感染させます。
    1. 4時間後、マクロファージを生理食塩水で室温で3回洗浄し、非内在化寄生虫を除去します。
    2. 24時間の感染期間中は、洗浄後に各ウェルに300μLのRPMI培地を添加し、さらに5%_CO2未満の37°Cで20時間再インキュベートします。
11. 上清を取り除き、製造元の指示に従って酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して炎症性メディエーターを測定します。
    1. 回収した上清を1,800 x g で室温で10分間遠心分離します。上清を新しいチューブに移します。この手順は、非内在化寄生虫を除去するために実行されます。上清は凍結し、将来の分析時まで-80^°Cに保つことができます。
       注:細胞は、感染率、寄生虫の生存率、またはROS産生を評価するために使用できます。

4. 感染評価

1. 感染率の定量化
   1. 上清を除去した後、各ウェルに300 μLのメタノールを加えます。カバースリップに付着した細胞を固定するために15分間待ちます。
   2. ウェルからカバースリップを取り外し、支持体の上に置き、細胞染色溶液(Quick Panoptic 2など)に1分間浸します。
   3. カバーガラスを細胞染色溶液(Quick Panoptic 3など)に2回浸し、乾燥するまで待ちます。
   4. 15 μLの封入用培地(Entellanなど)をスライドに置き、カバースリップを培地の上に置きます。
      注:カバースリップに付着したすべてのマクロファージは、封入剤と接触している必要があります。
   5. 100倍対物レンズを使用して光学顕微鏡で100個の細胞をランダムにカウントし、感染率と内在化したアマスチゴートの数を定量化します。
2. 寄生虫の生存率
   1. 感染の4時間後、室温で生理食塩水で細胞を3回洗浄します。
   2. 300 μLの添加したSchneider's Insect mediumを添加します。
   3. 24°Cのインキュベーターでインキュベートします。
   4. 48時間後、72時間後、96時間後、120時間後の寄生虫の成長を定量化します。

5. 蛍光顕微鏡によるROS産生評価

1. 感染期間終了後、上清を取り除き、500μLの生理食塩水で細胞を洗浄します。
2. 各ウェルに300 μLの蛍光プローブ試薬(例:5 μMのCellROX Green Reagent)を添加します。
3. 細胞を37°Cおよび5%CO₂で30分間インキュベートします。
4. 細胞を500 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄します。
5. 3.7%ホルムアルデヒド300μLで細胞を固定し、15分間放置します。
   注:蛍光シグナルは24時間以内に測定してください。
6. 細胞染色には、5 μLのDAPI染色剤(例:DAPI ProLong Gold退色防止剤)を添加します。マクロファージを含む表面をDAPI染色剤と直接接触させるようにカバースリップを置きます。
7. 蛍光顕微鏡法により、励起波長485/520nmの蛍光シグナルを解析します。
8. ImageJを使用して、各カバースリップの30個の細胞から補正された全細胞蛍光(CTCF)を計算します。
   CTCF = 積分密度 (選択した細胞の面積 x バックグラウンド測定値の平均蛍光)

6. 統計分析

1. Mann-Whitney検定を使用して、対応のないサンプルを持つ2つのグループを比較します。GraphPad Prism 7.0を使用して統計分析を実行します。 p が0.05の場合<統計的に有意な差を考慮します。

寄生虫と宿主細胞の相互作用を理解することは、いくつかの疾患の病因に関与するメカニズムを解明するために重要です。培養ヒト細胞は、細胞系譜と比較して細胞培養の限界のためにあまり使用されませんが、本明細書に提示されるプロトコルは、ヒトマクロファージの堅牢で再現性のある分化を示しています。このプロトコルは、炎症性メディエーターの産生からヒトマクロファージにおける感染性病原体の感受性まで、免疫応答と細胞生物学のいくつかの側面の分析を可能にします。

細胞分化が起こっていることを示す最初の証拠は、マクロファージの形態です(図1A)。めっき日には、細胞は丸みを帯びており、培養7日後の形態と比較すると小さくなっています。細胞の広がりは、培養物をマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)で処理すると観察されます。M-CSFがない場合、細胞分化には時間がかかり、マクロファージ様細胞の不均一な集団が生じます(データは示されていません)。7日間の分化後、マクロファージをAlamarblue試薬と24時間インキュベートし、読み取りを行いました。この方法により、レサズリンをレゾルフィンに還元する細胞容量を定量化できるため、生存細胞と死細胞を区別できます。「ctrl」群は、サプリメント培地で7日間培養したマクロファージを指し、「dead」群は、分化中に浸透圧溶解に提出されたマクロファージを指し、これは技術のコントロールとして機能します。分化が完了すると(7日間)、ヒト単球に由来するマクロファージは生存可能であり、分化後最大24時間(図1B)または数日(データは示さず)続く可能性のあるさらなるアッセイを迅速に行うことができます。

リーシュマニアと食細胞との相互作用の最初の瞬間は、寄生虫の食作用と内在化に至る密接な接触によって特徴づけられます。感染のプロセスを理解することは、寄生虫の死滅または特定の病原体に対する感受性に関与するメカニズムを説明するのに役立ちます。結果に基づくと、感染の最初の4時間は、L. braziliensis(BA788とBA3456の両方のテストされた株)の感染率が最も高かった。感染から24時間後、両株の感染率は減少しますが、BA788についてのみ統計学的有意性が認められました(図2A、D)。より長い感染期間を考慮すると、72時間後に細胞内に内在化した寄生虫は見つからず(データは示されていません)、ヒトマクロファージがin vitroでL. braziliensis感染を制御できることが示唆されています。感染率は、100個の細胞と、そのうちの感染した細胞の数によって測定されます。これは、細胞ドナーの免疫応答、定常期のリーシュマニア寄生虫の量、および実験者のバイアスによって異なる可能性のある感染の割合を推定します。図2Hは、光学顕微鏡による感染率が低い(左)と高い感染率(右)の代表的な画像を示しています。

培養ヒトマクロファージで評価できる別のデータは寄生虫負荷であり、これはマクロファージが感染を制御する能力を示すために重要です。これは、各細胞内の内在化した寄生虫の平均によって測定され、異なる時点の後、寄生虫の数が増加したか減少したかを判断することができます(図2B、E)。最後に、寄生虫の生存率の結果は、感染制御に関する情報をさらに集めます。これは、RPMIをシュナイダー培地に置き換えた後の培養中の生存寄生虫の数によって測定されます。 L. braziliensis の感染については、生存可能な寄生虫を定量化するために、すでに48時間、72時間、96時間、120時間などのさまざまな時点をテストしています。結果は、これらの条件下での寄生虫の生存率を評価するために72時間が推奨されることを示しています(図2G)。

また、当社のプロトコルに基づき、L. braziliensis 感染に対する炎症反応を培養上清で測定することも可能です。IL-6、TNF-α、LTB₄ は検出できましたが (図 3A-C)、IL-10 と IL-1β の産生は検出レベルを下回っていました (データは示していません)。

L. braziliensisに対する免疫応答のもう一つの重要な側面は、マクロファージによる活性酸素由来種(ROS)の産生です。これは、寄生虫を殺すための主要なメカニズムの1つです。本明細書に提示されたプロトコルは、マクロファージからのROS産生が感染の4時間後に有意に増加することを示している(図4A)。補正全細胞蛍光(CTCF)に基づくROSの定量により、感染したマクロファージと感染していないマクロファージの間でほぼ2倍のROS産生を検出することができました(図4B)。

まとめると、結果は、ヒト単球に由来するマクロファージが、 L. braziliensis 感染に対する免疫応答のいくつかの側面を in vitroで研究できることを示しています。したがって、このプロトコルにより、研究グループはリーシュマニア症におけるヒトマクロファージの役割をさらに調査し、系統またはマウス細胞モデルのバイアスを最小限に抑えることができます。

図 1.in vitroでのヒトマクロファージ分化中の細胞形態。 (A)培養初日(左)と分化7日後の接着細胞の形態の代表的な画像。(B)分化のために7日間培養した後の細胞生存率。Ctrl = サプリメントを添加した培地で培養したマクロファージ。死者=浸透圧溶解を受けたマクロファージ;対物レンズ60倍;n = 3 です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.リーシュマニア・ブラジリエンシスの2つの株によって引き起こされる感染のいくつかのパラメータは、光学顕微鏡法によって評価することができる。 (A、D)感染率(B、E)、寄生虫負荷(感染の4時間および24時間)、および(C、F)BA5456(A-C)またはBA788(D-E)株(感染の4時間)からL.braziliensisに感染したマクロファージの代表的な画像。(G)BA788株の感染から4時間後のマクロファージ由来の生存可能なL.braziliensis。(H)L. braziliensis(BA788株)に感染したヒトマクロファージの代表画像(左)と高感染率(右)。矢印=細胞内アマスティゴート;スケールバー10μm;*p < 0.05;(A、B) n = 3;(D,E) n = 6;(G) n = 6。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.L. braziliensisは、感染後4時間でヒトマクロファージによる炎症性メディエーターの産生を誘導した。(A)LTB₄、(B)IL-6、および(C)ELISAにより測定されたL. braziliensis(BA788株)による4時間感染後の培養上清でのTNF-α産生。**p < 0.01;n = 5 です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.L. braziliensisのin vitro感染後のヒトマクロファージによるROS産生。(A)L. braziliensis(BA788株)に感染してから4時間後の培養ヒトマクロファージにおけるROS蛍光標識の代表的な画像。(B)画像J.グリーン= ROSを使用した補正全細胞蛍光(CTCF)に基づくROS産生の定量化。青=核;スケールバー10μm;* p < 0.05;n =6 です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ヒト単球のマクロファージへの分化とそれに続く L. braziliensis の2つの株への感染について本明細書で提示されたプロトコルは、寄生虫−細胞相互作用のいくつかの側面の評価を可能にする。これらのツールは、CLに関する未解決の疑問を解明するために非常に重要であり得る。このプロトコールの確立により、私たちのグループは、糖尿病患者と^CL14の個人から得られるマクロファージの免疫応答のいくつかの側面を明らかにすることができました。

単球のヒトマクロファージへの分化プロセスは複雑であり、培養初日から注意が必要です。研究者は、細胞形態によって培養物の発達を毎日確認しながら、分化を監視しなければなりません。通常、M-CSF含有培地を用いて単球を7日間培養すれば、完全な分化には十分です。細胞の形態はドナーに依存するため、ドナー間で細胞分化のいくつかの段階が観察できることに言及することが重要です。これは、寄付者の数を増やすことで克服でき、外れ値の特定が可能になります。さらに、M-CSFの使用は、マクロファージ¹⁷への完全な分化にとって重要である。さもなければ、樹状細胞様、マクロファージ様細胞および単球の非常に不均一な集団が生じるであろう。他の成長因子またはこれらの組み合わせは、マクロファージをさらにM1またはM2プロファイル^17,18に分極するための通行料として使用されてきた。いくつかの研究では、M-CSFで培養されたマクロファージはM2プロファイルを発現し、GM-CSFで処理された細胞はM1プロファイルを示すことが示されています¹⁹。しかし、M-CSFで培養されたマクロファージは、刺激²⁰後にM1プロファイルに分極することができる。この結果から、感染前のマクロファージプロファイルは特定できませんでしたが、おそらくM2プロファイルに向かう傾向にあるのではないかと仮説を立てています。一方、感染の4時間後、マクロファージは、古典的なマクロファージプロファイルの特徴である高レベルの炎症誘発性サイトカインとROSを産生しました。マクロファージのリーシュマニア感染に関するもう一つの関連する側面は、感染細胞の割合(感染率)で観察される分散です。これは、ヒトマクロファージを用いたアッセイの顕著な特徴であり、これも各ドナーの応答性によるものです。この影響を最小限にするためには、リーシュマニア培養の定常期を確認し、メタサイクリック前胸茎を精製する方法を検討する必要がある21,22,23。また、ヒトのマクロファージはL. braziliensisを制御できると考えられるため、感染期間が長くなると感染率が低下することが分かっています。

マクロファージとリーシュマニアの相互作用には、寄生虫を殺すための宿主細胞の保護応答と、各リーシュマニア種によって開発された脱出メカニズムを組み合わせたメディエーターの産生が含まれます。したがって、感染中に産生されるメディエーターのプロファイルを定義することは、CL²⁴の病因を理解するために不可欠です。私たちのプロトコルに基づいて、L. braziliensisに感染してから4時間後に炎症誘発性メディエーターを測定することが可能です。この方法により、L. braziliensis14にin vitroで感染した後の糖尿病患者のマクロファージのこの炎症反応を示すこともできました。CLを慢性炎症性皮膚疾患としてより深く理解するためには、さまざまな炎症メディエーターを評価する可能性が重要である24,25,26。

寄生虫の死滅に関与するメディエーターの産生も、疾患の発症と転帰に重要な役割を果たします。ROS産生がL. braziliensis感染を制御するための最も効率的なメカニズムの1つであることはすでに説明しました^13,14。本明細書に提示するプロトコルは、蛍光顕微鏡を用いてL. braziliensisに感染したマクロファージ内のROS産生の評価を可能にする。ROS産生は、感染に対する感受性を定義するための鍵となるようです^14,25。他の方法とは異なり、蛍光顕微鏡によるROSの定量には、細胞内の産生を局所的に特定できるという利点があります。他の方法は、細胞が同じ刺激に対して異なる反応を示すことができることを考慮せずに、全細胞集団からのROS産生の間接的な定量化のみを可能にする^13,25。

要約すると、結果は、本明細書に記載のプロトコルが、マクロファージと L. braziliensisとの間の相互作用を探求することを目的とした研究を可能にし、感染率、寄生虫の死滅およびメディエーターの産生などの側面を評価することを示している。これにより、調査結果を推定し、それを自然発生メカニズムと相関させることができます。

著者は、競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

この作業は、Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) の助成金番号 PET0009/2016 と Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazil (CAPES) の Finance Code 001 の支援を受けました。