从人单核细胞中获得巨噬细胞以评估 巴西利什曼原虫 感染率和先天宿主免疫反应

该方案描述了从单核细胞获得人巨噬细胞以感染 巴西利什曼原虫的过程。它还允许研究人员评估感染率和寄生虫活力、通过荧光显微镜产生 ROS 以及培养上清液中炎症介质的产生，以研究巨噬细胞对感染的反应。

巨噬细胞是免疫系统功能所必需的多功能细胞，也是 巴西利什曼原虫 （Lb） 感染中的主要宿主细胞。这些细胞专门从事微生物识别和吞噬作用，但也激活其他免疫细胞并呈递抗原，以及促进炎症和组织修复。在这里，我们描述了一种从健康供体的外周血 （PBMC） 中获取单核细胞以分离单核细胞然后分化成巨噬细胞的方案。然后可以在 体外 以不同的 Lb 浓度感染这些细胞，以评估控制感染的能力，以及评估宿主细胞免疫反应，这可以通过多种方法进行测量。首先通过 Ficoll-Hypaque 梯度离心分离 PBMC，然后铺板以使单核细胞粘附在培养板上;通过洗涤去除非贴壁细胞。接下来，用巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF） 培养贴壁细胞 7 天以诱导巨噬细胞分化。我们建议在 24 孔板上每孔接种 2 x 10⁶ 个细胞，以获得 2 x 10⁵ 个巨噬细胞。然后可以用 Lb 感染完全分化的巨噬细胞 4 或 24 小时。该方案导致很大比例的感染细胞，这可以通过光学或荧光显微镜进行评估。除了感染指数外，还可以通过计算每个细胞内的寄生虫数量来测量寄生虫负荷。还可以在培养上清液或巨噬细胞本身内进行进一步的分子和功能测定，这使得该方案可以应用于各种环境，也适用于其他细胞内寄生虫物种。

利什曼原虫属的细胞内原生动物寄生虫是一种被忽视的疾病复合物（称为利什曼病^{1 型}）的病原体。这些热带病具有广泛的临床表现，从皮肤病变到疾病内脏引起的并发症，如果不治疗，可能会致命。皮肤利什曼病 （CL） 是最常见的利什曼病形式，其特征是单个或少量溃疡性皮肤病变伴有加重的慢性炎症²。疾病的发展取决于利什曼原虫属，以及与宿主免疫反应相关的因素的组合，这两者都定义了临床结果 ^3,4。巴西利什曼原虫是巴西导致 CL 的主要物种，该国所有州都报告了病例⁵。针对巴西乳杆菌的免疫反应被认为是保护性的，因为它将寄生虫限制在接种部位，并涉及多种免疫细胞类型，例如 巨噬细胞， 中性粒细胞 e 淋巴细胞 ^4,6,7。

巨噬细胞是免疫系统所必需的多功能细胞，因为它们专门用于微生物的检测和吞噬作用，并且可以呈递抗原并激活其他细胞类型。巨噬细胞能够调节从炎症到组织修复和维持体内平衡的过程 ^8,9。这些细胞在针对细胞内寄生虫（如利什曼原虫）的早期免疫反应中起着至关重要的作用，这对它们的消除很重要 10,11,12。

在巴西乳杆菌感染期间，巨噬细胞可以通过不同的机制做出反应以消除寄生虫，例如产生活性氧 （ROS） 和炎症介质^13,14。免疫反应可以由促炎或抗炎细胞因子的产生引导，这些细胞因子会导致炎症状态加剧或组织修复过程 ^6,15,16。巨噬细胞的可塑性是 CL 免疫发病机制以及寄生虫-宿主相互作用的基础，这些细胞被认为对阐明疾病机制和开发新的治疗方法至关重要。

由于 CL 是一种复杂的疾病，因此研究需要研究人员探索与人类中发现的细胞类型相似的细胞类型。在不同实验模型中观察到的免疫反应可能会有所不同，并产生的结果不能反映在自然感染的人类中观察到的免疫反应。因此，本文提出的方案旨在能够研究巴西 乳杆菌引起的 CL 期间的人巨噬细胞及其免疫反应。

Gonçalo Moniz 研究所（Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ，萨尔瓦多，巴伊亚州-巴西）人类研究伦理机构审查委员会批准了这项研究（协议编号：CAAE 95996618.8.0000.0040）。

1. 人 PBMC 的分离

1. 确保血液样品、1.077 g/mL 密度梯度（例如 Ficoll-Histopaque）和盐水溶液处于室温下。
2. 用盐水溶液以 1：1 的比例稀释血液样品。
3. 将 10-12 mL 密度梯度转移到 50 mL 试管中。
4. 小心地将最多 40 mL 稀释的血液样品叠加在密度梯度上。分离血液和密度梯度层。
5. 第一次离心：在 24 ºC 下以 400 x g 离心含有血液和密度梯度层的试管 30 分钟。
   注意： 在启动离心机之前关闭制动器。
6. 用移液管去除 PBMC 环上方的血浆（血沉棕黄层位于血浆和密度梯度层之间;下面是红细胞/粒细胞沉淀）。
7. 用移液管将云状 PBMC 层（血沉棕黄层）转移到 15 mL 试管中，并填充冷盐水（保持在冰上或 4 °C）。
8. 第二次离心：在 4 °C 下以 300 x g 离心管 10 分钟，同时打开制动器。
9. 弃去上清液，用冷盐水填充试管重悬沉淀。
10. 第三次离心：在 4 °C 下以 250 x g 离心管 10 分钟，同时打开制动器。
11. 弃去上清液并重悬沉淀，用冷盐水填充试管。
12. 第四次离心：在4°C下以200 x g 离心管10分钟，同时打开制动器。
13. 弃去上清液，用 1 mL 冷 RPMI 培养基重悬沉淀。
14. 计数细胞以确定获得的细胞数。

2. 分化为人巨噬细胞

注：对于 24 孔板，计算每孔接种 2 x 10⁶ 个细胞所需的总细胞量，这将产生 2 x 10⁵ 个巨噬细胞。该产量基于人血中平均 10% 的单核细胞。或者，也可以通过非酶方法释放单核细胞，然后计数以进行铺板。

1. 在 24 孔板上，将 13 mm 圆形玻璃盖玻片放在每个孔的底部。将相当于 2×10^{个 6} 个细胞接种在每孔 1 mL 不完全的 RPMI 中。
   注：限制每个孔中的细胞数量，因为高估的细胞数量会阻碍细胞粘附并影响培养。此外，所有盖玻片必须清洁无菌。
2. 将板在 37 ºC 下、5% CO₂ 下孵育 30 分钟以进行细胞粘附。
3. 去除上清液，在室温下用 0.9% 盐水洗涤一次，以去除任何非贴壁细胞。
4. 洗涤后，去除盐水并在室温下加入 250 μL 补充的 RPMI 培养基（10% 胎牛血清 （FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 链霉素和 50 ng/mL M-CSF）到每个孔中。
5. 将细胞在 37ºC 和 5% CO₂ 下孵育 7 天。
   1. 每两天向每个孔中加入 125 μL 补充的 RPMI 培养基。在细胞分化结束时，最终体积为每孔 500 μL。
   2. 为了分析细胞活力，在 96 孔板上平行进行另一种培养（每孔 2 x 10⁵）。
   3. 分化成巨噬细胞后（7 天），加入 20 μL AlamarBlue 试剂。
   4. 孵育 7 小时后，在分光光度计上以 570 nm 和 600 nm 的波长读取板。

3. 利什曼原虫 培养和感染

注：该测定使用来自两种不同菌株 （MHOM/BR/01/BA788 和 MHOM/BR88/BA-3456） 的 L. braziliensis 前鞭毛体。

1. 计数 Lb 寄生虫并计算体积以获得 5 x 10^{个 5}/mL 寄生虫。
2. 制备补充的 Schneider's Insect 培养基（10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素）。
3. 在 24 ºC 培养箱中以总体积为 5 mL 的寄生虫孵育，直至达到固定相（4 至 6 天）。
   注意：每天计数寄生虫以评估生长情况。
4. 达到固定相后，在 4 ºC 下以 100 x g 离心利什曼原虫培养物 10 分钟，以去除任何死亡寄生虫（沉淀在管底部）。
5. 将上清液转移到新试管中，并在 4 ºC 下以 1,800 x g 离心 10 分钟，以回收活的寄生虫。丢弃上清液。
6. 用 1 mL 补充的 RPMI 培养基重悬沉淀以计数寄生虫。
7. 计算寄生虫的体积以获得 10：1 的寄生虫：细胞比率。将寄生虫转移至含有巨噬细胞的培养板中，这些巨噬细胞先前在室温下在补充的 RPMI 培养基（~300 μL/孔）中培养。
8. 从含有分化巨噬细胞的每个孔中取出上清液。
   注意：尽快更换每个孔中的培养基，以避免细胞长时间无培养基。我们建议一次去除和更换三个孔中的培养基。
9. 将计算的 Lb 量转移到含有分化巨噬细胞的每个孔中。
10. 在 37 ºC 和 5% CO₂ 下感染细胞 4 或 24 小时。
    1. 4 小时后，在室温下用生理盐水洗涤巨噬细胞 3 次，以去除任何未内化的寄生虫。
    2. 在 24 小时的感染期内，洗涤后向每个孔中加入 300 μL 补充的 RPMI 培养基，然后在 37 °C 下在 5% CO₂ 下再孵育 20 小时。
11. 按照制造商的说明使用酶联免疫吸附测定 （ELISA） 去除上清液以测量炎症介质。
    1. 在室温下以 1,800 x g 离心收集的上清液 10 分钟。将上清液转移到新试管中。执行此过程以去除任何未内化的寄生虫。上清液可以冷冻并保持在 -80^oC 直到将来分析。
       注意：细胞可用于评估感染率、寄生虫活力或 ROS 产生。

4. 感染评估

1. 感染率的量化
   1. 去除上清液后，向每个孔中加入 300 μL 甲醇。等待 15 分钟以固定粘附在盖玻片上的细胞。
   2. 从孔中取出盖玻片，放在支架上，在细胞染色溶液（例如，Quick Panoptic 2）中浸泡 1 分钟。
   3. 将盖玻片浸入细胞染色溶液（例如 Quick Panoptic 3）中两次，然后等待干燥。
   4. 将 15 μL 封固剂（例如 Entellan）放在载玻片上，然后将盖玻片放在培养基上。
      注意：所有附着在盖玻片上的巨噬细胞都应与封固剂接触。
   5. 在光学显微镜下使用 100 倍物镜随机计数 100 个细胞，以量化感染率和内化无鞭毛细胞的数量。
2. 寄生虫活力
   1. 感染 4 小时后，在室温下用生理盐水洗涤细胞 3 次。
   2. 加入 300 μL 补充的 Schneider's Insect 培养基。
   3. 在 24 ºC 培养箱中孵育。
   4. 量化 48 、 72 、 96 和 120 小时后的寄生虫生长。

5. 通过荧光显微镜评估 ROS 的产生

1. 感染期后，去除上清液并用 500 μL 生理盐水洗涤细胞。
2. 向每个孔中加入 300 μL 荧光探针试剂（例如，5 μM 的 CellROX Green 试剂）。
3. 将细胞在 37 ºC 和 5% CO₂ 下孵育 30 分钟。
4. 用 500 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞 3 次。
5. 用 300 μL 3.7% 甲醛固定细胞，静置 15 分钟。
   注：在 24 小时内测量荧光信号。
6. 加入 5 μL DAPI 染色剂（例如 DAPI ProLong Gold 抗淬灭剂）进行细胞染色。将盖玻片与含有巨噬细胞的表面直接接触 DAPI 染色剂。
7. 通过荧光显微镜在 485/520 nm 的激发波长下分析荧光信号。
8. 使用 ImageJ 计算每个盖玻片的 30 个细胞的校正总细胞荧光 （CTCF）。
   CTCF = 积分密度（选定细胞的面积 x 背景读数的平均荧光）

6. 统计分析

1. 使用 Mann-Whitney 检验将两组样本与不成对的样本进行比较。使用 GraphPad Prism 7.0 执行统计分析。当 p < 0.05 时，考虑具有统计显著性的差异。

对寄生虫和宿主细胞相互作用的理解对于阐明参与多种疾病发病机制的机制至关重要。尽管与细胞谱系相比，由于细胞培养的局限性，培养的人类细胞较少使用，但此处提出的方案显示了人类巨噬细胞的稳健且可重复的分化。该方案能够分析免疫反应和细胞生物学的几个方面，从炎症介质的产生到人巨噬细胞中感染因子的易感性。

细胞分化发生的第一个证据是巨噬细胞形态（图 1A）。在铺板日，与培养 7 天后的形态相比，细胞呈圆形和小。当用巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF） 处理培养物时，观察到细胞扩散。在没有 M-CSF 的情况下，细胞分化需要更多时间，并导致巨噬细胞样细胞群异质性（数据未显示）。分化 7 天后，将巨噬细胞与 Alamarblue 试剂孵育 24 小时，直至读数。该方法允许量化细胞将刃天青还原为试卤灵的能力，从而区分活细胞和死细胞。“ctrl”组是指在补充培养基中培养 7 天的巨噬细胞，而“死”组是指在分化过程中接受渗透性裂解的巨噬细胞，用作该技术的对照。一旦分化完成（7 天），来自人单核细胞的巨噬细胞仍然有效，并迅速进行进一步的检测，分化后可持续长达 24 小时（图 1B）或几天（数据未显示）。

利什曼原虫和吞噬细胞之间相互作用的最初时刻以密切接触为标志，最终导致寄生虫的吞噬作用和内化。了解感染过程将有助于解释寄生虫杀死或对某种病原体易感性的机制。根据结果，感染的前 4 小时是巴西乳杆菌（BA788 和 BA3456 测试菌株）感染率最高的。感染 24 小时后，两种菌株的感染率均有所降低，但我们仅发现 BA788 具有统计学意义（图 2A、D）。考虑到较长的感染时间，72 小时后在细胞内未发现内化寄生虫（数据未显示），表明人类巨噬细胞能够在体外控制巴西乳杆菌感染。感染率是通过 100 个细胞的数量来衡量的，其中包括受感染的细胞。这估计了感染的百分比，该百分比可能因细胞供体的免疫反应、稳定期利什曼原虫寄生虫的数量以及实验者偏倚而有所不同。图 2H 显示了光学显微镜下低感染率（左）和较高感染率（右）的代表性图像。

可以在培养的人巨噬细胞中评估的另一个数据是寄生虫负荷，这对于表明巨噬细胞控制感染的能力很重要。它是通过每个细胞中内化寄生虫的平均值来测量的，并且在不同的时间点之后，可以确定寄生虫的数量是增加还是减少（图 2B、E）。最后，寄生虫活力的结果进一步收集了有关感染控制的信息。它是通过将 RPMI 替换为 Schneider 培养基后培养物中活寄生虫的数量来测量的。关于 巴西乳杆菌 感染，我们已经测试了不同的时间点，例如 48 小时、72 小时、96 小时和 120 小时，以量化活的寄生虫。结果表明，建议 72 小时来评估这些条件下寄生虫的生存能力（图 2G）。

根据我们的方案，也可以在感染后 4 小时内测量培养上清液中针对巴西乳杆菌感染的炎症反应。我们能够检测到 IL-6、TNF-α 和 LTB₄ （图 3A-C），但 IL-10 和 IL-1β 的产生低于检测水平 （数据未显示）。

针对 巴西乳杆菌 免疫反应的另一个重要方面是巨噬细胞产生活性氧衍生物种 （ROS）。这是寄生虫杀死的主要机制之一。此处提出的方案表明，感染 4 小时后，巨噬细胞的 ROS 产生显着增加（图 4A）。基于校正总细胞荧光 （CTCF） 的 ROS 定量允许检测到感染和未感染巨噬细胞之间几乎两倍的 ROS 产生（图 4B）。

总之，结果表明，来自人单核细胞的巨噬细胞允许在体外研究针对巴西乳杆菌感染的免疫反应的几个方面。因此，该协议使研究小组能够进一步探索人巨噬细胞在利什曼病中的作用，从而最大限度地减少谱系或小鼠细胞模型的偏差。

图 1.体外人巨噬细胞分化过程中的细胞形态。 （A） 贴壁细胞在培养第一天（左）和分化 7 天后形态的代表性图像。（B） 分化培养 7 天后的细胞活力。Ctrl = 含有补充培养基的培养物中的巨噬细胞;死亡 = 巨噬细胞进行渗透性裂解;物镜 60 倍;n = 3。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2.由两种巴西利什曼原虫菌株引起的感染的几个参数可以通过光学显微镜进行评估。 （A、D）感染率 （B、E）、寄生虫载量（感染 4 小时和 24 小时）和 （C、F） 来自 BA5456 （A-C） 或 BA788 （DE） 菌株（感染 4 小时）的巴西乳杆菌感染的巨噬细胞的代表性图像。（G） BA788 菌株感染 4 小时后巨噬细胞衍生的活巴西乳杆菌。（H） 被巴西乳杆菌（BA788 菌株）感染的人巨噬细胞的代表性图像，显示低（左）和高感染率（右）。箭头 = 囊内无鞭毛肌;比例尺 10 μm;*p < 0.05;（A，B） n = 3;（D，E） n = 6;（G） n = 6。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3.巴西乳杆菌诱导人巨噬细胞在感染后 4 小时内产生炎性介质。（A） 通过 ELISA 测定巴西乳杆菌（BA788 菌株）感染 4 小时后，培养上清液中 LTB₄、（B） IL-6 和 （C） TNF-α 的产生。**p < 0.01;n = 5。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4.体外感染巴西乳杆菌后人巨噬细胞产生 ROS。（A） 巴西乳杆菌（BA788 菌株）感染 4 小时后培养的人巨噬细胞中 ROS 荧光标记的代表性图像。（B） 使用图像 J 基于校正后的总细胞荧光 （CTCF） 定量 ROS 生成。绿色 = ROS;蓝色 = 细胞核;比例尺 10 μm;* p < 0.05;n =6 的请单击此处查看此图的较大版本。

本文提出的用于人单核细胞分化为巨噬细胞，然后用两种菌株感染 巴西乳杆菌 的方案允许评估寄生虫 - 细胞相互作用的几个方面。这些工具对于阐明有关 CL 的未解之谜至关重要。随着该方案的建立，我们小组能够揭示从糖尿病和 CL¹⁴ 患者那里获得的巨噬细胞免疫反应的某些方面。

单核细胞向人巨噬细胞的分化过程很复杂，从培养的第一天就需要注意。研究人员必须监测分化，每天通过细胞形态检查培养物的发育。通常，用含有 M-CSF 的培养基培养单核细胞 7 天就足以完全分化。值得一提的是，细胞形态取决于供体，因此可以在供体之间观察到细胞分化的几个阶段。这可以通过增加供体数量来克服，这将允许识别异常值。此外，使用 M-CSF 对于完全分化为巨噬细胞至关重要¹⁷;否则，将导致树突状细胞样、巨噬细胞样细胞和单核细胞的高度异质性群体。其他生长因子或这些的组合已被用作将巨噬细胞进一步极化为 M1 或 M2 谱的收费^17,18。几项研究表明，用 M-CSF 培养的巨噬细胞会产生 M2 谱，而用 GM-CSF 处理的细胞则表现出 M1 谱¹⁹。然而，用 M-CSF 培养的巨噬细胞在刺激后可以极化为 M1 谱²⁰。根据结果，我们无法确定感染前的巨噬细胞谱，但假设这可能趋向于 M2 谱。另一方面，感染 4 小时后，巨噬细胞产生高水平的促炎细胞因子和 ROS，这是经典巨噬细胞谱的特征。关于巨噬细胞感染利什曼原虫的另一个相关方面是在感染细胞百分比（感染率）中观察到的分散性。这是人巨噬细胞检测的一个显著特征，也是由于每个供体的反应性。为了尽量减少这种影响，应确认利什曼原虫培养物的静止期，并且可以考虑纯化后环前鞭毛体的方法 21,22,23。此外，我们的研究结果表明，感染期的增加会导致感染率降低，因为人类巨噬细胞似乎能够控制巴西乳杆菌。

巨噬细胞和利什曼原虫的相互作用涉及介质的产生，这些介质是宿主细胞杀死寄生虫的保护反应和每个利什曼原虫物种开发的逃逸机制的组合。因此，定义感染过程中产生的介质概况对于了解 CL²⁴ 的发病机制至关重要。根据我们的方案，可以在感染巴西乳杆菌 4 小时后测量促炎介质。通过这种方法，我们还能够显示糖尿病患者在体外感染巴西乳杆菌¹⁴ 后巨噬细胞的这种炎症反应。评估不同炎症介质的可能性对于更好地理解 CL 作为一种慢性炎症性皮肤病至关重要 24,25,26。

参与寄生虫杀伤的介质的产生在疾病发展和结果中也起着重要作用。已经描述过 ROS 的产生是控制巴西乳杆菌感染的最有效机制之一^13,14。此处提出的方案允许使用荧光显微镜评估被巴西乳杆菌感染的巨噬细胞内 ROS 的产生。ROS 的产生似乎是定义感染易感性的关键^14,25。与其他方法不同，通过荧光显微镜定量 ROS 具有局部识别细胞内产生的优势。其他方法只允许间接定量整个细胞群的 ROS 产生，而不考虑细胞对相同刺激的反应不同^13,25。

总之，结果表明，此处描述的方案使旨在探索巨噬细胞与 巴西乳杆菌之间相互作用的研究成为可能，评估感染率、寄生虫杀灭和介质产生等方面。这允许推断结果并将其与自然发生的机制相关联。

作者声明他们没有相互竞争的经济利益。

这项工作得到了 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia （FAPESB） 的支持，资助号为 PET0009/2016 和 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - 巴西 （CAPES），财务代码为 001。