Ортотопическая мышиная модель рака яичников с использованием стромы человека для стимулирования метастазирования

Ортотопическое приживление клеток рака яичников, смешанных со стромальными клетками человека, позволяет получить мышиную модель, которая демонстрирует быстрое, диффузное метастатическое поведение, характерное для рака яичников человека. Эта модель также позволяет изучать взаимодействия опухолевых клеток и стромальных клеток, а также их роль в прогрессировании опухоли и метастазировании.

Рак яичников характеризуется ранним, диффузным метастазированием, при этом 70% женщин имеют метастатическое заболевание на момент постановки диагноза. Несмотря на то, что существуют элегантные трансгенные модели рака яичников у мышей, эти мыши стоят дорого и требуют много времени для развития опухолей. Модели ксенотрансплантатов для внутрибрюшинного введения не имеют стромы человека и не позволяют точно моделировать метастазирование рака яичников. Даже ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), не полностью восстанавливают микроокружение стромы человека, поскольку серийные пассажи PDX демонстрируют значительную потерю стромы человека. Возможность легко моделировать рак яичников человека в физиологически значимом стромальном микроокружении является неудовлетворенной потребностью. В данном протоколе представлена мышиная модель ортотопического рака яичников с использованием клеток рака яичников человека в сочетании с мезенхимальными стволовыми клетками (КА-МСК), ассоциированными с карциномой пациента. КА-МСК являются стромальными прогениторными клетками, которые стимулируют формирование стромального микроокружения и поддерживают рост и метастазирование рака яичников. Эта модель развивается на ранних стадиях и диффундирует метастазирование, имитируя клиническую картину. В этой модели клетки рака яичников, экспрессирующие люциферазу, смешиваются в соотношении 1:1 с КА-МСК и вводятся в яичниковую сумсу мышей NSG. Рост опухоли и метастазирование наблюдаются последовательно с течением времени с помощью биолюминесцентной визуализации. Образовавшиеся опухоли агрессивно растут и образуют метастазы в брюшной полости уже через 14 дней после инъекции. У мышей наблюдалось значительное снижение массы тела как маркер системного заболевания и увеличения бремени болезней. К 30-му дню после инъекции мыши соответствовали критериям конечной точки в >10% потери массы тела и подтвержденных вскрытием внутрибрюшных метастазов у 100% мышей и у 60%-80% метастазов в легкие и паренхиматозу в печень. В совокупности ортотопическое приживление клеток рака яичников и клеток стромы приводит к образованию опухолей, которые точно имитируют раннее и диффузное метастатическое поведение рака яичников человека. Кроме того, эта модель предоставляет инструмент для изучения роли клеток рака яичников: взаимодействий клеток стромы в метастатической прогрессии.

Рак яичников является смертельно опасным заболеванием с^5-м по величине уровнем смертности среди всех видов рака у женщин¹. У большинства женщин рак яичников диагностируется на поздней стадии, при этом метастатическое распространение присутствует у 70% пациенток на момент постановки диагноза. Такие факторы, как ранние метастазы и поздняя стадия при постановке диагноза, способствуют высоким показателям смертности, наблюдаемым при этом заболевании. Более того, эти уникальные характеристики заболевания создали проблему для создания моделей рака яичников у мышей, включая воспроизведение быстрой миграции заболевания в брюшную полость ^2,3,4.

Патогенез рака яичников, в том числе и перитонеальное распространение, облегчается формированием поддерживающего опухолевого микроокружения (ТМЭ), состоящего из многих элементов⁵. Одним из важнейших компонентов ТМЭ при раке яичников являются мезенхимальные стволовые клетки, ассоциированные с карциномой (КА-МСК). КА-МСК представляют собой стромальные клетки-предшественники, которые усиливают инициацию рака яичников, рост, устойчивость к химиотерапии и метастазирование ^6,7. КА-МСК также стимулируют формирование рака яичников TME, стимулируя опухолеассоциированный фиброз, индуцируя ангиогенез и изменяя иммунное микроокружение ^6,8,9. Учитывая мощные функции СА-МСК в ТМЭ рака яичников, моделирование рака яичников человека в физиологически значимом стромальном микроокружении имеет решающее значение для изучения прогрессирования и метастазирования рака яичников.

В последнее время трансгенные мышиные модели стали привлекать внимание к изучению спонтанных метастазов рака яичников. Тем не менее, трансгенные мыши являются дорогостоящими и демонстрируют длительный временной ход развития метастатического заболевания. В то время как другие доступные модели мышей, такие как внутрибрюшинная модель и ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), имеют относительно короткие метастатические временные интервалы, они не полностью повторяют метастазы рака яичников из-за отсутствия соответствующего стромального микроокружения 10,11,12. В попытке преодолеть эту проблему в данном исследовании представлена мышиная модель ортотопического рака яичников с использованием клеток рака яичников человека в сочетании с полученными от пациента CA-МСК. В описанной здесь модели сочетание КА-МСК с клетками рака яичников генерирует опухоли с ранними и диффузными метастазами, о чем свидетельствует наличие внутрибрюшных метастазов у 100% мышей в течение 30 дней после инъекции.

Образцы пациентов были получены в соответствии с протоколами, утвержденными IRB Университета Питтсбурга (PRO17080326). Экспериментальные методы на животных проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Питтсбурга.

1. Выделение и валидация мезенхимальных стволовых клеток, ассоциированных с карциномой пациента (КА-МСК)

ПРИМЕЧАНИЕ: ЦА-МСК получают из хирургически резецированной ткани рака яичников человека (в этом исследовании используется серозная карцинома высокой степени злокачественности), включая метастатические отложения фаллопиевых труб, яичников и/или сальниковых отложений. Среду CA-MSC получают из MEBM (базальная среда эпителиальных клеток молочной железы) с добавлением 10% инактивированного при нагревании FBS, 1x B27, 20 нг/мл EGF, 1 нг/мл гидрокортизона, 5 мкг/мл инсулина, 100 мкМ β-меркаптоэтанола, 10 нг/мл β-FGF, 1% пенициллина/стрептомицина и 20 мкг/мл гентамицина ^7,13.

1. Изоляция CA-MSC
   1. С помощью стерильного скальпеля и щипцов разделите образец ткани на кусочки размером примерно 1 мм³ дюйма. Поместите по три кусочка ткани в каждую лунку 6-луночного планшета для культивирования клеток.
      Примечание: 0,2 г опухолевой ткани можно разрезать на 12 частей и распределить по четырем лункам 6-луночного планшета для культивирования клеток.
   2. Добавьте тонкий слой среды CA-MSC, примерно по 1 мл на каждую лунку. Поместите планшет для культивирования клеток во увлажненный инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2.
   3. Через 24 ч осторожно удалите фильтрующий материал, не повреждая кусочки ткани. Добавьте в каждую лунку примерно 1 мл свежей среды. Медленно пипетируйте носитель, не нарушая прикрепления тканей. Поместите планшет для культивирования клеток обратно в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C и 5%_CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследуйте ткань с помощью инвертированного микроскопа каждый день и меняйте среду, как описано в шаге 1.1.3, всякий раз, когда мертвые клетки визуализируются в питательных средах.
   4. Через 7 дней удалите кусочки ткани, взяв ткань с помощью стерильных щипцов, и один раз промойте адгезивные клетки PBS (PBS без Ca²⁺/Mg²⁺, 1 мл на лунку). Затем добавьте свежую среду CA-MSC (2 мл на лунку) и поместите планшет для культивирования клеток во увлажненный инкубатор при температуре 37 °C при 5%_CO2.
2. Расширение CA-MSC
   1. Когда ЦА-МСК начинают расти из ткани внутри 6-луночного планшета, исследуйте клетки с помощью инвертированного микроскопа через день, чтобы обеспечить рост клеток. Как только клетки достигнут 90% слияния, перейдите к следующим шагам.
   2. Отсадите среду из планшета для культивирования клеток, затем промойте клетки 1-2 мл PBS на лунку (PBS без Ca²⁺/Mg²⁺).
   3. Добавьте 300 мкл на лунку 0,05% трипсина/0,02% раствора ЭДТА (трипсин/ЭДТА). Поверните планшет для культивирования клеток, чтобы покрыть клетки трипсином/ЭДТА, и верните планшет для культивирования клеток в инкубатор на 2-3 минуты или до тех пор, пока клетки не отделятся.
   4. Добавьте свежую среду CA-MSC для инактивации трипсина (1 мл на лунку) и повторно суспендируйте клетки. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспензируйте клетки питательной средой. Переложите повторно суспензированные клетки в колбу 2^см2 общим объемом 5 мл питательных сред.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, собранные из трех лунок 6-луночного планшета для культивирования клеток, могут быть перенесены в колбу размером 25 см². Клетки должны быть проверены на наличие микоплазмы (в соответствии с установленным протоколом обнаружения микоплазмы, таким как ПЦР), поскольку они получены из хирургически резецированной ткани человека^14,15.
   5. Как только клетки достигнут 70%-80% конфлюенции, перенесите клетки из колбы 25^см2 в колбу 75^см2 , следуя ранее описанным шагам 1.2.2-1.2.4. Расширяйте клетки каждые 5-7 дней, чтобы получить номер клеток, необходимый для валидации CA-MSC и для процедуры ортотопической инокуляции.
      Примечание: Поскольку ЦА-МСК являются клетками, полученными от пациента, время удвоения клеток различается между клеточными линиями. Большинству CA-MSC требуется 3-4 дня, чтобы удвоить их количество. Тем не менее, некоторым CA-MSC требуется 5-7 дней, чтобы удвоить их число. CA-MSC можно проходить 8-10 раз. После отрывка 10 CA-MSC могут стареть или дифференцироваться.
3. Валидация CA-MSC
   1. Валидация поверхностной экспрессии КА-МСК: Используйте 0,5 x 10⁶ СА-МСК (примерно 70% конфлюенции в колбе размером 75^см2) для проточного цитометрического анализа, чтобы убедиться, что КА-МСК экспрессируют соответствующие поверхностные маркеры, как определено в рекомендациях Международного общества клеточной терапии, как описано ранее (CD73/CD90/CD105 положительный; CD45/CD34/CD14 или CD11b/CD79a или CD19/HLA-DR отрицательный)^7,16. Подтвердите количество клеток после трипсинизации и подсчета с помощью гемоцитометра с трипаново-синим исключением погибших клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализ проточной цитометрии показывает, что клетки имеют чистоту <90%, то отсортируйте клетки по популяции CA-MSC.
   2. Валидация дифференцировки СА-МСК: Для валидации дифференцировки линии засейте СА-МСК в одну лунку 6-луночного планшета с клеточной плотностью 5 x 10⁴ клеток/лунку в 2 мл среды МСК (по одной лунке на условие дифференцировки). Через 24 ч смените среду на соответствующую среду для дифференцировки, чтобы индуцировать дифференцировку адипоцитов, хондроцитов и остеоцитов, как описано ранее ^7,16.
      Примечание: В соответствии с рекомендациями МСКТ, МСК должны демонстрировать дифференцировку in vitro как минимум в две линии (адипоциты, хондроциты или остеоциты).
4. В день запланированной процедуры инъекции мышей соберите клетки, выполнив шаги 1.2.2 и 1.2.4. Затем подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра с исключением трипан-синего на жизнеспособность и повторно суспендируют клетки в среде КА-МСК при плотности 1 х 10⁸ кл/мл (0,5 х 10⁶ КА-МСК на инъекцию). Поместите подвешенные клетки на лед.
   Примечание: Как правило, по крайней мере 1 x 10⁷ КА-МСК могут быть получены из одного образца опухоли (0,2 г ткани). Это позволяет использовать одну линию CA-MSC, полученную от пациента, для большинства экспериментов на мышах. Можно комбинировать КА-МСК от разных пациенток, но мы рекомендуем, чтобы они были получены из одного и того же гистологического подтипа рака яичников. Большинству линий CA-MSC требуется 2 месяца и/или 6-7 проходов, чтобы достичь 1 x 10⁷ ячеек. CA-MSC можно замораживать с помощью стандартных сред для замораживания ячеек и хранить в жидком азоте в течение неопределенного срока для последующего использования.

2. Подготовка клеток рака яичников

1. Поддерживайте клетки OVCAR3-Luc в среде DMEM с помощью 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллина/стрептомицина (пенициллин: 100 ЕД/мл, стрептомицин: 0,1 мг/мл). Культивирование клеток при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% содержанием_CO2 .
2. В день инъекции соберите клетки OVCAR3-Luc, выполнив следующие действия.
   1. Сначала отсадите среду из колбы для клеточных культур и промойте клетки один раз 5-7 мл PBS на 75 см² колбы (PBS без Ca²⁺/Mg²⁺). Аспирируйте PBS и добавьте раствор трипсина/ЭДТА (2 мл на 75 см² колбы). Затем верните колбу с клеточными культурами в инкубатор на 3-5 минут или до тех пор, пока клетки не отделятся.
   2. С помощью микроскопии обеспечить полную трипсинизацию клеток (убедиться, что все клетки отделены от колбы с культурой). Чтобы остановить трипсинизацию, добавьте в колбу свежую сыворотку, содержащую DMEM (2-3 мл на 75 см² колбы) и повторно суспендируйте клетки. С помощью пипетки перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
   3. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспензируйте клетки питательной средой. Затем подсчитайте клетки и повторно суспендируйте в питательную среду с плотностью 1 x 10⁸ клеток/мл (0,5 x 10⁶ клеток OVCAR3-Luc на инъекцию). Поместите подвешенные клетки на лед.

3. Ортотопическая инокуляция

1. Приготовление клеточной суспензии
   1. Смешайте CA-MSC и клетки OVCAR-Luc в соотношении 1:1.
   2. Разморозьте замерзшую матрицу базальной мембраны на ледяной бане. Затем добавьте клеточную суспензию, приготовленную на шаге 3.1.1, в матрицу базальной мембраны в соотношении 1:1 (конечная концентрация клеток: 1 x 10⁶/20 мкл матрицы среднебазальной мембраны) и тщательно перемешайте. Приготовленные клеточные суспензии следует выдержать на ледяной бане до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описано соотношение CA-MSC к OVCAR-Luc 1:1, основанное на предыдущем опыте работы с упомянутой моделью. Предыдущая работа показывает, что ЦА-МСК обычно находятся в соотношении 1:10 к опухолевым клеткам при количественном определении непосредственно из тканей пациента. Как обсуждается ниже, если исходить из соотношения CA-MSC к опухолевым клеткам 1:1, то получится приблизительное соотношение CA-MSC к опухолевым клеткам как в первичном, так и в метастатическом центрах в экспериментальных конечных точках с использованием этой модели.
2. Хирургия
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое вмешательство должно проводиться в стерильных условиях, и необходимо использовать стерильные хирургические инструменты. Для этой ортотопической модели рекомендуется использовать самок мышей NSG в возрасте 8 недель.
   1. Обезболивайте мышь с помощью ингаляций с изофлураном (4% для индукции, 2% для поддержания) и кислородом (100%, расходомер 0,5-1 л/мин). Поместите мышь на предоперационную систему носового конуса. Чтобы обеспечить анестезию на протяжении всей операции (см. подробные инструкции ниже), вставьте голову мыши в систему носового конуса изофлуранового испарителя.
   2. Подкожно введите мышке 5 мг/кг карпрофена, предоперационного анальгетика, с помощью инсулинового шприца.
   3. С помощью машинок для стрижки сбрейте левую каудальную часть мыши между реберным краем и бедренной костью. Простерилизуйте выбритый участок раствором повидон-йода и спиртовыми тампонами. Затем перенесите мышь в хирургическую систему носового конуса и отрегулируйте изофлуран до 1,5% для поддерживающей анестезии.
   4. Сделайте горизонтальный разрез кожи на 1-2 см примерно на 2-3 см ниже реберного края. Обхватите теменную брюшину щипцами и приподнимите (брюшина будет выглядеть блестящей и характеризоваться отложениями жировой ткани). Сделайте разрез на 1 см в теменной брюшине, чтобы открыть брюшную полость.
   5. Наблюдайте за скоплением жировой ткани вокруг яичника мыши (яичниковой сумки) при входе в брюшину. Используйте изогнутые щипцы для захвата и обнажения яичниковой сумки. Крепко захватывая яичник щипцами, введите в бурсу 20 мкл клеточной суспензии, приготовленной на шаге 3.1.2.
   6. Аккуратно верните яичник в брюшную полость. С помощью рассасывающегося полигликолевого нитя 6-0, прикрепленного к игле, повторите края теменного разреза брюшины. Закройте разрез кожи раневыми зажимами.
   7. Снимите мышь с носового конуса и поместите мышь в отдельную чистую клетку под согревающим светом до тех пор, пока она не придет в сознание и не будет поддерживать лежачее положение грудины. Затем верните мышь в клетку.
   8. Наблюдайте за мышами ежедневно в течение 3-7 дней после операции. Поместите чашку с карпрофеновым гелем в клетки для мышей для снятия боли. Снимите раневые зажимы через 7-10 дней после операции.

4. Еженедельный мониторинг роста опухоли и массы тела мыши

1. Система визуализации in vivo (IVIS): Начиная с первой недели после ортотопической инокуляции, выполняйте визуализацию in vivo каждую неделю в течение следующих 3-4 недель.
   1. Приготовьте раствор D-люциферина (субстрат люциферазы светлячков) путем растворения 15 мг в 1 мл PBS и фильтрации через мембрану 0,22 мкм для стерилизации.
   2. Эксплуатируйте IVIS в соответствии с инструкциями производителя. Нажмите на иконку на рабочем столе Living Image Software . Затем на панели управления получением данных IVIS выберите Инициализировать. Этот шаг может занять до 10-15 минут. За это время подготовьте мышей к визуализации.
   3. Обезболите каждую мышь с помощью изофлурановой камеры, подключенной к IVIS (2%-4% изофлуран и расходомер кислорода до 0,5-1 л/мин). Введите D-люциферин (100 мкл/10 г массы тела) путем внутрибрюшинной инъекции с помощью инсулинового шприца.
   4. Поместите животное, которому ввели люциферин, обратно в камеру с изофлураном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно записывать время инъекции, чтобы поддерживать постоянное время между введением люциферина и проведением визуализации на протяжении всего исследования.
   5. Перенесите мышь под наркозом в камеру визуализации и установите систему визуализации на соответствующие настройки. Затем приобретите изображение в нужное время.
   6. После сохранения изображений извлеките мышей из камеры визуализации и поместите их обратно в соответствующие клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: КА-МСК также могут быть помечены флуоресцентной меткой, а миграция/совместное метастазирование СА-МСК и клеток OVCAR3-Luc контролируется in vivo с использованием флуоресцентного канала на IVIS.

5. Оценка КА-МСК: метастатические отложения опухолевых клеток

1. По достижении заранее определенной конечной точки (прибавка в весе >20% при наличии асцита, потеря веса <10%, изъязвление опухоли, оценка физической подготовки 2 или менее¹⁷) усыпляют мышей в соответствии с институциональными стандартами благополучия животных.
2. Проводите вскрытие каждой мыши по отдельности. Введите стерильную иглу 18 G внутрибрюшинно, чтобы аспирировать асцит. Далее обнажают грудную и брюшную полость. Количественная оценка общего метастатического заболевания с помощью визуального осмотра опухолевого поражения органов мыши¹⁸.
3. Удалить опухолевую ткань с помощью стерильного скальпеля и либо i) зафиксировать в параформальдегиде для возможного встраивания парафина, ii) мгновенно заморозить и внедрить в безрецептурную среду для встраивания криостата, iii) мгновенно заморозить для последующего анализа ДНК, РНК или белка, либо iv) диссоциировать на отдельные клетки для проточной цитометрии или выделения FACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: CA-MSC остаются жизнеспособными в этой модели и могут быть повторно изолированы для последующих приложений. В зависимости от цели исследования, взаимодействия КА-МСК с опухолевыми клетками могут быть исследованы с помощью иммуногистохимических подходов, проточных цитометрических подходов или поддержания повторно изолированных клеток в культуре.

Описанный подход близко имитирует поддерживающее микроокружение рака яичников (в частности, серозной карциномы высокой степени злокачественности) путем совместной инъекции мезенхимальных стволовых клеток (СА-МСК) и клеток рака яичников в яичниковую сумку. Во-первы?...

Несмотря на значительные клинические и исследовательские усилия, был достигнут минимальный прогресс в лечении и профилактике рака яичников¹. Несмотря на то, что для изучения прогрессирования рака яичников и метастазов использовались различные модели м?...

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Мы хотели бы поблагодарить программу биообразцов гинекологической онкологии Promark за помощь в сборе тканей. LGC поддерживается грантом Tina's Wish Rising Star Grant и Фондом Mary Kay®.