ヒト間質を用いた卵巣癌の同所性マウスモデルによる転移促進

ヒト間質細胞と混合された卵巣癌細胞の同所性生着は、ヒト卵巣癌に特徴的な急速でびまん性転移行動を示すマウスモデルを提供します。このモデルでは、腫瘍細胞と間質細胞の相互作用、および腫瘍の進行と転移におけるそれらの役割の研究も可能になります。

卵巣がんは、早期のびまん性転移を特徴とし、診断時に女性の70%が転移性疾患を有しています。卵巣がんのエレガントなトランスジェニックマウスモデルが存在しますが、これらのマウスは高価で、腫瘍の発生に長い時間がかかります。腹腔内注射異種移植モデルはヒト間質を欠いており、卵巣がんの転移を正確にモデル化していません。患者由来異種移植片(PDX)でさえ、連続PDX継代がヒト間質の有意な損失を示しているため、ヒト間質微小環境を完全に再現していません。生理学的に関連性のある間質微小環境内でヒト卵巣がんを簡単にモデル化する能力は、満たされていないニーズです。ここでは、プロトコールは、ヒト卵巣癌細胞と患者由来癌関連間葉系幹細胞(CA-MSC)を組み合わせた同所性卵巣癌マウスモデルを示しています。CA-MSCは、間質微小環境の形成を促進し、卵巣がんの増殖と転移をサポートする間質前駆細胞です。 このモデルは早期に発症し、臨床症状を模倣して転移を拡散します。このモデルでは、卵巣がん細胞を発現するルシフェラーゼをCA-MSCと1:1の比率で混合し、NSGマウスの卵巣滑液包に注入します。腫瘍の成長と転移は、生物発光イメージングを使用して経時的に連続的に追跡されます。結果として生じる腫瘍は活発に増殖し、注射後14日までに腹部転移を形成します。マウスは、全身性疾患のマーカーとして体重の有意な減少と疾患負担の増加を経験しました。注射後30日目までに、マウスは>10%の体重減少と剖検のエンドポイント基準を満たし、マウスの100%で腹腔内転移が確認され、60%-80%の肺および実質肝転移が確認されました。まとめると、卵巣がん細胞と間質細胞の同所性生着は、ヒト卵巣がんの早期およびびまん性転移挙動を密接に模倣する腫瘍を生成します。さらに、このモデルは、卵巣がん細胞の役割を研究するためのツールを提供します:転移進行における間質細胞の相互作用。

卵巣がんは致命的な病気であり^{、女性のすべての}がんの死亡率は5^番目に高い1。卵巣がんのほとんどの女性は進行した段階で診断され、診断時に患者の70%に転移性転移が見られます。早期転移や診断時の進行期などの要因が、この疾患で見られる高い死亡率の一因となっています。さらに、これらのユニークな疾患特性は、腹腔内への急速な疾患移動を再現するなど、卵巣癌マウスモデルの確立に課題を提起しています^2,3,4。

腹膜の広がりを含む卵巣がんの病因は、多くの要素を含む支持性腫瘍微小環境(TME)の形成によって促進されます⁵。卵巣がんTMEの重要な構成要素の1つは、がん関連間葉系幹細胞(CA-MSC)です。CA-MSCは、卵巣がんの開始、増殖、化学療法抵抗性、および転移を促進する間質前駆細胞です^6,7。CA-MSCはまた、腫瘍関連線維症を刺激し、血管新生を誘導し、免疫微小環境を変化させることを通じて、卵巣癌TMEの形成を促進します^6,8,9。卵巣がんTMEにおけるCA-MSCの強力な機能を考えると、生理学的に関連する間質微小環境内でヒト卵巣がんをモデル化することは、卵巣がんの進行と転移を研究する上で重要です。

最近、トランスジェニックマウスモデルは、自然発生的な卵巣癌転移の研究において注目を集めています。しかし、トランスジェニックマウスは高価であり、転移性疾患の発症に長期にわたる経過を示します。腹腔内モデルや患者由来異種移植片(PDX)などの他の利用可能なマウスモデルは、比較的短い転移時間間隔を有するが、関連する間質微小環境10,11,12の欠如により、卵巣癌転移を完全に再現するわけではない。この課題を克服するために、この研究では、ヒト卵巣がん細胞と患者由来のCA-MSCを組み合わせた同所性卵巣がんマウスモデルを紹介します。ここで説明するモデルでは、CA-MSCと卵巣がん細胞を組み合わせると、注射後30日以内にマウスの100%に腹腔内転移が存在することからわかるように、早期およびびまん性転移を伴う腫瘍が生成されます。

患者のサンプルは、ピッツバーグ大学のIRB(PRO17080326)によって承認されたプロトコルに従って採取されました。動物実験法は、ピッツバーグ大学の動物管理・使用委員会によって承認されたプロトコルに基づいて実施されました。

1. 患者由来がん関連間葉系幹細胞(CA-MSC)の単離とバリデーション

注: CA-MSC は、外科的に切除されたヒト卵巣がん組織 (この研究では、卵管、卵巣、および/または大網転移性沈着物を含む高悪性度の漿液性がんを使用) に由来します。CA-MSC培地は、10%熱不活化FBS、1x B27、20 ng/mL EGF、1 ng/mLヒドロコルチゾン、5 μg/mLインスリン、100 μM β-メルカプトエタノール、10 ng/mL β-FGF、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および20 μg/mLゲンタ^{マイシン7,13}を添加したMEBM(乳腺上皮細胞基礎培地)から調製されます。

1. CA-MSCアイソレーション
   1. 滅菌メスと鉗子を使用して、組織サンプルを約1 mm³ のサイズに分割します。6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに組織片を3個入れます。
      注:0.2 gの腫瘍組織を12個に切断し、6ウェル細胞培養プレートの4つのウェルに分配できます。
   2. CA-MSC培地の薄層(ウェルごとに約1 mL)を添加します。細胞培養プレートを加湿インキュベーターに37°C、5%CO₂で置きます。
   3. 24時間後、ティッシュピースを乱さないようにメディアを慎重に取り出します。.各ウェルに約 1 mL のフレッシュ培地を加えます。ティッシュアタッチメントを乱さずに、メディアをゆっくりとピペットで動かします。細胞培養プレートを37°Cの加湿インキュベーターに5%CO₂で戻します。
      注:毎日倒立顕微鏡で組織を検査し、死細胞が培養培地で視覚化されるたびに、ステップ1.1.3で説明されているように培地を交換します。
   4. 7日後、滅菌鉗子を使用して組織片をピックアップして組織片を取り出し、接着細胞をPBS(Ca^{2 +} / Mg^{2 +}を含まないPBS、ウェルあたり1 mL)で1回洗浄します。次に、新鮮なCA-MSC培地(ウェルあたり2 mL)を加え、細胞培養プレートを5% CO₂の37°Cの加湿インキュベーターに入れます。
2. CA-MSCの拡充
   1. CA-MSCが6ウェルプレート内の組織から増殖し始めたら、細胞の成長を確認するために、1日おきに倒立顕微鏡で細胞を検査します。細胞が90%のコンフルエント度に達したら、次の手順に進みます。
   2. 細胞培養プレートから培地を吸引し、ウェルあたり1〜2 mLのPBS(Ca²⁺/Mg²⁺を含まないPBS)で細胞を1回洗浄します。
   3. 0.05%トリプシン/0.02%EDTA溶液(トリプシン/EDTA)のウェルあたり300μLを添加します。細胞培養プレートを回転させて細胞をトリプシン/ EDTAで覆い、細胞培養プレートをインキュベーターに2〜3分間、または細胞が剥離するまで戻します。
   4. 新鮮なCA-MSC培地を添加してトリプシンを不活性化し(1ウェルあたり1 mL)、細胞を再懸濁します。300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞を増殖培地で再懸濁します。再懸濁した細胞を、総量5 mLの培養培地で25 cm² フラスコに移します。
      注:6ウェル細胞培養プレートの3つのウェルから採取した細胞は、25 cm²フラスコに移すことができます。細胞は、外科的に切除されたヒト組織^14,15に由来するため、マイコプラズマの存在について試験する必要があります(PCRなどの確立されたマイコプラズマ検出プロトコルに従います)。
   5. 細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したら、前述の手順1.2.2〜1.2.4に従って、細胞を^25cm2フラスコから75cm2フラスコに移します。5〜7日ごとに細胞を増殖させて、CA-MSCの検証および同所性接種手順に必要な細胞数を取得します。
      注:CA-MSCは患者由来の細胞であるため、細胞の倍加時間は細胞株によって異なります。ほとんどのCA-MSCは、数が2倍になるのに3〜4日かかります。ただし、一部のCA-MSCは、数が2倍になるのに5〜7日かかります。CA-MSCは8-10回継代できます。通過10後、CA-MSCは老化または分化することがあります。
3. CA-MSCバリデーション
   1. CA-MSC表面発現の検証:フローサイトメトリー分析に0.5 x 10⁶ CA-MSC(75 cm²フラスコで約70%のコンフルエント)を使用して、CA-MSCが前述の国際細胞療法学会ガイドラインで定義されている適切な表面マーカーを発現していることを確認します(CD73/CD90/CD105陽性;CD45/CD34/CD14 または CD11b/CD79a または CD19/HLA-DR 陰性) ^7,16.トリプシン化後の細胞数を確認し、死細胞をトリパンブルーで排除した血球計算盤を使用してカウントします。
      注:フローサイトメトリー分析により、細胞の純度が<90%であることが示された場合は、CA-MSC集団の細胞を選別します。
   2. CA-MSC分化の検証:系統の分化を検証するには、2 mLのMSC培地(分化条件ごとに1ウェル)中の細胞密度5 x 10⁴細胞/ウェルの6ウェルプレートの1ウェルにCA-MSCを播種します。24時間後、培地を適切な分化培地に変更して、前述のように脂肪細胞対軟骨細胞対骨細胞の分化を誘導します^7,16。
      注:ISCTガイドラインに従って、MSCは少なくとも2つの系統(脂肪細胞、軟骨細胞、または骨細胞)へのin vitro分化を実証する必要があります。
4. 予定されているマウス注入手順の日に、手順1.2.2および1.2.4に従って細胞を採取します。次に、生存率のためにトリパンブルー排除を施した血球計算盤を使用して細胞をカウントし、1 x 10⁸ 細胞/mL(注射あたり0.5 x 10⁶ CA-MSC)の密度でCA-MSC培地に細胞を再懸濁します。懸濁した細胞を氷の上に置きます。
   注:一般に、少なくとも1 x 10⁷ CA-MSCは、1つの腫瘍サンプル(0.2 gの組織)から導き出すことができます。これにより、ほとんどのマウス実験で単一の患者由来CA-MSCラインを使用することができます。異なる患者由来のCA-MSCを組み合わせることは可能ですが、同じ卵巣がん組織学的サブタイプに由来することを推奨します。ほとんどのCA-MSCs系統は、1 x 10⁷ 細胞に到達するまでに2か月および/または6〜7継代かかります。CA-MSCは、標準的な細胞凍結培地を使用して凍結し、後で使用するために液体窒素で無期限に保存できます。

2. 卵巣がん細胞の作製

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)とペニシリン/ストレプトマイシン(ペニシリン:100単位/mL、ストレプトマイシン:0.1 mg/mL)を含むDMEM培地でOVCAR3-Luc細胞を維持します。細胞を37°Cで5%_CO2 加湿インキュベーターで培養します。
2. 注射当日は、以下の手順でOVCAR3-Luc細胞を採取します。
   1. まず、細胞培養フラスコから培地を吸引し、75 cm² フラスコあたり5〜7 mLのPBS(Ca²⁺/Mg²⁺を含まないPBS)で細胞を1回洗浄します。PBSを吸引し、トリプシン/ EDTA溶液(75 cm² フラスコあたり2 mL)を追加します。.次に、細胞培養フラスコをインキュベーターに3〜5分間、または細胞が剥離するまで戻します。
   2. 顕微鏡を使用して、細胞の完全なトリプシン化を確認します(すべての細胞が培養フラスコから分離されていることを確認してください)。トリプシン化を止めるには、新鮮な血清含有DMEMをフラスコ(75 cm² フラスコあたり2〜3 mL)に加えて、細胞を再懸濁します。ピペットを使用して、細胞を15mLのコニカルチューブに移します。
   3. 300 x g で5分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞を増殖培地で再懸濁します。次に、細胞をカウントし、1 x 10⁸ cell/mL(0.5 x 10⁶ OVCAR3-Luc cells per injection)の密度で増殖培地に再懸濁します。懸濁した細胞を氷の上に置きます。

3. 同所性接種

1. 細胞懸濁液の調製
   1. CA-MSC細胞とOVCAR-Luc細胞を1:1の比率で混合します。
   2. 凍結した基底膜マトリックスを氷浴で解凍します。次に、ステップ3.1.1で調製した細胞懸濁液を基底膜マトリックスに1:1(最終細胞濃度:1 x 10⁶/ 20 μLの中基底膜マトリックス)の比率で加え、完全にブレンドします。調製した細胞懸濁液は、使用するまで氷浴に保管する必要があります。
      注:ここで説明するのは、前述のモデルでの以前の経験に基づく1:1のCA-MSCとOVCAR-Lucの比率です。以前の研究では、CA-MSCは、患者組織から直接定量した場合、腫瘍細胞に対して一般的に1:10の比率であることが示されています。以下で説明するように、CA-MSCと腫瘍細胞の比率を1:1から始めると、このモデルを使用して、実験エンドポイントの初代および転移部位の両方で、CA-MSCと腫瘍細胞の比率が約1:10になります。
2. 手術
   注:手術は無菌状態で行う必要があり、無菌の手術器具を使用する必要があります。この同所性モデルには、8週齢の雌NSGマウスを使用することをお勧めします。
   1. イソフルラン(誘導4%、メンテナンス2%)と酸素(100%、流量計0.5-1 L / min)を吸入してマウスに麻酔をかけます。マウスを術前のノーズコーンシステムに置きます。手術中に麻酔を投与するには(以下の詳細な手順を参照)、マウスの頭をイソフルラン気化器のノーズコーンシステムに挿入します。
   2. インスリン注射器を使用して、術前鎮痛薬である5 mg / kgのカルプロフェンをマウスに皮下注射します。.
   3. バリカンを使用して、肋骨縁と大腿骨の間のマウスの左尾側部分を剃ります。剃った部分をポビドンヨード溶液とアルコール綿棒で滅菌します。次に、マウスを外科用ノーズコーンシステムに移し、イソフルランを1.5%に調整して維持麻酔を行います。
   4. 肋骨縁の約2〜3cm下に1〜2cmの水平皮膚切開を行います。鉗子で頭頂腹膜をつかみ、持ち上げます(腹膜は光沢があり、脂肪組織の沈着物によって特徴付けられます)。腹腔を開くために、頭頂腹膜に1cmの切開を行います。
   5. 腹膜への侵入時にマウスの卵巣(卵巣滑液包)を取り巻く脂肪組織の集まりを観察します。湾曲した鉗子を使用して、卵巣滑液包をつかんで露出させます。鉗子で卵巣をしっかりとつかみながら、ステップ3.1.2で調製した細胞懸濁液20μLを滑液包に注入します。
   6. 卵巣を慎重に腹腔に戻します。針に取り付けられた吸収性ポリグリコール酸6-0縫合糸を使用して、壁側腹膜切開のエッジを再近似します。傷口クリップで皮膚の切開を閉じます。
   7. マウスをノーズコーンから取り外し、マウスが意識を得て胸骨の横臥を維持するまで、マウスを別の清潔なケージに入れます。次に、マウスをケージに戻します。
   8. 手術後3〜7日間、マウスを毎日監視します。疼痛管理のためにマウスケージにカルプロフェンジェルのカップを置きます。術後7〜10日で創傷クリップを取り外します。

4. 腫瘍の増殖とマウスの体重を毎週モニタリングする

1. In Vivoイメージングシステム(IVIS):同所性接種後1週間目から、次の3〜4週間は毎週 in vivo イメージングを実施します。
   1. D-ルシフェリン(ホタルルシフェラーゼの基質)の溶液を調製するには、15 mgを1 mLのPBSに溶解し、0.22 μmのメンブレンでろ過して滅菌します。
   2. IVISは、製造元の指示に従って操作してください。 Living Image Software のデスクトップアイコンをクリックします。次に、IVIS Acquisition Control Panel で [Initialize] を選択します。この手順には最大10〜15分かかる場合があります。この間に、イメージングのためにマウスを準備します。
   3. IVISに接続されたイソフルランチャンバーを使用して各マウスに麻酔をかけます(2%-4%イソフルランおよび酸素流量計は0.5-1 L / min)。D-ルシフェリン(100μL / 10 g体重)をインスリン注射器を使用した腹腔内注射で注射します。.
   4. ルシフェリンを注射した動物をイソフルランチャンバーに戻します。.
      注: 研究全体を通してルシフェリン注射とイメージング性能の間の時間を一定に保つために、注射時間を記録することが重要です。
   5. 麻酔をかけたマウスをイメージングチャンバーに移し、イメージングシステムを適切な設定に設定します。その後、適切なタイミングで画像を取得します。
   6. 画像を保存した後、マウスをイメージングチャンバーから取り出し、それぞれのケージに戻します。
      注:CA-MSCは、IVISの蛍光チャネルを使用して in vivo でモニターされたCA-MSCおよびOVCAR3-Luc細胞の遊走/共転移および蛍光タグで標識することもできます。

5. CA-MSCの評価:腫瘍細胞転移性沈着物

1. 事前に定義されたエンドポイント (腹水の存在下での体重増加 >20%)、体重減少 <10%、腫瘍潰瘍、ボディコンディショニング スコアが 2 以下¹⁷) に到達したら、施設の動物福祉基準に従ってマウスを安楽死させます。
2. 各マウスで個別に剖検を行います。腹水腫を吸引するために、18 Gの滅菌針を腹腔内に配置します。.次に、胸部と腹腔を露出させます。マウス臓器の腫瘍関与の目視検査により、肉眼的転移性疾患を定量化する¹⁸.
3. 滅菌メスを使用して腫瘍組織を切除し、i)パラホルムアルデヒドに固定して最終的なパラフィン包埋を行う、ii)瞬間凍結してOTCクライオスタット包埋培地に埋め込む、iii)瞬間凍結して下流のDNA、RNAまたはタンパク質分析を行う、またはiv)フローサイトメトリーまたはFACS単離のために単一細胞に解離します。
   注:CA-MSCは、このモデルでも引き続き使用可能であり、ダウンストリームアプリケーション用に再分離できます。研究の目的に応じて、CA-MSCと腫瘍細胞の相互作用は、免疫組織化学的アプローチ、フローサイトメトリーアプローチ、または培養中の再単離細胞の維持によって調査できます。

記載されているアプローチは、患者由来の間葉系幹細胞(CA-MSC)と卵巣がん細胞を卵巣滑液包に同時注入することにより、卵巣がん(特に高悪性度漿液性がん)の支持微小環境を密接に模倣しています。まず、CA-MSCは、大網が関与する外科的に切除された原発性のヒト高悪性度漿液性卵巣癌から単離されました(この実験で使用されたすべてのCA-MSCは同じ患者に由来してい?...

多大な臨床および研究努力にもかかわらず、卵巣がんの治療と予防における進歩は最小限にとどまっています¹。卵巣がんの進行と転移を研究するために、さまざまなマウスモデルが用いられてきたが、これらのモデルには大きな限界がある。特に、以前のマウスモデルでは、早期のびまん性腹腔内転移の特徴を含む卵巣がんの進行の自然史を完全?...

著者は、競合する利益を宣言しません。

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