Um modelo ortotópico de câncer de ovário em camundongos usando estroma humano para promover metástases

O enxerto ortotópico de células de câncer de ovário misturadas com células estromais humanas fornece um modelo de camundongo que exibe um comportamento metastático rápido e difuso que é característico do câncer de ovário humano. Este modelo também permite o estudo das interações entre células tumorais e células estromais, bem como seu papel na progressão e metástase tumoral.

O câncer de ovário é caracterizado por metástase precoce e difusa, com 70% das mulheres apresentando doença metastática no momento do diagnóstico. Embora existam modelos elegantes de camundongos transgênicos de câncer de ovário, esses camundongos são caros e levam muito tempo para desenvolver tumores. Os modelos de xenoenxerto de injeção intraperitoneal não possuem estroma humano e não modelam com precisão a metástase do câncer de ovário. Mesmo os xenoenxertos derivados de pacientes (PDX) não recapitulam totalmente o microambiente estromal humano, pois as passagens seriadas de PDX demonstram perda significativa de estroma humano. A capacidade de modelar facilmente o câncer de ovário humano dentro de um microambiente estromal fisiologicamente relevante é uma necessidade não atendida. Aqui, o protocolo apresenta um modelo ortotópico de camundongo com câncer de ovário usando células de câncer de ovário humano combinadas com células-tronco mesenquimais associadas ao carcinoma derivado do paciente (CA-MSCs). As CA-MSCs são células progenitoras estromais, que impulsionam a formação do microambiente estromal e suportam o crescimento e a metástase do câncer de ovário. Este modelo desenvolve metástase precoce e difusa mimetizando a apresentação clínica. Neste modelo, as células de câncer de ovário que expressam luciferase são misturadas em uma proporção de 1:1 com CA-MSCs e injetadas na bursa ovariana de camundongos NSG. O crescimento e a metástase do tumor são acompanhados em série ao longo do tempo usando imagens de bioluminescência. Os tumores resultantes crescem agressivamente e formam metástases abdominais 14 dias após a injeção. Os camundongos experimentaram reduções significativas no peso corporal como um marcador de doença sistêmica e aumento da carga de doenças. No dia 30 após a injeção, os camundongos atenderam aos critérios finais de perda de peso corporal de >10% e a necropsia confirmou metástase intra-abdominal em 100% dos camundongos e 60% -80% de metástase pulmonar e hepática parenquimatosa. Coletivamente, o enxerto ortotópico de células de câncer de ovário e células do estroma gera tumores que imitam de perto o comportamento metastático precoce e difuso do câncer de ovário humano. Além disso, este modelo fornece uma ferramenta para estudar o papel das interações entre células do câncer de ovário e células do estroma na progressão metastática.

O câncer de ovário é uma doença mortal com a^5ª maior taxa de mortalidade de todos os cânceres em mulheres¹. A maioria das mulheres com câncer de ovário é diagnosticada em estágio avançado, com disseminação metastática presente em 70% das pacientes no momento do diagnóstico. Fatores como metástases precoces e estágio avançado ao diagnóstico contribuem para as altas taxas de mortalidade observadas com essa doença. Além disso, essas características únicas da doença representaram um desafio para o estabelecimento de modelos de camundongos com câncer de ovário, incluindo a reprodução da rápida migração da doença para a cavidade peritoneal ^2,3,4.

A patogênese do câncer de ovário, incluindo a disseminação peritoneal, é facilitada pela formação de um microambiente tumoral de suporte (TME) que compreende muitos elementos⁵. Um componente crítico do TME do câncer de ovário é a célula-tronco mesenquimal associada ao carcinoma (CA-MSC). As CA-MSCs são células progenitoras estromais que aumentam a iniciação, o crescimento, a resistência à quimioterapia e a metástase^do câncer de ovário ^6,7. As CA-MSCs também impulsionam a formação do TME do câncer de ovário por meio da estimulação da fibrose associada ao tumor, induzindo a angiogênese e alterando o microambiente imunológico ^6,8,9. Dadas as poderosas funções das CA-MSCs no TME do câncer de ovário, modelar o câncer de ovário humano dentro de um microambiente estromal fisiologicamente relevante é fundamental no estudo da progressão e metástase do câncer de ovário.

Recentemente, modelos de camundongos transgênicos ganharam atração no estudo de metástases espontâneas de câncer de ovário. No entanto, os camundongos transgênicos são caros e exibem um curso de tempo prolongado para o desenvolvimento de doença metastática. Embora outros modelos de camundongos disponíveis, como o modelo intraperitoneal e os xenoenxertos derivados de pacientes (PDX), tenham intervalos de tempo metastáticos relativamente curtos, eles não recapitulam totalmente as metástases do câncer de ovário devido à falta de um microambiente estromal relevante 10,11,12. Na tentativa de superar esse desafio, este estudo apresenta um modelo ortotópico de camundongo com câncer de ovário usando células de câncer de ovário humano combinadas com CA-MSCs derivadas de pacientes. No modelo aqui descrito, a combinação de CA-MSCs com células de câncer de ovário gera tumores com metástases precoces e difusas, como demonstrado pela presença de metástases intra-abdominais em 100% dos camundongos dentro de 30 dias após a injeção.

As amostras dos pacientes foram obtidas de acordo com os protocolos aprovados pelo IRB da Universidade de Pittsburgh (PRO17080326). Os métodos experimentais em animais foram conduzidos sob o protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh.

1. Isolamento e validação de células-tronco mesenquimais associadas ao carcinoma derivado de pacientes (CA-MSCs)

NOTA: As CA-MSCs são derivadas de tecido de câncer de ovário humano ressecado cirurgicamente (este estudo usa carcinoma seroso de alto grau), incluindo a trompa de Falópio, ovário e/ou depósitos metastáticos omentais. O meio CA-MSC é preparado a partir de MEBM (meio basal de células epiteliais mamárias) suplementado com 10% de FBS inativado por calor, 1x B27, 20 ng/mL de EGF, 1 ng/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina, 100 μM de β-mercaptoetanol, 10 ng/mL de β-FGF, 1% de penicilina/estreptomicina e 20 μg/mL de gentamicina ^7,13.

1. Isolamento CA-MSC
   1. Usando um bisturi estéril e uma pinça, divida a amostra de tecido em pedaços de aproximadamente 1 mm^{e 3} de tamanho. Coloque três pedaços do tecido em cada poço de uma placa de cultura de células de 6 poços.
      NOTA: 0,2 g do tecido tumoral pode ser cortado em 12 pedaços e pode ser distribuído em quatro poços de uma placa de cultura de células de 6 poços.
   2. Adicione uma fina camada de meio CA-MSC, aproximadamente 1 mL para cada poço. Coloque a placa de cultura de células em uma incubadora umidificada a 37 ° C em 5% de CO₂.
   3. Após 24 h, remova a mídia com cuidado sem perturbar os pedaços de tecido. Adicione aproximadamente 1 mL de meio fresco a cada poço. Pipete o meio lentamente sem perturbar as fixações do tecido. Volte a colocar a placa de cultura de células numa incubadora humidificada a 37 °C a 5% de CO₂.
      NOTA: Examine o tecido com um microscópio invertido todos os dias e troque o meio conforme descrito na etapa 1.1.3 sempre que as células mortas forem visualizadas no meio de cultura.
   4. Após 7 dias, remova os pedaços de tecido pegando o tecido usando uma pinça estéril e lave as células aderentes uma vez com PBS (PBS sem Ca²⁺/Mg²⁺, 1 mL por poço). Em seguida, adicione meio CA-MSC fresco (2 mL por alvéolo) e coloque a placa de cultura de células em uma incubadora umidificada a 37 ° C em 5% de CO₂.
2. Expansão de CA-MSCs
   1. Quando as CA-MSCs começarem a crescer a partir do tecido dentro da placa de 6 poços, examine as células com um microscópio invertido a cada dois dias para garantir o crescimento celular. Quando as células atingirem 90% de confluência, prossiga com as etapas a seguir.
   2. Aspire o meio da placa de cultura de células e, em seguida, lave as células uma vez com 1-2 mL de PBS por alvéolo (PBS sem Ca²⁺/Mg²⁺).
   3. Adicione 300 μL por alvéolo de solução de tripsina a 0,05% / EDTA a 0,02% (tripsina / EDTA). Gire a placa de cultura de células para cobrir as células com tripsina / EDTA e retorne a placa de cultura de células para a incubadora por 2-3 min ou até que as células estejam separadas.
   4. Adicione meio CA-MSC fresco para inativar a tripsina (1 mL por poço) e ressuspenda as células. Centrifugue a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células com meio de crescimento. Transferir as células ressuspensas para um balão de 25 cm² com um volume total de 5 ml de meios de cultura.
      NOTA: As células coletadas de três poços de placa de cultura de células de 6 poços podem ser transferidas para um balão de 25 cm². As células devem ser testadas para a presença de micoplasma (seguindo um protocolo de detecção de micoplasma estabelecido, como PCR), uma vez que são derivadas de tecido humano ressecado cirurgicamente^14,15.
   5. Quando as células atingirem 70%-80% de confluência, transfira as células de um balão de 25 cm² para um balão de 75 cm² seguindo as etapas 1.2.2-1.2.4 descritas anteriormente. Expanda as células a cada 5-7 dias para obter o número de células necessário para a validação do CA-MSC e para o procedimento de inoculação ortotópica.
      NOTA: Como as CA-MSCs são células derivadas do paciente, o tempo de duplicação celular difere entre as linhagens celulares. A maioria dos CA-MSCs requer de 3 a 4 dias para dobrar de número. No entanto, alguns CA-MSCs requerem de 5 a 7 dias para dobrar de número. CA-MSCs podem ser passados de 8 a 10 vezes. Após a passagem 10, as CA-MSCs podem senescer ou se diferenciar.
3. Validação CA-MSC
   1. Validação da expressão de superfície de CA-MSC: Use 0,5 x 10⁶ CA-MSCs (aproximadamente 70% de confluência em um frasco de 75 cm²) para análise de citometria de fluxo para garantir que CA-MSCs expressem marcadores de superfície apropriados, conforme definido pelas diretrizes da International Society for Cellular Therapy, conforme descrito anteriormente (CD73 / CD90 / CD105 positivo; CD45/CD34/CD14 ou CD11b/CD79a ou CD19/HLA-DR negativo)^7,16. Confirme o número de células após a tripsinização e conte usando um hemocitômetro com exclusão de azul de tripano de células mortas.
      NOTA: Se a análise de citometria de fluxo demonstrar que as células são <90% puras, classifique as células para a população CA-MSC.
   2. Validação da diferenciação CA-MSC: Para validar a diferenciação de linhagem, semeie CA-MSCs em um poço de uma placa de 6 poços com uma densidade celular de 5 x 10⁴ células/poço em 2 mL de meio MSC (um poço por condição de diferenciação). Após 24 h, mude o meio para o meio de diferenciação apropriado para induzir a diferenciação adipócito vs condrócito vs osteócito, conforme descrito anteriormente ^7,16.
      NOTA: De acordo com as diretrizes do ISCT, as MSCs devem demonstrar diferenciação in vitro em pelo menos duas linhagens (adipócito, condrócito ou osteócito).
4. No dia do procedimento de injecção planeada no ratinho, recolher as células seguindo os passos 1.2.2 e 1.2.4. Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro com exclusão de azul de tripano para viabilidade e ressuspenda as células em meio CA-MSC a uma densidade de 1 x 10⁸ células / mL (0,5 x 10⁶ CA-MSCs por injeção). Coloque as células suspensas sobre o gelo.
   NOTA: Geralmente, pelo menos 1 x 10⁷ CA-MSCs podem ser derivadas de uma amostra de tumor (0,2 g de tecido). Isso permite que uma única linha CA-MSC derivada do paciente seja usada para a maioria dos experimentos com camundongos. É possível combinar CA-MSCs de diferentes pacientes, mas recomendamos que elas sejam derivadas do mesmo subtipo histológico de câncer de ovário. A maioria das linhas CA-MSCs leva 2 meses e/ou 6-7 passagens para atingir 1 x 10⁷ células. As CA-MSCs podem ser congeladas usando meios de congelamento de células padrão e armazenadas em nitrogênio líquido indefinidamente para uso posterior.

2. Preparação das células cancerígenas do ovário

1. Manter células OVCAR3-Luc em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e penicilina/estreptomicina (penicilina: 100 unidades/mL, estreptomicina: 0,1 mg/mL). Cultivar células a 37 °C em incubadora umidificada com 5% de CO₂ .
2. No dia da injeção, colete as células OVCAR3-Luc usando as etapas a seguir.
   1. Primeiro, aspire o meio do frasco de cultura de células e lave as células uma vez com 5-7 mL de PBS por frasco de 75 cm² (PBS sem Ca²⁺/Mg²⁺). Aspirar o PBS e adicionar a solução de tripsina/EDTA (2 ml por balão^{de 75 cm 2} ). Em seguida, retorne o frasco de cultura de células à incubadora por 3-5 minutos ou até que as células sejam destacadas.
   2. Usando microscopia, certifique-se de tripsinização completa das células (certifique-se de que todas as células estejam separadas do frasco de cultura). Para interromper a tripsinização, adicione DMEM contendo soro fresco ao frasco (2-3 mL por frasco de 75 cm² ) e ressuspenda as células. Usando uma pipeta, transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
   3. Centrifugue a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células com meio de crescimento. Em seguida, conte as células e ressuspenda em meio de crescimento a uma densidade de 1 x 10⁸ células / mL (0,5 x 10⁶ células OVCAR3-Luc por injeção). Coloque as células suspensas sobre o gelo.

3. Inoculação ortotópica

1. Preparação da suspensão celular
   1. Misture células CA-MSCs e OVCAR-Luc na proporção de 1:1.
   2. Descongele a matriz da membrana basal congelada em um banho de gelo. Em seguida, adicione a suspensão celular preparada na etapa 3.1.1 à matriz da membrana basal na proporção de 1:1 (concentração celular final: 1 x 10⁶/20 μL de matriz da membrana basal média) e misture bem. As suspensões celulares preparadas devem ser mantidas em banho de gelo até o uso.
      NOTA: Aqui está descrita uma relação CA-MSC para OVCAR-Luc de 1:1 com base na experiência anterior com o modelo mencionado. Trabalhos anteriores demonstram que as CA-MSCs geralmente estão em uma proporção de 1:10 para as células tumorais quando quantificadas diretamente do tecido do paciente. Conforme discutido abaixo, começar com uma proporção de 1:1 CA-MSC para células tumorais produz uma proporção aproximada de 1:10 de CA-MSC para células tumorais nos locais primários e metastáticos em pontos finais experimentais usando este modelo.
2. Cirurgia
   NOTA: A cirurgia deve ser realizada em condições estéreis e instrumentos cirúrgicos estéreis devem ser usados. Recomenda-se que camundongos NSG fêmeas com 8 semanas de idade sejam usados para este modelo ortotópico.
   1. Anestesiar o camundongo por inalação com isoflurano (4% para indução, 2% para manutenção) e oxigênio (100%, medidor de vazão 0,5-1 L/min). Coloque o mouse no sistema de cone nasal pré-cirúrgico. Para administrar anestesia durante a cirurgia (veja as instruções detalhadas abaixo), insira a cabeça do camundongo no sistema de cone nasal do vaporizador de isoflurano.
   2. Injete subcutaneamente no camundongo 5 mg / kg de carprofeno, um analgésico pré-cirúrgico, com uma seringa de insulina.
   3. Usando uma tesoura, raspe a porção caudal esquerda do mouse entre a margem costal e o fêmur. Esterilize a área depilada com solução de iodopovidona e compressas com álcool. Em seguida, transfira o mouse para o sistema cirúrgico de cone nasal e ajuste o isoflurano a 1,5% para anestesia de manutenção.
   4. Faça uma incisão horizontal na pele de 1-2 cm aproximadamente 2-3 cm abaixo da margem costal. Segure o peritônio parietal com uma pinça e eleve (o peritônio parecerá brilhante e será caracterizado por depósitos de tecido adiposo). Faça uma incisão de 1 cm no peritônio parietal para abrir a cavidade abdominal.
   5. Observe a coleção de tecido adiposo ao redor do ovário do camundongo (a bursa ovariana) na entrada peritoneal. Use uma pinça curva para agarrar e expor a bursa ovariana. Enquanto segura firmemente o ovário com a pinça, injete 20 μL da suspensão celular preparada na etapa 3.1.2 na bursa.
   6. Retorne cuidadosamente o ovário à cavidade abdominal. Usando uma sutura absorvível de ácido poliglicólico 6-0 presa a uma agulha, reaproxime as bordas da incisão peritoneal parietal. Feche a incisão na pele com clipes de ferida.
   7. Remova o mouse do cone do nariz e coloque-o em uma gaiola limpa separada sob luz quente até que ele ganhe consciência e mantenha a decúbito esternal. Em seguida, retorne o mouse para sua gaiola.
   8. Monitore os camundongos diariamente por 3-7 dias após a cirurgia. Coloque uma xícara de gel de carprofeno nas gaiolas do camundongo para controle da dor. Remova os clipes da ferida 7 a 10 dias após a cirurgia.

4. Monitorando o crescimento do tumor e o peso corporal do camundongo semanalmente

1. Sistema de imagem in vivo (IVIS): A partir da primeira semana após a inoculação ortotópica, realize imagens in vivo todas as semanas durante as próximas 3-4 semanas.
   1. Prepare a solução de D-luciferina (substrato da luciferase do vaga-lume) dissolvendo 15 mg em 1 mL de PBS e filtrando através de uma membrana de 0,22 μm para esterilização.
   2. Opere o IVIS seguindo as instruções do fabricante. Clique no ícone da área de trabalho do Living Image Software . Em seguida, no Painel de Controle de Aquisição do IVIS, selecione Inicializar. Esta etapa pode levar de 10 a 15 minutos. Durante esse tempo, prepare os camundongos para a imagem.
   3. Anestesiar cada camundongo usando a câmara de isoflurano conectada ao IVIS (2%-4% de isoflurano e medidor de fluxo de oxigênio a 0,5-1 L/min). Injete a D-luciferina (100 μL / 10 g de peso corporal) por injeção intraperitoneal usando uma seringa de insulina.
   4. Coloque o animal injetado com luciferina de volta na câmara de isoflurano.
      NOTA: É importante registrar o tempo de injeção para manter o tempo consistente entre a injeção de luciferina e o desempenho da imagem durante todo o estudo.
   5. Transfira o mouse anestesiado para a câmara de imagem e defina o sistema de imagem para as configurações apropriadas. Em seguida, adquira a imagem no momento apropriado.
   6. Depois de salvar as imagens, remova os camundongos da câmara de imagem e coloque-os de volta em suas respectivas gaiolas.
      NOTA: CA-MSCs também podem ser marcadas com uma etiqueta fluorescente e migração / co-metástase de células CA-MSCs e OVCAR3-Luc monitoradas in vivo usando um canal fluorescente no IVIS.

5. Avaliação de CA-MSC: depósitos metastáticos de células tumorais

1. Ao atingir seu desfecho pré-definido (ganho de peso >20% com presença de ascite, perda de peso <10%, ulceração tumoral, escore de condicionamento corporal de 2 ou menos¹⁷), eutanasiar os camundongos de acordo com os padrões institucionais de bem-estar animal.
2. Realize a necropsia em cada camundongo individualmente. Coloque uma agulha estéril de 18 G por via intraperitoneal para aspirar qualquer ascite. Em seguida, exponha a cavidade torácica e abdominal. Quantificar a doença metastática macroscópica por meio da inspeção visual do envolvimento tumoral de órgãos murinos¹⁸.
3. Remova o tecido tumoral usando um bisturi estéril e i) fixe em paraformaldeído para eventual inclusão de parafina, ii) congelamento instantâneo e incorporação em meio de inclusão de criostato OTC, iii) congelamento instantâneo para análise de DNA, RNA ou proteína a jusante, ou iv) dissocie em células únicas para citometria de fluxo ou isolamento FACS.
   NOTA: CA-MSCs permanecem viáveis neste modelo e podem ser re-isolados para aplicações downstream. Dependendo do objetivo do estudo, as interações CA-MSC com células tumorais podem ser investigadas por meio de abordagens imuno-histoquímicas, abordagens de citometria de fluxo ou manutenção de células reisoladas em cultura.

A abordagem descrita imita de perto o microambiente de suporte do câncer de ovário (em particular, carcinoma seroso de alto grau) por meio da co-injeção de células-tronco mesenquimais derivadas do paciente (CA-MSCs) e células de câncer de ovário na bursa ovariana. Primeiro, as CA-MSCs foram isoladas de câncer de ovário seroso de alto grau humano primário e ressecado cirurgicamente envolvendo o omento (todas as CA-MSCs usadas neste experimento foram derivadas do mesmo paciente)...

Apesar dos esforços clínicos e de pesquisa significativos, progressos mínimos foram feitos no tratamento e prevenção do câncer de ovário¹. Embora uma variedade de modelos de camundongos tenha sido usada para estudar a progressão e metástases do câncer de ovário, esses modelos enfrentaram limitações significativas. Em particular, modelos anteriores de camundongos foram incapazes de recapitular completamente a história natural da progressão do câncer...

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Gostaríamos de agradecer ao Programa de Bioespécimes de Oncologia Ginecológica-Promark pela ajuda na coleta de tecidos. A LGC é apoiada pelo Tina's Wish Rising Star Grant e pela The Mary Kay Foundation.