Un modelo ortotópico de ratón de cáncer de ovario que utiliza el estroma humano para promover la metástasis

El injerto ortotópico de células de cáncer de ovario mezcladas con células estromales humanas proporciona un modelo de ratón que exhibe un comportamiento metastásico rápido y difuso que es característico del cáncer de ovario humano. Este modelo también permite estudiar las interacciones entre las células tumorales y las células estromalas, así como su papel en la progresión tumoral y la metástasis.

El cáncer de ovario se caracteriza por metástasis precoz y difusa, y el 70% de las mujeres tienen enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico. Si bien existen elegantes modelos de ratones transgénicos de cáncer de ovario, estos ratones son caros y tardan mucho tiempo en desarrollar tumores. Los modelos de xenoinjerto de inyección intraperitoneal carecen de estroma humano y no modelan con precisión la metástasis del cáncer de ovario. Incluso los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) no recapitulan completamente el microambiente del estroma humano, ya que los pasajes de PDX en serie demuestran una pérdida significativa del estroma humano. La capacidad de modelar fácilmente el cáncer de ovario humano dentro de un microambiente estromal fisiológicamente relevante es una necesidad insatisfecha. Aquí, el protocolo presenta un modelo de ratón de cáncer de ovario ortotópico que utiliza células de cáncer de ovario humano combinadas con células madre mesenquimales asociadas al carcinoma derivado del paciente (CA-MSC). Las CA-MSC son células progenitoras del estroma, que impulsan la formación del microambiente estromal y apoyan el crecimiento y la metástasis del cáncer de ovario. Este modelo se desarrolla precozmente y difunde la metástasis imitando la presentación clínica. En este modelo, las células de cáncer de ovario que expresan luciferasa se mezclan en una proporción de 1:1 con las CA-MSC y se inyectan en la bolsa ovárica de los ratones NSG. El crecimiento tumoral y la metástasis se siguen en serie a lo largo del tiempo mediante imágenes de bioluminiscencia. Los tumores resultantes crecen agresivamente y forman metástasis abdominales a los 14 días después de la inyección. Los ratones experimentaron disminuciones significativas en el peso corporal como marcador de enfermedad sistémica y una mayor carga de enfermedad. Al día 30 después de la inyección, los ratones cumplieron con los criterios finales de >10% de pérdida de peso corporal y la necropsia confirmó metástasis intraabdominales en el 100% de los ratones y 60%-80% de metástasis pulmonares y hepáticas parenquimatosas. En conjunto, el injerto ortotópico de células de cáncer de ovario y células del estroma genera tumores que imitan de cerca el comportamiento metastásico temprano y difuso del cáncer de ovario humano. Además, este modelo proporciona una herramienta para estudiar el papel de las interacciones entre las células del cáncer de ovario y las células del estroma en la progresión metastásica.

El cáncer de ovario es una enfermedad mortal con la^5ª tasa de mortalidad más alta de todos los cánceres en las mujeres¹. La mayoría de las mujeres con cáncer de ovario se diagnostican en una etapa avanzada, con diseminación metastásica presente en el 70% de las pacientes en el momento del diagnóstico. Factores como las metástasis precoces y el estadio avanzado en el momento del diagnóstico contribuyen a las altas tasas de mortalidad observadas con esta enfermedad. Además, estas características únicas de la enfermedad han planteado un desafío para el establecimiento de modelos de ratón con cáncer de ovario, incluida la reproducción de la migración rápida de la enfermedad a la cavidad peritoneal ^2,3,4.

La patogenia del cáncer de ovario, incluida la diseminación peritoneal, se ve facilitada por la formación de un microambiente tumoral de soporte (TME) que comprende muchos elementos⁵. Un componente crítico del cáncer de ovario TME es la célula madre mesenquimal asociada al carcinoma (CA-MSC). Las CA-MSC son células progenitoras del estroma que mejoran el inicio, el crecimiento, la resistencia a la quimioterapia y la metástasis del cáncer de ovario ^6,7. Las CA-MSC también impulsan la formación del cáncer de ovario TME a través de la estimulación de la fibrosis asociada al tumor, la inducción de la angiogénesis y la alteración del microambiente inmunitario ^6,8,9. Dadas las poderosas funciones de las CA-MSC dentro del cáncer de ovario TME, el modelado del cáncer de ovario humano dentro de un microambiente estromal fisiológicamente relevante es fundamental para estudiar la progresión y la metástasis del cáncer de ovario.

Recientemente, los modelos de ratones transgénicos han ganado atractivo en el estudio de las metástasis espontáneas del cáncer de ovario. Sin embargo, los ratones transgénicos son costosos y presentan un curso de tiempo prolongado para el desarrollo de la enfermedad metastásica. Mientras que otros modelos de ratón disponibles, como el modelo intraperitoneal y los xenoinjertos derivados del paciente (PDX), tienen intervalos de tiempo metastásicos relativamente cortos, no recapitulan completamente las metástasis del cáncer de ovario debido a la falta de un microambiente estromal relevante 10,11,12. En un intento por superar este desafío, este estudio presenta un modelo de ratón de cáncer de ovario ortotópico que utiliza células de cáncer de ovario humano combinadas con CA-MSC derivadas de pacientes. En el modelo aquí descrito, la combinación de CA-MSCs con células de cáncer de ovario genera tumores con metástasis precoces y difusas, como lo demuestra la presencia de metástasis intraabdominales en el 100% de los ratones dentro de los 30 días posteriores a la inyección.

Las muestras de los pacientes se obtuvieron de acuerdo con los protocolos aprobados por el IRB (PRO17080326) de la Universidad de Pittsburgh. Los métodos experimentales con animales se llevaron a cabo bajo el protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh.

1. Aislamiento y validación de células madre mesenquimales asociadas a carcinoma derivado de pacientes (CA-MSCs)

NOTA: Las CA-MSC se derivan de tejido de cáncer de ovario humano resecado quirúrgicamente (este estudio utiliza carcinoma seroso de alto grado), incluidos los depósitos metastásicos de trompas de Falopio, ovario y/o epiplón. El medio CA-MSC se prepara a partir de MEBM (medio basal de células epiteliales mamarias) suplementado con 10% de FBS inactivado por calor, 1x B27, 20 ng/mL de EGF, 1 ng/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina, 100 μM de β-mercaptoetanol, 10 ng/mL de β-FGF, 1% de penicilina/estreptomicina y 20 μg/mL de gentamicina ^7,13.

1. Aislamiento CA-MSC
   1. Con un bisturí estéril y fórceps, divida la muestra de tejido en trozos de aproximadamente 1 mm³ de tamaño. Coloque tres piezas de tejido en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 6 pocillos.
      NOTA: 0,2 g del tejido tumoral se pueden cortar en 12 pedazos y se pueden distribuir en cuatro pocillos de una placa de cultivo celular de 6 pocillos.
   2. Agregue una capa delgada de medio CA-MSC, aproximadamente 1 mL por cada pocillo. Coloque la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂.
   3. Después de 24 h, retire el medio con cuidado sin alterar los trozos de tejido. Agregue aproximadamente 1 mL de medio fresco a cada pocillo. Pipetee el medio lentamente sin alterar los accesorios del tejido. Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂.
      NOTA: Examine el tejido con un microscopio invertido todos los días y cambie el medio como se describe en el paso 1.1.3 siempre que se visualicen células muertas en el medio de cultivo.
   4. Pasados 7 días, retirar los trozos de tejido recogiendo el tejido con pinzas estériles y lavar las células adherentes una vez con PBS (PBS sin Ca²⁺/Mg²⁺, 1 mL por pocillo). A continuación, agregue medio CA-MSC fresco (2 mL por pocillo) y coloque la placa de cultivo celular en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Expansión de las CA-MSC
   1. Cuando las CA-MSC comiencen a crecer a partir del tejido dentro de la placa de 6 pocillos, examine las células con un microscopio invertido cada dos días para garantizar el crecimiento celular. Una vez que las celdas alcancen el 90% de confluencia, continúe con los siguientes pasos.
   2. Aspire el medio de la placa de cultivo celular, luego lave las células una vez con 1-2 mL de PBS por pocillo (PBS sin Ca²⁺/Mg²⁺).
   3. Añadir 300 μL por pocillo de solución de tripsina al 0,05%/EDTA al 0,02% (tripsina/EDTA). Gire la placa de cultivo celular para cubrir las células con tripsina/EDTA y devuelva la placa de cultivo celular a la incubadora durante 2-3 minutos o hasta que las células se desprendan.
   4. Agregue medio CA-MSC fresco para inactivar la tripsina (1 mL por pocillo) y vuelva a suspender las células. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con medio de crecimiento. Transfiera las células resuspendidas a un matraz de 25^cm2 con un volumen total de 5 mL de medio de cultivo.
      NOTA: Las células recogidas de tres pocillos de placa de cultivo celular de 6 pocillos pueden transferirse a un matraz de 25^cm2. Las células deben ser analizadas para detectar la presencia de micoplasma (siguiendo un protocolo de detección de micoplasma establecido, como la PCR), ya que se derivan de tejido humano resecado quirúrgicamente^14,15.
   5. Una vez que las células alcancen el 70%-80 % de confluencia, transfiera las células de un matraz de 25^cm2 a un matraz de 75^cm2 siguiendo los pasos 1.2.2-1.2.4 descritos anteriormente. Expanda las células cada 5-7 días para obtener el número de células necesario para la validación de CA-MSC y para el procedimiento de inoculación ortotópica.
      NOTA: Dado que las CA-MSC son células derivadas del paciente, el tiempo de duplicación celular difiere entre las líneas celulares. La mayoría de los CA-MSC requieren de 3 a 4 días para duplicar su número. Sin embargo, algunos CA-MSC requieren de 5 a 7 días para duplicar su número. Los CA-MSC se pueden pasar de 8 a 10 veces. Después del paso 10, las CA-MSC pueden senescencia o diferenciarse.
3. Validación CA-MSC
   1. Validación de la expresión superficial de CA-MSC: Utilice 0,5 x 10⁶ CA-MSC (aproximadamente 70% de confluencia en un matraz de 75^cm2) para el análisis de citometría de flujo para garantizar que las CA-MSC expresen los marcadores de superficie apropiados según lo definido por las directrices de la Sociedad Internacional de Terapia Celular, como se describió anteriormente (CD73/CD90/CD105 positivo; CD45/CD34/CD14 o CD11b/CD79a o CD19/HLA-DR negativo)^7,16. Confirme el número de células después de la tripsinización y recuéntelo con un hemocitómetro con exclusión de células muertas con azul de tripano.
      NOTA: Si el análisis de citometría de flujo demuestra que las células tienen una pureza del <90%, clasifique las células para la población de CA-MSC.
   2. Validación de la diferenciación de CA-MSC: Para validar la diferenciación del linaje, siembre las CA-MSC en un pocillo de una placa de 6 pocillos a una densidad de celdas de 5 x 10⁴ células/pocillo en 2 mL de medio MSC (un pocillo por condición de diferenciación). A las 24 h, cambiar el medio por el medio de diferenciación adecuado para inducir la diferenciación de adipocitos vs condrocitos vs osteocitos como se ha descrito anteriormente ^7,16.
      NOTA: De acuerdo con las directrices de la ISCT, las MSC deben demostrar diferenciación in vitro en al menos dos líneas (adipocito, condrocito u osteocito).
4. El día del procedimiento de inyección en ratón, recoja las células siguiendo los pasos 1.2.2 y 1.2.4. A continuación, se contabilizan las células con un hemocitómetro con exclusión de tripano-azul para comprobar la viabilidad y se vuelven a suspender las células en medio CA-MSC a una densidad de 1 x 10⁸ células/ml (0,5 x 10⁶ CA-MSC por inyección). Coloque las celdas suspendidas sobre hielo.
   NOTA: Por lo general, se pueden derivar al menos 1 x 10⁷ CA-MSC de una muestra tumoral (0,2 g de tejido). Esto permite utilizar una sola línea CA-MSC derivada del paciente para la mayoría de los experimentos con ratones. Es posible combinar CA-MSC de diferentes pacientes, pero recomendamos que se deriven del mismo subtipo histológico de cáncer de ovario. La mayoría de las líneas CA-MSC tardan 2 meses y/o 6-7 pasajes en alcanzar 1 x 10⁷ celdas. Las CA-MSC se pueden congelar utilizando medios de congelación de celdas estándar y almacenarse en nitrógeno líquido indefinidamente para su uso posterior.

2. Preparación de las células de cáncer de ovario

1. Mantener las células OVCAR3-Luc en medio DMEM con 10% de suero fetal bovino (FBS) y penicilina/estreptomicina (penicilina: 100 unidades/mL, estreptomicina: 0,1 mg/mL). Cultivo de células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO₂ .
2. El día de la inyección, recoja las células OVCAR3-Luc siguiendo los siguientes pasos.
   1. En primer lugar, aspire el medio del matraz de cultivo celular y lave las células una vez con 5-7 mL de PBS por matraz de 75^cm2 (PBS sin Ca²⁺/Mg²⁺). Aspirar el PBS y añadir la solución de tripsina/EDTA (2 mL por matraz^{de 75 cm2} ). Luego, regrese el matraz de cultivo celular a la incubadora durante 3-5 minutos o hasta que se desprendan las células.
   2. Usando microscopía, asegure la tripsinización completa de las células (asegúrese de que todas las células estén separadas del matraz de cultivo). Para detener la tripsinización, agregue DMEM fresco que contenga suero al matraz (2-3 mL por matraz de 75^cm2 ) y vuelva a suspender las células. Con una pipeta, transfiera las células a un tubo cónico de 15 mL.
   3. Centrifugar a 300 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células con medio de crecimiento. A continuación, cuente las células y vuelva a suspenderlas en el medio de crecimiento a una densidad de 1 x 10⁸ células/ml (0,5 x 10⁶ células OVCAR3-Luc por inyección). Coloque las celdas suspendidas sobre hielo.

3. Inoculación ortotópica

1. Preparación de la suspensión celular
   1. Mezcle las células CA-MSC y OVCAR-Luc en una proporción de 1:1.
   2. Descongele la matriz de la membrana basal congelada en un baño de hielo. A continuación, añadir la suspensión celular preparada en el paso 3.1.1 a la matriz de la membrana basal en una proporción de 1:1 (concentración celular final: 1 x 10⁶/ 20 μL de la matriz de la membrana basal media) y mezclar bien. Las suspensiones celulares preparadas deben mantenerse en un baño de hielo hasta su uso.
      NOTA: Aquí se describe una proporción de CA-MSC a OVCAR-Luc de 1:1 basada en la experiencia previa con el modelo mencionado. Trabajos anteriores demuestran que las CA-MSC generalmente se encuentran en una proporción de 1:10 con respecto a las células tumorales cuando se cuantifican directamente a partir del tejido del paciente. Como se explica a continuación, si se comienza con una proporción de CA-MSC a 1:1 a células tumorales, se obtiene una proporción aproximada de 1:10 de CA-MSC a células tumorales tanto en el sitio primario como en el metastásico en los puntos finales experimentales utilizando este modelo.
2. Cirugía
   NOTA: La cirugía debe realizarse en condiciones estériles y se deben utilizar instrumentos quirúrgicos estériles. Se recomienda utilizar ratones NSG hembra a las 8 semanas de edad para este modelo ortotópico.
   1. Anestesiar al ratón mediante inhalación con isoflurano (4% para inducción, 2% para mantenimiento) y oxígeno (100%, caudalímetro 0,5-1 L/min). Coloque el ratón en el sistema de conos nasales prequirúrgico. Para administrar la anestesia durante toda la cirugía (consulte las instrucciones detalladas a continuación), inserte la cabeza del ratón en el sistema de cono nasal vaporizador de isoflurano.
   2. Inyectar subcutáneamente al ratón 5 mg/kg de carprofeno, un analgésico prequirúrgico, con una jeringa de insulina.
   3. Con una maquinilla, afeita la porción caudal izquierda del ratón entre el margen costal y el fémur. Esterilice el área afeitada con una solución de povidona yodada e hisopos con alcohol. A continuación, transfiera el ratón al sistema de conos de la nariz quirúrgica y ajuste el isoflurano al 1,5% para la anestesia de mantenimiento.
   4. Haga una incisión horizontal en la piel de 1-2 cm aproximadamente 2-3 cm por debajo del margen costal. Agarre el peritoneo parietal con pinzas y elevélo (el peritoneo aparecerá brillante y se caracterizará por depósitos de tejido adiposo). Realizar una incisión de 1 cm en el peritoneo parietal para abrir la cavidad abdominal.
   5. Observe la acumulación de tejido adiposo que rodea el ovario del ratón (la bolsa ovárica) a la entrada peritoneal. Use pinzas curvas para agarrar y exponer la bolsa ovárica. Mientras agarra firmemente el ovario con las pinzas, inyecte 20 μL de la suspensión celular preparada en el paso 3.1.2 en la bursa.
   6. Regrese con cuidado el ovario a la cavidad abdominal. Utilizando una sutura absorbible de ácido poliglicólico 6-0 unida a una aguja, reaproxime los bordes de la incisión peritoneal parietal. Cierre la incisión cutánea con pinzas para heridas.
   7. Retire el ratón del cono de la nariz y colóquelo en una jaula limpia separada bajo una luz cálida hasta que recupere la conciencia y mantenga la decúbito esternal. Luego, regresa el ratón a su jaula.
   8. Monitoree a los ratones diariamente durante 3-7 días después de la cirugía. Coloque una taza de gel de carprofeno en las jaulas de los ratones para controlar el dolor. Retire las pinzas para heridas de 7 a 10 días después de la operación.

4. Monitoreo semanal del crecimiento tumoral y el peso corporal del ratón

1. Sistema de imágenes in vivo (IVIS): A partir de la primera semana después de la inoculación ortotópica, realice imágenes in vivo cada semana durante las próximas 3-4 semanas.
   1. Prepare la solución de D-luciferina (sustrato de la luciferasa de luciferasa de luciérnaga) disolviendo 15 mg en 1 mL de PBS y filtrando a través de una membrana de 0,22 μm para su esterilización.
   2. Opere el IVIS siguiendo las instrucciones del fabricante. Haga clic en el icono de escritorio de Living Image Software . A continuación, en el panel de control de adquisición de IVIS, seleccione Inicializar. Este paso puede tardar entre 10 y 15 minutos. Durante este tiempo, prepare a los ratones para la toma de imágenes.
   3. Anestesiar a cada ratón utilizando la cámara de isoflurano conectada a IVIS (2%-4% de isoflurano y caudalímetro de oxígeno a 0,5-1 L/min). Inyectar la D-luciferina (100 μL/10 g de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal con una jeringa de insulina.
   4. Vuelva a colocar el animal inyectado con luciferina en la cámara de isoflurano.
      NOTA: Es importante registrar el tiempo de inyección para mantener el tiempo constante entre la inyección de luciferina y el rendimiento de las imágenes durante todo el estudio.
   5. Transfiera el ratón anestesiado a la cámara de imágenes y ajuste el sistema de imágenes a la configuración adecuada. A continuación, adquiera la imagen en el momento adecuado.
   6. Después de guardar las imágenes, retire los ratones de la cámara de imágenes y vuelva a colocarlos en sus respectivas jaulas.
      NOTA: Las CA-MSC también se pueden marcar con una etiqueta fluorescente y la migración/cometástasis de las CA-MSC y las células OVCAR3-Luc se pueden controlar in vivo utilizando un canal fluorescente en el IVIS.

5. Evaluación de CA-MSC: depósitos metastásicos de células tumorales

1. Al alcanzar su criterio de valoración predefinido (aumento de peso >20% con presencia de ascitis, pérdida de peso <10%, ulceración tumoral, puntuación de acondicionamiento corporal de 2 o menos¹⁷), sacrificar a los ratones de acuerdo con los estándares institucionales de bienestar animal.
2. Realice la necropsia a cada ratón individualmente. Colocar una aguja estéril de 18 G por vía intraperitoneal para aspirar cualquier ascitis. A continuación, exponga la cavidad torácica y abdominal. Cuantificar la enfermedad metastásica macroscópica mediante la inspección visual de la afectación tumoral de órganos murinos¹⁸.
3. Extraer el tejido tumoral con un bisturí estéril y i) fijarlo en paraformaldehído para su eventual inclusión en parafina, ii) congelar rápidamente e incrustar en medios de inclusión de criostato de venta libre, iii) congelar rápidamente para análisis posteriores de ADN, ARN o proteínas, o iv) disociar en células individuales para citometría de flujo o aislamiento de FACS.
   NOTA: Las CA-MSC siguen siendo viables en este modelo y se pueden volver a aislar para aplicaciones posteriores. Dependiendo del objetivo del estudio, las interacciones entre CA-MSC y células tumorales se pueden investigar mediante enfoques inmunohistoquímicos, enfoques de citometría de flujo o manteniendo células reaisladas en cultivo.

El enfoque descrito imita de cerca el microambiente de apoyo del cáncer de ovario (en particular, el carcinoma seroso de alto grado) mediante la inyección conjunta de células madre mesenquimales derivadas del paciente (CA-MSC) y células de cáncer de ovario en la bolsa ovárica. En primer lugar, se aislaron las CA-MSC de un cáncer de ovario seroso de alto grado humano primario resecado quirúrgicamente que afectaba al epiplón (todas las CA-MSC utilizadas en este experimento se deri...

A pesar de los importantes esfuerzos clínicos y de investigación, se han logrado avances mínimos en el tratamiento y la prevención del cáncer de ovario¹. Si bien se han utilizado una variedad de modelos de ratón para estudiar la progresión y las metástasis del cáncer de ovario, estos modelos han enfrentado limitaciones significativas. En particular, los modelos de ratón anteriores no han podido recapitular completamente la historia natural de la progresi...

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nos gustaría agradecer al Programa de Biomuestras de Oncología Ginecológica-Promark por su ayuda con la recolección de tejidos. LGC cuenta con el apoyo de Tina's Wish, Rising Star Grant y The Mary Kay Foundation.