Децеллюляризация поджелудочной железы человека без использования детергентов для производства растворимого внеклеточного матрикса (ВКМ)

Протокол, описанный в данной рукописи, объясняет этапы изготовления растворимого внеклеточного матрикса (ВКМ) из поджелудочной железы человека. Растворенный порошок ВКМ, полученный по этому протоколу, может быть использован для рекапитуляции микроокружения островков поджелудочной железы in vitro и, потенциально, in vivo.

Трансплантация островковых клеток (ITx) имеет потенциал стать стандартом лечения в медицине заместительных бета-клеток, но ее результаты остаются хуже, чем при трансплантации всей поджелудочной железы. Протоколы, используемые в настоящее время для выделения островков человека, находятся под пристальным вниманием, поскольку они основаны на ферментативном переваривании органа, в результате которого поджелудочная железа разрушается, ее связи с организмом теряются, а островки необратимо повреждаются. Повреждение островков характеризуется такими критическими факторами, как разрушение внеклеточного матрикса (ВКМ), который представляет собой трехмерный каркас островковой ниши и потеря которого несовместима с эуфизиологией островков. Исследователи предлагают использовать каркасы на основе ECM, полученные из поджелудочной железы млекопитающих, для решения этой проблемы и, в конечном итоге, улучшения жизнеспособности, функции и продолжительности жизни островковых клеток. В настоящее время доступные методы получения таких скаффолдов являются жесткими, поскольку они в основном основаны на моющих средствах. Таким образом, мы предлагаем новый, не требующий моющих средств метод, который создает меньше повреждений ВКМ и может сохранить критически важные компоненты ВКМ поджелудочной железы. Результаты показывают, что недавно разработанный протокол децеллюляризации позволил достичь полного клиренса ДНК при сохранении компонентов ВКМ. Полученный ВКМ был протестирован на цитотоксичность и инкапсулирован с островками поджелудочной железы человека, которые показали положительное клеточное поведение с секрецией инсулина при стимуляции глюкозной провокацией. В совокупности мы предлагаем новый метод децеллюляризации поджелудочной железы человека без использования обычных ионных и неионогенных химических детергентов. Этот протокол и полученная с его помощью ЭКМ могут быть полезны как для in vitro, так и для in vivo.

Выделение островков поджелудочной железы представляет собой тщательный процесс, осуществляемый путем ферментативного расщепления связей между островками и их внеклеточной окружающей поддерживающей структурой. Это разрушение внеклеточного матрикса (ВКМ) является одним из критических факторов в характеристике повреждения островков, происходящего во время процессов изоляции 1,2,3,4. Периостровковая ВКМ является важным бесклеточным компонентом эндокринной поджелудочной железы. Он состоит из белков и полисахаридов, которые взаимодействуют и сшиваются, образуя трехмерную сеть, которая структурно и биохимически поддерживает физиологический гомеостаз и помогает в воссоздании этого микроокружения in vitro ^2,5,6. Потеря фундаментальных сигнальных процессов между островками и ВКМ признана одним из способствующих факторов, ограничивающих выживаемость островков in vitro и in vivo 2,7,8,9,10.

ВКМ животного и человеческого происхождения широко используется для рекапитуляции микроокружения островков поджелудочной железы 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Поскольку способность ВКМ усиливать прикрепление островковых клеток крыс, пролиферацию и долгосрочное поддержание культуры была впервые описана в ссылке ²⁰, многие другие исследования предоставили убедительные доказательства того, что восстановление нативного взаимодействия ВКМ с островками человека улучшает функцию островков^21,22. Например, последние данные показали, что островки, инкапсулированные с помощью ВКМ, значительно улучшили гликемический контроль у мышей с диабетом, усиливая и облегчая доставку инсулина в^{новой клеточной} платформе доставки инсулина. Кроме того, исследования показали, что включение критических компонентов ЭКМ поджелудочной железы может значительно улучшить эндокринную функцию β-клеток 24,25,26,27.

Представленные в литературе протоколы производства ЭХМ основаны на применении химических моющих средств, например, Triton X-100 или додецилсульфата натрия (SDS). Несмотря на обеспечение превосходного клиренса ДНК, химические вещества, используемые в процессах децеллюляризации, являются цитотоксичными, дорогими, а остатки на децеллюляризованной ткани вызывают опасения с точки зрения потенциального клинического применения.

Основываясь на этих наблюдениях, цели данного исследования были тройственными: во-первых, разработать метод децеллюляризации поджелудочной железы человека с минимальным использованием ионных или неионогенных химических детергентов; Во-вторых, получить растворимый каркас ВКМ для культивирования тканей; В-третьих, охарактеризовать ВКМ поджелудочной железы с целью оценки ее цитотоксичности и влияния на функцию островковых клеток. Такая характеристика необходима для всех применений, основанных на клеточных культурах, поскольку она демонстрирует, что солюбилизированная ВКМ поджелудочной железы может быть полезна для повторения микроокружения поджелудочной железы для изолированных островков. В данной работе описан эффективный метод децеллюляризации поджелудочной железы человека без использования детергентов, определение характеристик ВКМ и влияние ВКМ на жизнеспособность и функцию инкапсулированных изолированных островков поджелудочной железы человека.

Это исследование было одобрено комитетом по исследованиям человека Баптистского медицинского центра Уэйк Форест. Поджелудочная железа человека была этически получена от доноров органов через Carolina Donor Services. Доноры органов были проверены на инфекционные заболевания, актуальные для человека, в соответствии с правилами UNOS. Органы получали в стерильном консервирующем растворе, где они хранились до использования. По доставке в лабораторию были осмотрены все органы, а также собраны образцы родной поджелудочной железы для гистологических целей. Затем органы замораживали и хранили в стерильных условиях при температуре -20 °C до дальнейшего использования.

1. Хирургическая подготовка поджелудочной железы человека

ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженные поджелудочные железы размораживали в течение ночи при температуре 4 °C.

1. Перед началом хирургического рассечения поджелудочной железы человека приготовьте 1 л моющего раствора, состоящего из 950 мл деионизированной воды (dH₂O), 50 мл реагента на основе йода и 1% раствора Pen/Strep.
2. Во время хирургического вскрытия надевайте стерильные перчатки и лабораторный халат. Выполняйте все операции под колпаком для клеточных культур, чтобы избежать возможного заражения.
3. Переложите поджелудочную железу из стерильного пакета для транспортировки в стерильный таз для плаценты. Убедитесь, что поджелудочная железа ориентирована так, чтобы головка органа была направлена влево, а хвост – вправо.
4. Аккуратно рассеките двенадцатиперстную кишку от головки поджелудочной железы с помощью стерильных ножниц и щипцов без зубцов. Будьте осторожны, чтобы не сделать отверстие в двенадцатиперстной кишке, так как это увеличивает шансы на заражение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если в желудочно-кишечном тракте проделана дыра, быстро зажмите отверстие и приступайте к вскрытию.
5. После того, как вскрытие головки поджелудочной железы будет завершено, утилизируйте двенадцатиперстную кишку в соответствующий пакет для биологической опасности и следуйте рекомендациям учреждения по ее утилизации.
6. Рассеките и отбросьте всю внепанкреатическую ткань, оставшуюся вокруг головки поджелудочной железы, включая крупные кровеносные сосуды и общий желчный проток, которые обычно помечены во время забора органа нерассасывающимися швами. Утилизируйте ткань в соответствии с рекомендациями учреждения.
7. Рассеките и отбросьте всю внепанкреатическую ткань и перипанкреатическую жировую ткань, окружающую хвост поджелудочной железы, обнажая кровеносные сосуды селезенки.
8. После того, как сосудистая ножка селезенки обнажена, удалите селезенку и рассеките кровеносные сосуды селезенки полностью, включая те, которые прикреплены к задней поверхности поджелудочной железы (селезеночная артерия и вена). Утилизируйте селезенку и удалите ткань в соответствии с рекомендациями учреждения.
9. Надлежащим образом препарируйте и утилизируйте любой хорошо видимый внепанкреатический жир, особенно перипанкреатический жир.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На уровне хвоста поджелудочной железы может быть виден забрюшинный район. Его следует приподнять с помощью щипцов без зубьев, удалить хирургическими щипцами и правильно утилизировать. Теперь поджелудочная железа должна быть свободна от какой-либо внеподжелудочной ткани.
10. Рассеките поджелудочную железу до получения 1 см³ куба ткани поджелудочной железы с помощью хирургических ножниц, стерилизованных гистологических лезвий или хирургических скальпелей. Кубики ткани поджелудочной железы, полученные после этого вскрытия, подвергнутся процессу децеллюляризации. Среднее количество кубиков поджелудочной железы, которые подвергаются децеллюляризации, зависит от внутренних характеристик органа. В среднем от 40 до 60 кубиков поджелудочной железы подверглись децеллюляризации в представленном исследовании.
11. Перейдите к шагу 2.1

2. Децеллюляризация ткани поджелудочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использовался для поджелудочной железы со средним весом 100 г; Поэтому не рекомендуется превышать этот вес при использовании данной методики децеллюляризации.

1. Поместите всю ткань поджелудочной железы, предварительно рассеченную на шаге 1.10, в стерильный пластиковый контейнер (см. Таблицу материалов) с раствором для промывки и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре (RT).
2. Удалите ткань поджелудочной железы с помощью стерильных щипцов и поместите ее в новый стерильный контейнер, содержащий стерильную, не содержащую эндотоксинов деионизированную воду. Плотно закройте крышку контейнера и поместите его на охлаждаемый орбитальный шейкер с заданной температурой 4 °C и скоростью встряхивания 180–200 об/мин в течение 24 часов.
3. Извлеките контейнер с тканью поджелудочной железы и очистите его снаружи, прежде чем поместить его в колпак для продолжения процесса.
4. Удалите ткань поджелудочной железы с помощью хирургических щипцов и поместите ее в новый стерильный контейнер вместе с 1 л деионизированной воды, 50 мг ДНКазы I и 0,0025% хлорида магния. Плотно закройте крышку контейнера и поместите его в орбитальный шейкер с заданной температурой 37 °C и скоростью встряхивания 100 об/мин в течение 6 часов.
5. Приготовьте раствор ЭДТА-Тризма
   1. Соберите новый стерильный контейнер объемом 1 л и тщательно очистите его, прежде чем положить в вытяжку. Для приготовления 1 л раствора ЭДТА-Тризма добавьте следующее: 985 мл стерильной деионизированной воды, 7,5 мл буфера Tris-HCl и 7,5 мл раствора ЭДТА. Храните его при температуре 4 °C до использования.
6. Снимите контейнер, в который заключена ткань поджелудочной железы, и очистите его снаружи, прежде чем вводить его в капюшон для продолжения процесса.
7. Удалите ткань поджелудочной железы с помощью хирургических щипцов и поместите ее в новый стерильный контейнер с 1 л раствора на основе ЭДТА-Тризма. Плотно закройте крышку контейнера и поместите его в орбитальный шейкер с заданной температурой 4 °C и скоростью встряхивания 180–200 об/мин в течение 18 часов.
8. Извлеките контейнер с тканью поджелудочной железы и очистите его снаружи соответствующим образом, прежде чем вводить его в капюшон для процесса.
9. Удалите ткань поджелудочной железы с помощью стерильных щипцов и поместите ее в новый стерильный контейнер со стерильной деионизированной водой, не содержащей эндотоксинов. Плотно закройте крышку контейнера и поместите его на охлаждаемый орбитальный шейкер с заданной температурой 4 °C и скоростью встряхивания от 180 до 200 об/мин в течение 24 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этот период обработки произойдет заметное изменение цвета, при котором ткань будет казаться ярче.
10. Соберите ткань поджелудочной железы и храните ее в стерильных центрифугирующих пробирках объемом 50 мл, достигая максимум 25 мл на пробирку для последующего замораживания и лиофилизации. Количество центрифугирующих пробирок варьируется в зависимости от размера поджелудочной железы. Хранить образцы при температуре -80 °C.

3. Производство порошка ВКМ поджелудочной железы – лиофилизация и криоизмельчение

1. После хранения децеллюляризованного материала при температуре -80 °C в течение как минимум 24–40 часов перенесите ВКМ поджелудочной железы в сублимационную сушилку.
2. Перенесите замороженный материал в сублимационную сушилку, предотвращая его оттаивание.
   Этап лиофилизации занимает примерно 3–5 дней в зависимости от нескольких факторов, таких как количество материала в каждой пробирке, проходящей процесс, и поверхность, подвергшаяся лиофилизации. Рекомендуется, чтобы уровень децеллюляризованной ткани не превышал 25 мл в каждой пробирке, а пробирки были заморожены под углом 45°, что позволяет легко обнажить большую поверхность после начала лиофилизации. Снимите крышки с трубок.
3. После лиофилизации переложите материалы в колпак для клеточной культуры.
4. Разрежьте каждый кусочек высушенного ЭШМ на половину его размера с помощью стерильных ножниц. Эти высушенные детали ECM будут подвергнуты автоматизированному процессу фрезерования для производства порошка ECM. Используйте криофрезерованный автоматический процессор, чтобы избежать повышения температуры и последующей денатурации биологических свойств ЭХМ. Обязательно отрегулируйте настройку криофрезерного станка, чтобы получить мелкий порошок после процесса измельчения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовалась поджелудочная железа доноров с ИМТ < 30. Панкреата от доноров с ИМТ > 30 показала тенденцию к содержанию большего количества внутрипаренхиматозного жира. Процесс лиофилизации не считается оптимальным и может тормозиться из-за содержания жира. Если после лиофилизации ткань заметно маслянистая, ее необходимо выбросить, так как она не будет оптимальной для производства порошка ECM.

4. Солюбилизация ВКМ поджелудочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе из поджелудочной железы среднего размера (100 г) выход децеллюляризованного порошка поджелудочной железы составляет 1–2 г.

1. Взвесьте 1 г порошка ECM с помощью стерильного пластикового шпателя.
2. Солюбилизацию добивают по ранее описанным протоколам: Солюбилизовать 1 г ЭКМ в 100 мл 0,01 М HCl и 100 мг пепсина в течение 48 ч при ОТ при постоянном перемешивании²⁸.
3. Через 48 ч используйте NaOH для нейтрализации pH (pH = 7) кислого ECM, держа стакан с кислым ECM на льду, чтобы избежать гелеобразования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кинетика гелеобразования варьируется в зависимости от температуры, содержания коллагена, pH и нейтрализующего раствора. В данном исследовании использовалось 0,01 М NaOH. Объем NaOH, добавляемого для нейтрализации pH, составлял примерно 100 мл. Рассмотрите возможность многократного измерения pH во время нейтрализации кислого раствора ECM.
4. Перелейте нейтральный раствор ЭКМ в стерильные центрифужные пробирки объемом 50 мл. Закройте пробирки и поместите их в центрифугу. Центрифугируйте пробирки, содержащие растворенный ЭХМ, с максимальной скоростью (12 000 x g) в течение 15 мин при 4 °C. После центрифугирования перенесите пробирки в колпак для клеточных культур.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования образца нерастворимый компонент ЭХМ осаждается на дне пробирки, в то время как раствор ЭХМ находится в верхней части надосадочной жидкости.
5. Используя стерильные методы, соберите надосадочную жидкость пробирки, содержащей раствор солюбилизированной ВКМ, и перенесите ее в свежие пробирки объемом 50 мл, достигнув максимума 25 мл на пробирку.
6. Храните пробирки с раствором ECM при температуре -80 °C.

5. Производство порошка ВКМ поджелудочной железы – лиофилизация и хранение

1. После хранения растворимого ECM-раствора при температуре -80 °C в течение не менее 24–40 часов перенесите пробирки в сублимационную сушилку.
2. Поместите замороженный материал в сублимационную сушилку, следя за тем, чтобы материал не оттаял.
   Этап лиофилизации занимает примерно 3–5 дней в зависимости от нескольких факторов, таких как количество материала в каждой пробирке, проходящей процесс, и поверхность, подвергшаяся лиофилизации. Рекомендуется, чтобы уровень раствора солюбилизированного ЭКМ не превышал 25 мл в каждой пробирке, а пробирки замораживались под углом 45°, чтобы после начала лиофилизации можно было легко обнажить большую поверхность. Снимите крышки с соколиной пробирки перед лиофилизацией.
3. После лиофилизации солюбилизированного ECM-раствора перенести материал в колпак для клеточных культур. После полной лиофилизации будет виден мелкодисперсный порошок ECM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный выход составляет 700 мг из 1 г децеллюляризированной ткани.
4. Храните растворимый порошок ECM или используйте в целях культивирования клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется хранить ЭБУ при температуре 4 °C для немедленного использования, при -20 °C для последующего использования и при -80 °C при длительном хранении.

6. Характеристика ВКМ поджелудочной железы с гистологическим окрашиванием

1. Соберите кусочек нативной поджелудочной железы вскоре после доставки органа и до проведения децеллюляризации. Зафиксируйте это на 24 часа в 10% формалине. Промойте образцы в деионизированной воде. Обезвоживайте его в сортированном спирте перед тем, как погрузить в парафин, и нарежьте на секции по 5 мм.
2. В конце процесса децеллюляризации соберите образец децеллюляризованного материала и зафиксируйте его на 24 ч в 10% формалине. Промойте образец в деионизированной воде. Обезвоживайте его в сортированном спирте перед тем, как погрузить в парафин, и нарежьте на секции по 5 мм.
3. Чтобы убедиться в успешной децеллюляризации, выполните окрашивание H&E и DAPI как на нативной поджелудочной железе, так и на децеллюляризованном аналоге.
4. Для гистологической характеристики выполните окрашивание по методу Массона Trichrome (MT) и Alcian Blue (AB), которое выделит коллагенозную структуру и структуру GAGs соответственно.

7. Определение характеристик растворимого порошка ECM

1. Проводят анализ содержания ДНК и общего коллагена в нативной ткани поджелудочной железы и растворимом порошке ECM, как описано ранее²⁹.
2. Количественное определение сульфатированных гликозаминогликанов (sGAG) на основе протокола, предоставленного коммерчески доступным набором (см. Таблицу материалов). С помощью микропланшетного спектрофотометра измерьте содержание сульфатированного sGAG в ВКМ поджелудочной железы на длине волны 595 нм³⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сообщайте о содержании ДНК в нг/мг сухой ткани, а о содержании коллагена и ГАГ в г/мг сухой ткани.

8. Инкапсуляция островков человека с помощью ЭВМ и культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: Островки поджелудочной железы человека были получены коммерчески (см. Таблицу материалов).

1. По прибытии культивировали островки поджелудочной железы человека в обработанных планшетах без культуры тканей в течение 24 ч в стандартных условиях с приблизительной плотностью 2000 ИЭК в каждой 10-сантиметровой пластине.
2. Манипулируйте островками человека, чтобы проверить влияние ВКМ на функциональность и жизнеспособность островков с помощью следующих экспериментальных групп: свободные островки, островки, инкапсулированные в альгинат, и островки, инкапсулированные в альгинат-ВКМ.
   Примечание: Вышеупомянутые группы островков культивировали in vitro в стандартных условиях в течение 8 дней для оценки влияния ВКМ на функциональность и жизнеспособность островков.
3. Взвесьте альгинат на весах и суспензируйте его вместе с HBSS в центрифужную пробирку с целью получения соотношения 1,5% (w/v). Поместите пробирку центрифуги на вращатель на ночь при температуре 4 °C.
   Примечание: Молекулярная масса альгината в диапазоне от 75 до 200 кДа и соотношение G/M ≤ 1 были зарегистрированы производителем.
4. Взвесьте 0,1 мг ЭКМ и суспендируйте его в 1 мл ранее приготовленного альгината до концентрации ЭКМ 0,1 мг/мл.
5. Инкапсулировать островки поджелудочной железы человека в альгинат и альгинат-ЭКМ в соответствии с ранее описанным протоколом³¹. Процедура кратко описана ниже.
   1. Аккуратно соберите и смешайте 3000 ИЭК в 1 мл альгината и 3000 МЕЭК в 1 мл альгината-ЭКМ в концентрации ЭКМ 0,1 мг/мл, предварительно приготовленной на этапе 8.4.
   2. Полученные суспензии прокачать через микрофлюидное инкапсулирующее устройство, установленное на 0,2 мл/мин и скорость потока и давление воздуха 2,0 Па соответственно.
   3. После производства соберите микрокапсулы в 100 мМ ванны CaCl₂ с 10 мМ HEPES. Дайте альгинату сшить в течение 10 минут.
   4. Перед культивированием инкапсулированные островки промыть HBSS в стандартных условиях, в течение 2–3 мин при 37 °C, с 5%_CO2.
   5. Добавьте питательные среды (см. Таблицу материалов) и меняйте две трети питательных сред через день до конца эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные шаги должны быть выполнены как для островков в альгинате, так и для островков в альгинатной ВКМ.
6. На 8-й день, после инкапсуляции, проведите глюкозостимулированную секрецию инсулина (GSIS) и анализ ДНК для оценки выработки инсулина и жизнеспособности островков соответственно.
7. Получение изображений в светлом поле и окрашивание свободных/мертвых островков для оценки морфологии и жизнеспособности клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки состояния островков была проведена качественная оценка изображений. Принимаемые во внимание параметры включают форму, границу, целостность и диаметр островков, а также наличие отдельных клеток в культуре.

9. Глюкозостимулированное высвобождение инсулина (GSIS) и измерение ДНК

Примечание: На 8-й день, после инкапсуляции, островки поджелудочной железы человека собирали и инкубировали с буфером Креба, содержащим низкие (2,8 мМ) и высокие (16,8 мМ) концентрации глюкозы, с последующим вводом раствора деполяризации KCl (25 мМ). Глюкозо-провокационную провокацию проводили с модификацией ранее описанного протокола³².

1. Вставьте гелевую фильтрующую смолу в полипропиленовые колонки.
2. Вставьте группы обработки (свободные островки или инкапсулированные островки) в среднюю часть гелевой фильтрующей смолы в полипропиленовых колоннах.
3. Пипеткой вводите глюкозу и деполяризующие растворы в полипропиленовые колонки, описанные выше, и инкубируйте в течение 1 ч в следующем порядке: проведите период предварительной инкубации с раствором глюкозы с низкой молярностью, затем проведите серию инкубаций с раствором глюкозы с низкой, высокой, низкой и деполяризующей концентрацией, как указано в примечании в начале раздела 9.
4. Собирайте среду с каждой фазы инкубации и храните ее при температуре -80 °C для последующего анализа.
5. После инкубации и сбора деполяризующего раствора инкубируйте островки поджелудочной железы человека с 1 мл буфера для экстракции ДНК и храните его до дальнейшего анализа.
6. Измерьте содержание инсулина в глюкозе и инкубации деполяризующего раствора с помощью иммуноферментного анализа инсулина, следуя протоколу производителя.
7. Измерьте содержание ДНК в экстракционном буфере, собранном на шаге 9.5, с помощью набора для анализа ДНК в соответствии с протоколом производителя.
8. Нормализовать измерения инсулина в соответствии с содержанием ДНК.

10. Статистический анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Групповые сравнения относятся к одной и той же партии островков человека с n = 3 независимой оценкой, проведенной для каждого анализа, описанного в этой рукописи. Значения выражаются как среднее ± SD.

1. Используйте статистическое программное обеспечение для выполнения теста Манна-Уитни для оценки децеллюляризации и анализа остатков ДНК, сравнения нативной, децеллюляризированной поджелудочной железы и солюбилизированной ВКМ.
2. Проведите непарный t-критерий для оценки гликозаминогликанов и коллагена между нативной, децеллюляризованной поджелудочной железой и солюбилизированной ВКМ.
3. Проведите двухфакторный ANOVA с задним числом множественных сравнений по Турции для теста на стимуляцию глюкозы при оценке стимуляции островков на 8-й день.
4. Рассмотрим статистическую значимость при p < 0,05 с обозначением *p < 0,05, **p<0,01, ***p < 0,001 и ****p < 0,0001.

Нативные и бесклеточные образцы поджелудочной железы обрабатывали для гистологического окрашивания с помощью H&E, MT и AB. Окрашивание H&E показало полное отсутствие ядерного материала и клеток, что подтверждает успешную децеллюляризацию. Окрашивание МТ и АВ показало каркас ВКМ, выделив качественно коллагеновый и стромальный компоненты соответственно (рис. 1).

Этот метод позволил последовательно получать порошок ECM из поджелудочной железы человека. Количественные тесты ДНК подтвердили удовлетворительный клиренс клеток³³. Нативная, аклеточная и солюбилизированная ВКМ поджелудочной железы были биохимически охарактеризованы с целью оценки основного биологического состава. ВКМ поджелудочной железы была определена как бесклеточная и свободная от ДНК (ДНК < 50 ^ng.mg-1 сухой ткани), с последовательным сохранением коллагена и гликозаминогликанов, о чем сообщали другие^11,15. Анализ ДНК показал клиренс дезоксирибонуклеиновой кислоты как в бесклеточной, так и в солюбилизированной ВКМ поджелудочной железы (от 4,56 мкг/мг ± 3,42 мкг/мг до 30,05 нг/мг ± 22,89 нг/мг для бесклеточной поджелудочной железы p = 0,0001; от 4,56 мкг/мг ± 3,42 мкг/мг до 22,81 нг/мг ± 11,31 нг/мг для солюбилизированной ВКМ поджелудочной железы). (Рисунок 2).

Общий коллаген был количественно определен в нативной поджелудочной железе, в бесклеточной и в солюбилизированной ВКМ поджелудочной железы. Результаты показали статистически значимое увеличение коллагена в бесклеточной поджелудочной железе и в растворимой ВКМ поджелудочной железы по сравнению с нативной тканью (с 7,35 мкг/мг ± 1,68 мкг/мг до 27,74 мкг/мг ± 2,35 мкг/мг для бесклеточной поджелудочной железы p < 0,0001; с 7,35 мкг/мг ± 1,68 мкг/мг до 26,08 мкг/мг ± 3,63 мкг/мг для солюбилизированной ВКМ поджелудочной железы p < 0,001). Это увеличение содержания коллагена связано с выделением и очисткой ВКМ от клеточных компонентов, которые демонстрируют общее обогащение коллагеном и sGAG в ВКМ по сравнению с нативным органом (Рисунок 2).

Количественное определение гликозаминогликанов показало статистически значимое снижение содержания ГАГ в бесклеточной ткани и солюбилизированной ВКМ поджелудочной железы, сопоставимое с нашим предыдущим исследованием^11,15, со снижением с 15,08 мкг/мг ± 3,03 мкг/мг до 4,87 мкг/мг ± 1,20 мкг/мг для бесклеточной поджелудочной железы p < 0,001 и с 15,08 мкг/мг ± 3,03 мкг/мг до 3,45 мкг/мг ± 0,20 мкг/мг для солюбилизированной ВКМ поджелудочной железы (p < 0,01) (рис. 2).

Инкапсулированные островки, культивируемые в планшетах, не обработанных тканевой культурой, были жизнеспособны через 8 дней после инкапсуляции. Окрашивание как живых, так и мертвых показало, что островки, культивируемые в трех различных условиях, являются жизнеспособными; тем не менее, наблюдалось повышенное присутствие мертвых клеток в неинкапсулированном виде (Рисунок 3). Инкапсулированные островки сохранили свою сферическую форму с хорошо закругленной каймой, стабильным диаметром и почти полным отсутствием отдельных клеток в культуре. В анализируемый момент времени свободные островки демонстрировали тенденцию к агрегации, образованию неровностей на границах и формах, а также к демонстрации более темного ядра, что наводит на мысль о некротическом событии.

Было обнаружено, что как свободные, так и инкапсулированные островки были чувствительны к глюкозе в анализируемый момент времени (рис. 3). Островки, инкапсулированные в ЭКМ-альгинат, показали значительное увеличение секреции инсулина после стимуляции высоким уровнем глюкозы и деполяризации KCl по сравнению со свободными и инкапсулированными островками, содержащими только альгинат.

Рисунок 1: Гистологические изображения Репрезентативной H&E, Masson's Trichrome и Alcian Blue. Нативная поджелудочная железа человека (A,C,E) и ВКМ поджелудочной железы человека (B,D,F) децеллюляризированы с помощью недавно разработанного экспериментального протокола. Панель H&E продемонстрировала полную потерю ядерных структур по сравнению с нативной тканью поджелудочной железы. Трихромное окрашивание Массона подчеркивает каркас внеклеточного матрикса, а окрашивание Alcian Blue подчеркивает соединительнотканный каркас внеклеточного матрикса. Масштабная линейка = 100 μм для панелей A,C,D,E,F; Масштабная линейка = 25 μм для панели B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Биохимическая характеристика нативной поджелудочной железы, ацеллюлярной и солюбилизированной ВКМ поджелудочной железы. (А) Подтверждено удовлетворительное удаление ДНК в бесклеточной поджелудочной железе и в солюбилизированной ВКМ поджелудочной железы. (В,В) Количественное определение гликозаминогликанов и коллагена проводилось в нативной поджелудочной железе по сравнению с бесклеточной и солюбилизированной ВКМ. Статистический анализ проводили с помощью t-критерия нативной и децеллюляризованной поджелудочной железы и нативной и солюбилизированной ВКМ; = p < 0,0001; р < 0,001; **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Качественная оценка жизнеспособности островков человека и количественная оценка секреции инсулина. (A) Светлые и живые/мертвые изображения изолированных островков человека, культивируемых как свободные, в альгинатных капсулах и в альгинатных капсулах ЭКМ на 6-й день после инкапсуляции. (B) Оценка стимуляции глюкозой изолированных островков человека, культивируемых на планшете, не обработанном тканевой культурой, в трех различных условиях: свободных, в альгинатных капсулах и в альгинатных капсулах ЭКМ на 8-й день после инкапсуляции. Сообщалось о значениях секреции инсулина после нормализации ДНК. Проведено статистическое сравнение секреции инсулина между тремя культуральными условиями в условиях высокого уровня глюкозы и после деполяризующего раствора KCl, соответственно; *p < 0,0 и ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Целью данной работы была разработка более щадящего, не требующего детергентов протокола децеллюляризации для производства ВКМ поджелудочной железы. Было уделено внимание сохранению компонентов ВКМ паренхимы поджелудочной железы и недопущению длительного воздействия на ткани обычных ионных или неионогенных химических детергентов в процессе децеллюляризации.

Наиболее инновационным аспектом разработанного метода децеллюляризации является отказ от использования классических ионных и неионогенных химических детергентов. Наш предыдущий опыт производства ВКМ поджелудочной железы человека 11,12,13,22,34,35 установил базовый уровень для производства бесклеточной поддерживающей среды поджелудочной железы. Тем не менее, инфузия с сотнями литров химических детергентов через проток поджелудочной железы, верхнюю брыжеечную артерию и селезеночную артерию^11,13 требует специфических хирургических техник и не всегда осуществима в крупномасштабном производстве. Самое главное, что децеллюляризация ткани в орбитальном шейкере, а не вливание детергентов через сосудистую сеть, представляет собой смену парадигмы в методологии, внося огромный вклад в техническую простоту, согласованность и осуществимость децеллюляризации, что улучшает производство ВКМ для трансляции. Кроме того, органы, закупаемые в исследовательских целях, часто повреждаются из-за несоответствий в процессе закупки, иногда из-за аномальной анатомии, которая препятствует канюляции. Таким образом, наш метод позволит обработать все органы для децеллюляризации. Мы предполагаем, что этот метод может представлять интерес для децеллюляризации и производства ВКМ из различных органов и, возможно, для применения как in vitro, так и in vivo.

На разработку данного метода децеллюляризации повлиял наш предыдущий опыт использования Triton X-100 в качестве основного химического моющего средства 11,13,36. Невозможность количественного определения остатка Triton X-100 на ЭХМ после децеллюляризации и отсутствие возможности масштабирования производственного процесса в условиях cGMP привели нашу группу к исследованию возможности получения децеллюляризации путем механического встряхивания, а не перфузии всей поджелудочной железы. Мы предположили, что использование гипотонического раствора будет эффективным для ускорения осмотического повреждения в живых клетках и подставления клеточного ядерного материала для последующей ферментативной обработки, направленной на очистку остатков дезоксирибонуклеиновой кислоты. Следуя первоначальным подходам к децеллюляризации поджелудочной железы человека путем встряхивания нарезанной кубиками ткани в химических моющих средствах в течение 48 часов, мы заметили, что деионизированная вода была эффективна в обеспечении клеточного повреждения, необходимого для последующего ферментативного этапа и удаления клеток. Затем мы изучили вариант снижения фазы без детергента через 24 ч и подтвердили, что клеточные механические повреждения из-за гипотонического раствора, деионизированной воды, были стабильно способны обеспечить успешную децеллюляризацию, избегая при этом использования потенциальных цитотоксических агентов. Наши данные по количественному определению коллагена и гликозаминогликанов показали тенденцию, согласующуюся с нашим предыдущим опытом и недавними наблюдениями других исследовательских групп за поджелудочной железой человека^11,15. Более того, мы обнаружили, что этап солюбилизации не уменьшает количество критических компонентов ВКМ, так как их сохранение имеет решающее значение для того, чтобы каркасы ЭКМ выполняли функцию 15,21,24,36. Методы децеллюляризации поджелудочной железы, обсуждаемые в настоящее время в литературе³⁷, характеризуются использованием ионных или неионогенных детергентов и, как следствие, потерей врожденного состава ВКМ, что позволяет нам сделать вывод о том, что более щадящий метод, возможно, без детергентов, лучше сохранит основные компоненты ВКМ поджелудочной железы.

ECM — это 3D-структура, которая обеспечивает структурную и биохимическую поддержку клеток многоклеточных организмов. Белки и структуры ECM играют жизненно важную роль в определении, дифференцировке, пролиферации, выживании, полярности и миграции клеток⁶. Обоснование включения ВКМ поджелудочной железы как в in vitro, так и в in vivo основано на следующих данных: в зрелых островках взаимодействие с ВКМ или другими материалами матрицы регулирует выживание клеток, пролиферацию и секрецию инсулина, а также способствует сохранению и восстановлению морфологии сферических островков 3,21,22,38 ; частично переваренные островки, которые сохраняют некоторые из своих нативных соединений ECM, демонстрируют заметно сниженную скорость апоптоза и значительно более высокую функциональность GSIS по сравнению с высокоочищенными и свободными от ECM островками 38,39,40; и ЭКМ усиливает функцию островков, предотвращая инфильтрацию лейкоцитов и повышая экспрессию α3-интегрина и киназы фокальной адгезии, что является важнейшей характеристикой для прикрепления бета-клеток к ЭКМ и их взаимодействия 41,42,43.

Глюкозо-стимулированная секреция инсулина после инкапсуляции островков человека в альгинатные микрокапсулы показывает, как восстановление трехмерной обстановки обеспечивает более здоровую среду для островков по сравнению с культурой in vitro на планшетах, не обработанных тканевой культурой. Инкапсуляция альгинатом обеспечивает поддержание исходной структуры островков, предотвращая слипание клеток и диспергирование отдельных клеток, составляющих тем самым физиологическую структуру островков человека. Хорошо известно, что функция островков постепенно снижается с течением времени при культивировании in vitro в нормальных условиях, а альгинат, инертный биоматериал, не обеспечивает достаточной биохимической сигнализации для поддержания оптимальной функции островков. Доказано, что наш биоматериал ЭХМ оказывает положительное влияние in vitro на жизнеспособность и функциональность островков при инкапсуляции альгинатом по сравнению с только альгинатом. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы доказать, может ли добавление этого биоматериала при солюбилизации послужить шагом к совершенствованию островковых технологий для систем культивирования in vitro и для потенциальных применений in vivo^44,45.

В представленном протоколе децеллюляризации можно выделить некоторые важные этапы: (1) неоптимальное хирургическое рассечение поджелудочной железы человека может привести к избыточному присутствию жировой ткани, что резко нарушит процесс децеллюляризации; (2) эффективная лиофилизация не может быть достигнута при наличии избыточного количества жировой ткани; (3) Это неизбежно повлияет на стадию криофрезерования, которая будет неэффективной.

С использованием представленного протокола был обнаружен ряд ограничений: (1) вариабельность органов от человека к человеку до и после наблюдения децеллюляризации; (2) также наблюдались некоторые неоптимальные исходы децеллюляризации в органах, полученных от доноров со злоупотреблением алкоголем в анамнезе, у пациентов с ИМТ > 30 и избыточным накоплением пери- и внутрипанкреатической жировой ткани. Мы пришли к выводу, что поджелудочная железа человека от доноров с ИМТ < 30 в целом считается пригодной для децеллюляризации.

Результаты этого исследования показывают, что поджелудочная железа человека может быть децеллюляризирована с помощью осмотического процесса, не требующего использования моющих средств, для получения каркасов ВКМ для применения в медицине замещения бета-клеток, а также манипуляций с островками in vitro. Производственный процесс представляет собой осуществимый и воспроизводимый подход для трансляционных целей, а отказ от использования химических детергентов и использование системы на основе перфузии представляют собой эффективные и экономичные решения для производства биоматериала на основе ECM, который после солюбилизации может быть использован в исследованиях и, возможно, в клинических условиях. Существует потенциал для оценки эффективности этого биоматериала путем повторения оптимальной ниши для островков поджелудочной железы и инсулин-продуцирующих клеток для улучшения долгосрочного поддержания клеток, жизнеспособности и клеточной дифференцировки.

Ни один из соавторов не может декларировать конкурирующие финансовые интересы.

Этот проект получил финансирование от Программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 646272. Островки поджелудочной железы человека были получены в Prodo Laboratories, Aliso Viejo, CA 92656.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University