Descelularización sin detergente del páncreas humano para la producción de matriz extracelular soluble (MEC)

El protocolo descrito en este manuscrito explica los pasos para la fabricación de una matriz extracelular soluble (MEC) a partir del páncreas humano. El polvo solubilizado de ECM obtenido a través de este protocolo puede utilizarse para la recapitulación del microambiente de los islotes pancreáticos in vitro y, potencialmente, in vivo.

El trasplante de islotes (ITx) tiene el potencial de convertirse en el estándar de atención en la medicina de reemplazo de células beta, pero sus resultados siguen siendo inferiores a los obtenidos con el trasplante de páncreas completo. Los protocolos que se utilizan actualmente para el aislamiento de islotes humanos están bajo escrutinio porque se basan en la digestión enzimática del órgano, mediante la cual se destruye el páncreas, se pierden sus conexiones con el cuerpo y los islotes se dañan irreversiblemente. El daño de los islotes se caracteriza por factores críticos como la destrucción de la matriz extracelular (MEC), que representa el marco 3D del nicho de los islotes y cuya pérdida es incompatible con la eufisiología de los islotes. Los investigadores proponen el uso de andamios basados en ECM derivados del páncreas de los mamíferos para abordar este problema y, en última instancia, mejorar la viabilidad, la función y la vida útil de los islotes. Los métodos disponibles actualmente para obtener tales andamios son duros porque se basan en gran medida en detergentes. Por lo tanto, proponemos un nuevo método sin detergente que crea menos daño a la MEC y puede preservar los componentes críticos de la MEC pancreática. Los resultados muestran que el protocolo de descelularización recientemente desarrollado permitió lograr la eliminación completa del ADN mientras se conservaban los componentes de la MEC. La MEC obtenida se sometió a pruebas de citotoxicidad y se encapsuló con islotes pancreáticos humanos, que mostraron un comportamiento celular positivo con la secreción de insulina cuando se estimularon con provocación con glucosa. Colectivamente, proponemos un nuevo método para la descelularización del páncreas humano sin el uso de detergentes químicos iónicos y no iónicos convencionales. Este protocolo y el ECM obtenido con él podrían ser de utilidad tanto para aplicaciones in vitro como in vivo.

El aislamiento de los islotes pancreáticos es un proceso meticuloso que se lleva a cabo a través de la digestión enzimática de las conexiones entre los islotes y su estructura de soporte circundante extracelular. Esta destrucción de la matriz extracelular (MEC) es uno de los factores críticos en la caracterización del daño de los islotes que tiene lugar durante los procesos de aislamiento 1,2,3,4. La MEC periisletal es un componente acelular esencial del páncreas endocrino. Está compuesto por proteínas y polisacáridos, que interactúan y se entrecruzan para formar una red tridimensional que apoya estructural y bioquímicamente la homeostasis fisiológica, y ayuda en la recreación de este microambiente in vitro ^2,5,6. La pérdida de los procesos fundamentales de señalización entre los islotes y la MEC se reconoce como uno de los factores contribuyentes, lo que limita la supervivencia de los islotes in vitro e in vivo 2,7,8,9,10.

La MEC de origen animal y humano ha sido ampliamente utilizada para la recapitulación del microambiente de los islotes pancreáticos 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Desde que se informó por primera vez en la ^ref.20 la capacidad de la MEC para mejorar la adhesión, proliferación y mantenimiento del cultivo a largo plazo de las células de los islotes de rata, muchos otros estudios han proporcionado pruebas sólidas de que la restauración de la interacción de la MEC nativa con los islotes humanos mejora la función de los islotes^21,22. Por ejemplo, datos recientes han demostrado que los islotes encapsulados con ECM mejoraron significativamente el control glucémico en ratones diabéticos, mejorando y facilitando la administración de insulina en una nueva plataforma de administración de insulina basada en células²³. Además, los estudios han demostrado que la incorporación de componentes críticos de la MEC pancreática puede mejorar significativamente la función endocrina de las células β 24,25,26,27.

Los protocolos de fabricación de ECM presentes en la literatura se basan en la aplicación de detergentes químicos, por ejemplo, Triton X-100 o dodecil sulfato de sodio (SDS). A pesar de proporcionar una excelente eliminación del ADN, los productos químicos utilizados en los procesos de descelularización son citotóxicos, caros y los residuos en el tejido descelularizado plantean preocupaciones en vista de su posible aplicación clínica.

Sobre la base de estas observaciones, los objetivos de este estudio fueron tres: en primer lugar, desarrollar un método de descelularización para el páncreas humano con un uso mínimo de detergentes químicos iónicos o no iónicos; En segundo lugar, producir un andamio soluble de ECM para el cultivo de tejidos; En tercer lugar, caracterizar la MEC pancreática para evaluar su citotoxicidad e impacto en la función de las células de los islotes. La caracterización es necesaria para todas las aplicaciones basadas en cultivos celulares, ya que demuestra que la MEC pancreática solubilizada podría ser beneficiosa para recapitular el microambiente pancreático de islotes aislados. En este trabajo se describe un método de descelularización eficaz y sin detergente para el páncreas humano, la caracterización de la MEC y el efecto de la MEC sobre la viabilidad y la función de los islotes pancreáticos humanos aislados encapsulados.

Este estudio de investigación fue aprobado por el comité de investigación humana del Centro Médico Bautista Wake Forest. Los páncreas humanos se obtuvieron éticamente de donantes de órganos a través de Carolina Donor Services. Los donantes de órganos fueron examinados para detectar enfermedades infecciosas relevantes para los seres humanos, de acuerdo con las regulaciones de la UNOS. Los órganos se recibieron en una solución de conservación estéril donde se mantuvieron hasta su uso. Al llegar al laboratorio, se inspeccionaron todos los órganos y se recogieron muestras del páncreas nativo con fines histológicos. A continuación, los órganos se congelaron y se almacenaron en condiciones estériles a -20 °C hasta su uso posterior.

1. Preparación quirúrgica del páncreas humano

NOTA: Los páncreas congelados se descongelaron durante la noche a 4 °C.

1. Antes de iniciar la disección quirúrgica del páncreas humano, prepare 1 litro de solución de lavado, compuesta por 950 ml de agua desionizada (_dH2O), 50 ml de reactivo a base de yodo y una solución de pluma/estreptococo al 1%.
2. Use guantes estériles y una bata de laboratorio durante la disección quirúrgica. Realice todas las cirugías bajo una campana de grado de cultivo celular para evitar una posible contaminación.
3. Transfiera el páncreas de la bolsa de transporte estéril al recipiente de placenta estéril. Asegúrese de que el páncreas esté orientado con la cabeza del órgano hacia la izquierda y la cola hacia la derecha.
4. Diseccione cuidadosamente el duodeno desde la cabeza del páncreas con tijeras estériles y pinzas no dentadas. Tenga cuidado de no hacer un agujero en el duodeno, ya que esto aumenta las posibilidades de contaminación.
   NOTA: Si se hace un orificio en el tracto gastrointestinal, sujete rápidamente el orificio y proceda con la disección.
5. Una vez que se haya completado la disección de la cabeza del páncreas, deseche el duodeno en una bolsa de riesgo biológico adecuada y siga las pautas institucionales para su eliminación.
6. Diseccionar y desechar todo el tejido extrapancreático que queda alrededor de la cabeza del páncreas, incluidos los vasos sanguíneos principales y el conducto biliar común, que generalmente se marcan en el momento de la obtención del órgano con suturas no absorbibles. Deseche el pañuelo siguiendo las pautas institucionales.
7. Diseccionar y desechar todo el tejido extrapancreático y el tejido adiposo peripancreático que rodea la cola del páncreas, exponiendo los vasos sanguíneos esplénicos.
8. Una vez que el pedículo vascular del bazo esté expuesto, se extirpa el bazo y se diseccionan los vasos sanguíneos esplénicos en su totalidad, incluidos los que están unidos a la superficie posterior del páncreas (la arteria y la vena esplénicas). Deseche el bazo y extraiga el tejido siguiendo las pautas institucionales.
9. Diseccionar y desechar adecuadamente cualquier grasa extrapancreática claramente visible, especialmente la grasa peripancreática.
   NOTA: A nivel de la cola del páncreas, el retroperitoneo puede ser visible. Esto debe levantarse con pinzas no dentadas, retirarse en consecuencia con pinzas quirúrgicas y desecharse correctamente. El páncreas ahora debe estar libre de cualquier tejido extrapancreático.
10. Diseccionar el páncreas para obtener cubos de 1 cm^{y 3} de tejido pancreático utilizando tijeras quirúrgicas, cuchillas histológicas esterilizadas o bisturíes quirúrgicos. Los cubos de tejido pancreático obtenidos después de esta disección se someterán al proceso de descelularización. El número promedio de cubos pancreáticos que se someten a descelularización depende de las características intrínsecas del órgano. En promedio, entre 40 y 60 cubos pancreáticos se sometieron a descelularización en el estudio presentado.
11. Continúe con el paso 2.1

2. Descelularización del tejido pancreático

NOTA: Este protocolo se utilizó con páncreas con un peso promedio de 100 g; Por lo tanto, no se recomienda superar este peso cuando se utiliza esta técnica de descelularización.

1. Colocar todo el tejido pancreático previamente diseccionado en el paso 1.10 en un recipiente de plástico estéril (ver Tabla de Materiales) con la solución de lavado e incubar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
2. Retire el tejido pancreático con la ayuda de pinzas estériles y colóquelo en un nuevo recipiente estéril que contenga agua desionizada estéril y libre de endotoxinas. Cierre firmemente el tapón del recipiente y colóquelo en un agitador orbital refrigerado con una temperatura establecida de 4 °C y una velocidad de agitación entre 180 y 200 rpm durante 24 h.
3. Retire el recipiente con el tejido pancreático y limpie el exterior adecuadamente antes de colocarlo en la campana para continuar con el proceso.
4. Extraiga el tejido pancreático con pinzas quirúrgicas y colóquelo en un recipiente estéril nuevo, junto con 1 L de agua desionizada, 50 mg de DNasa I y cloruro de magnesio al 0,0025%. Cierre firmemente el tapón del recipiente y colóquelo en un agitador orbital, con una temperatura preestablecida de 37 °C y una velocidad de agitación de 100 rpm durante 6 h.
5. Preparación de la solución EDTA-Trizma
   1. Recoja un nuevo recipiente estéril de 1 L y límpielo adecuadamente antes de introducirlo en la campana. Para preparar 1 L de solución de EDTA-Trizma, agregue lo siguiente: 985 mL de agua desionizada estéril, 7,5 mL de tampón Tris-HCl y 7,5 mL de solución de EDTA. Guárdelo a 4 °C hasta su uso.
6. Retire el recipiente que encierra el tejido pancreático y limpie adecuadamente el exterior antes de introducirlo en la campana para continuar con el proceso.
7. Extraiga el tejido pancreático con la ayuda de pinzas quirúrgicas y colóquelo en un nuevo recipiente estéril con 1 L de solución a base de EDTA-Trizma. Cierre firmemente el tapón del recipiente y colóquelo en un agitador orbital, con una temperatura preestablecida de 4 °C y una velocidad de agitación entre 180 y 200 rpm durante 18 h.
8. Retire el recipiente que contiene el tejido pancreático y limpie el exterior adecuadamente antes de introducirlo en la campana para el proceso.
9. Retire el tejido pancreático con la ayuda de pinzas estériles y colóquelo en un nuevo recipiente estéril con agua desionizada estéril libre de endotoxinas. Cierre firmemente el tapón del recipiente y colóquelo en un agitador orbital refrigerado, con una temperatura establecida de 4 °C y una velocidad de agitación entre 180 y 200 rpm durante 24 h.
   NOTA: Durante este período de procesamiento, habrá un cambio notable en el color, en el que el tejido aparecerá más brillante.
10. Recoger el tejido pancreático y almacenarlo en tubos de centrifugación estériles de 50 mL, alcanzando un máximo de 25 mL por tubo para su posterior congelación y liofilización. El número de tubos de centrifugación varía en función del tamaño del páncreas. Almacene las muestras a -80 °C.

3. Producción de polvo de ECM pancreática: liofilización y criomolienda

1. Después de un mínimo de 24-40 h de almacenamiento del material descelularizado a -80 °C, transfiera el ECM pancreático a un liofilizador.
2. Transfiera el material congelado a un liofilizador, evitando que el material se descongele.
   NOTA: La etapa de liofilización dura aproximadamente de 3 a 5 días, dependiendo de varios factores, como la cantidad de material en cada tubo sometido al proceso y la superficie expuesta para la liofilización. Se recomienda que el tejido descelularizado no supere el nivel de 25 mL en cada tubo y que los tubos se congelen en un ángulo de 45°, lo que permite exponer fácilmente más superficie una vez que comience la liofilización. Retire las tapas de los tubos.
3. Después de la liofilización, transfiera los materiales a una campana de grado de cultivo celular.
4. Corta cada pieza del ECM seco a la mitad de su tamaño con unas tijeras estériles. Estas piezas secas de ECM se someterán a un proceso de molienda automatizado para producir un polvo de ECM. Utilice un procesador automático criomolido para evitar un aumento de temperatura y la posterior desnaturalización de las propiedades biológicas del ECM. Asegúrese de ajustar la configuración de la máquina de molienda criogénica para obtener un polvo fino después del proceso de molienda.
   NOTA: En este estudio se utilizaron páncreas de donantes con un IMC < 30. El páncreas de donantes con un IMC > 30 mostró una tendencia a contener más grasa intraparenquimatosa. El proceso de liofilización no se considera óptimo y puede ser inhibido por el contenido de grasa. Si después de la liofilización el tejido está visiblemente oleaginoso, debe desecharse ya que no será óptimo para la fabricación del polvo de ECM.

4. Solubilización de la MEC pancreática

NOTA: En este punto, a partir de un páncreas de tamaño medio (100 g), el rendimiento del polvo pancreático descelularizado es de 1-2 g.

1. Pesar 1 g de polvo de ECM con la ayuda de una espátula de plástico estéril.
2. Lograr la solubilización siguiendo los protocolos anteriormente descritos: Solubilizar 1 g de ECM en 100 mL de HCl 0,01 M y 100 mg de pepsina durante 48 h a RT con agitación constante²⁸.
3. Después de 48 h, utilice NaOH para neutralizar el pH (pH = 7) de la MEC ácida mientras mantiene el vaso de precipitados que contiene la MEC ácida en hielo para evitar la gelificación.
   NOTA: La cinética de gelificación varía según la temperatura, el contenido de colágeno, el pH y la solución neutralizante. En este estudio de investigación se utilizaron 0,01 M de NaOH. El volumen de NaOH añadido para la neutralización del pH fue de aproximadamente 100 mL. Considere medir el pH varias veces mientras neutraliza la solución ácida de ECM.
4. Transfiera la solución neutra de ECM a tubos de centrífuga estériles de 50 mL. Cierre los tubos y colóquelos en una centrífuga. Centrifugar los tubos que contienen el ECM solubilizado a velocidad máxima (12.000 x g) durante 15 min a 4 °C. Después de la centrifugación, transfiera los tubos a una campana de cultivo celular.
   NOTA: Después de la centrifugación de la muestra, el componente insoluble del ECM se depositará en la parte inferior del tubo, mientras que la solución de ECM solubilizada se encontrará en la parte superior del sobrenadante.
5. Utilizando técnicas estériles, recoger el sobrenadante del tubo que contiene la solución de MEC solubilizada y transferirlo a tubos frescos de 50 mL, alcanzando un máximo de 25 mL por tubo.
6. Almacene los tubos de solución de ECM a -80 °C.

5. Producción de polvo de ECM pancreática: liofilización y almacenamiento

1. Después de al menos 24-40 h de almacenamiento de la solución soluble de ECM a -80 °C, transfiera los tubos a un liofilizador.
2. Transfiera el material congelado a un liofilizador, asegurándose de que el material no se descongele.
   NOTA: La etapa de liofilización dura aproximadamente de 3 a 5 días, dependiendo de varios factores, como la cantidad de material en cada tubo sometido al proceso y la superficie expuesta para la liofilización. Se recomienda que la solución de MEC solubilizada no supere el nivel de 25 mL en cada tubo y que los tubos se congelen en un ángulo de 45° para permitir que se exponga fácilmente más superficie una vez que comience la liofilización. Retire las tapas del tubo de halcón antes de la liofilización.
3. Después de la liofilización de la solución de ECM solubilizada, transfiera el material a una campana de grado de cultivo celular. Después de la liofilización completa, se verá un polvo fino de ECM.
   NOTA: El rendimiento obtenido es de 700 mg a partir de 1 g de tejido descelularizado.
4. Almacene el polvo de ECM solubilizado o utilícelo para fines de cultivo celular.
   NOTA: Se recomienda almacenar el ECM a 4 °C para su uso inmediato, a -20 °C para su uso posterior y a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.

6. Caracterización de la MEC pancreática con tinción histológica

1. Recoger un trozo de páncreas nativo poco después de la entrega del órgano y antes de la descelularización. Arreglar esto durante 24 h en formalina al 10%. Lave las muestras con agua desionizada. Deshidratarlo en alcohol graduado antes de sumergirlo en parafina y cortarlo en secciones de 5 mm.
2. Al final del proceso de descelularización, recoja una muestra del material descelularizado y fíjela durante 24 h en formalina al 10%. Lave la muestra con agua desionizada. Deshidratarlo en alcohol graduado antes de sumergirlo en parafina y cortarlo en secciones de 5 mm.
3. Para verificar una descelularización exitosa, realice la tinción H&E y DAPI tanto en el páncreas nativo como en el contraparte descelularizada.
4. Para la caracterización histológica, realizar tinciones tricrómicas (MT) y azul alcián (AB) de Masson, que resaltarán las estructuras colágenas y GAG, respectivamente.

7. Caracterización del polvo soluble de ECM

1. Realizar análisis del contenido de ADN y colágeno total del tejido pancreático nativo y del polvo soluble de ECM como se describió anteriormente²⁹.
2. Cuantificar los glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) según el protocolo proporcionado por un kit disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales). Utilice un espectrofotómetro de microplacas para medir el contenido de sGAG sulfatado en la MEC pancreática a una longitud de onda de 595 nm³⁰.
   NOTA: Indique el contenido de ADN como ng/mg de tejido seco y el contenido de colágeno y GAG como μg/mg de tejido seco.

8. Encapsulación de islotes humanos con el ECM y la cultura

NOTA: Los islotes pancreáticos humanos se obtuvieron comercialmente (ver Tabla de Materiales).

1. A su llegada, cultive los islotes pancreáticos humanos en placas tratadas sin cultivo de tejidos durante 24 h en condiciones estándar con una densidad aproximada de 2.000 IEQ en cada placa de 10 cm.
2. Manipular los islotes humanos para probar el efecto de la ECM sobre la funcionalidad y viabilidad de los islotes con los siguientes grupos experimentales: Islotes libres, Islotes encapsulados en alginato e Islotes encapsulados en alginato-ECM.
   NOTA: Los grupos de islotes mencionados anteriormente se cultivaron in vitro en condiciones estándar durante un máximo de 8 días para evaluar el efecto de la MEC en la funcionalidad y viabilidad de los islotes.
3. Pesar el alginato en una báscula y suspenderlo con HBSS en un tubo de centrifugación para obtener una relación del 1,5% (p/v). Coloque el tubo de centrífuga en un rotador durante la noche a 4 °C.
   NOTA: El fabricante informó de un peso molecular entre 75 y 200 kDA y una relación G/M de ≤ 1 para el alginato.
4. Pesar 0,1 mg de MEC y suspenderlo en 1 mL del alginato previamente preparado para tener una concentración de MEC de 0,1 mg/mL.
5. Encapsular los islotes pancreáticos humanos en alginato y alginato-ECM según un protocolo previamente descrito³¹. El procedimiento se describe brevemente a continuación.
   1. Recoja y mezcle suavemente 3.000 IEQ en 1 mL de alginato y 3.000 IEQ en 1 mL de alginato-ECM a una concentración de ECM de 0,1 mg/mL previamente preparada en el paso 8.4.
   2. Bombear las suspensiones obtenidas a través de un dispositivo de encapsulación microfluídica ajustado a 0,2 mL/min y caudal y presión de aire de 2,0 Pa, respectivamente.
   3. Tras la producción, recoja las microcápsulas en un baño de 100 mM de CaCl₂ con 10 mM de HEPES. Deje que el alginato se reticule durante 10 minutos.
   4. Antes de cultivar, lavar los islotes encapsulados con HBSS en condiciones estándar, durante 2-3 min a 37 °C, con 5% de CO₂.
   5. Agregue los medios de cultivo (consulte la Tabla de materiales) y cambie dos tercios de los medios cada dos días hasta el final del experimento.
      NOTA: Los pasos anteriores deben realizarse tanto para los islotes en alginato como para los islotes en alginato-ECM.
6. El día 8, después de la encapsulación, se realizan análisis de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) y de ADN para evaluar la producción de insulina y la viabilidad de los islotes, respectivamente.
7. Obtenga imágenes de campo claro y tinción de vivos/muertos de islotes libres y encapsulados para evaluar la morfología y viabilidad celular.
   NOTA: Se realizó una evaluación cualitativa de las imágenes para evaluar la salud de los islotes. Los parámetros que se tienen en cuenta incluyen la forma, el borde, la integridad y el diámetro de los islotes, así como la presencia de células individuales en cultivo.

9. Liberación de insulina estimulada por glucosa (GSIS) y medición de ADN

NOTA: En el día 8, después de la encapsulación, se recolectaron islotes pancreáticos humanos y se incubaron con el tampón de Kreb, que contenía concentraciones bajas (2,8 mM) y altas (16,8 mM) de glucosa, seguidas de una solución de despolarización de KCl (25 mM). La provocación glucémica se realizó modificando un protocolo previamente descrito³².

1. Inserte resina de filtración en gel en columnas de polipropileno.
2. Inserte grupos de tratamiento (islotes libres o islotes encapsulados) en la parte media de la resina de filtración en gel dentro de las columnas de polipropileno.
3. Pipetear la glucosa y las soluciones despolarizantes en las columnas de polipropileno descritas anteriormente e incubar durante 1 h, en el siguiente orden: realizar un período de preincubación con solución de glucosa de baja molaridad, luego proceder con una serie de incubaciones con solución de glucosa baja, alta, baja y despolarizante como se menciona en la NOTA al comienzo de la sección 9.
4. Recoja el medio de cada fase de incubación y guárdelo a -80 °C para su posterior análisis.
5. Después de la incubación y recolección de la solución despolarizante, incubar los islotes pancreáticos humanos con 1 mL de tampón de extracción de ADN y almacenarlo hasta un análisis adicional.
6. Mida el contenido de insulina de las incubaciones de glucosa y de la solución despolarizante con un ensayo ELISA de insulina, siguiendo el protocolo del fabricante.
7. Mida el contenido de ADN del tampón de extracción recogido en el paso 9.5 utilizando un kit de ensayo de ADN siguiendo el protocolo del fabricante.
8. Normalizar las mediciones de insulina según el contenido de ADN.

10. Análisis estadístico

NOTA: Las comparaciones de grupos se refieren al mismo lote de islotes humanos con n = 3 evaluaciones independientes realizadas para cada ensayo descrito en este manuscrito. Los valores se expresan como Media ± DE.

1. Utilice un software estadístico para realizar la prueba de Mann-Whitney para la evaluación de la descelularización y los análisis de restos de ADN, compare el páncreas nativo, el descelularizado y el ECM solubilizado.
2. Realizar una prueba t no apareada para la evaluación de los glicosaminoglicanos y el colágeno entre el páncreas nativo, el páncreas descelularizado y la MEC solubilizada.
3. Realizar un ANOVA de 2 vías con comparaciones múltiples post-hoc de Turquía para el Test de Estimulación de Glucosa en la evaluación de la estimulación de los islotes en el día 8.
4. Considere la significación estadística en p < 0.05 con designación de *p < 0.05, **p<0.01, ***p < 0.001 y ****p < 0.0001.

Las muestras de páncreas nativas y acelulares se procesaron para la tinción histológica con H&E, MT y AB. La tinción con H&E mostró ausencia completa de material nuclear y células, lo que confirma el éxito de la descelularización. Las tinciones MT y AB mostraron el marco de la MEC, destacando cualitativamente los componentes colágenos y estromales, respectivamente (Figura 1).

Este método permitió la generación consistente de un polvo de ECM a partir del páncreas humano. Las pruebas de cuantificación de ADN confirmaron un aclaramiento celular satisfactorio³³. Se caracterizaron bioquímicamente las MEC pancreáticas nativas, acelulares y solubilizadas para evaluar la composición biológica básica. Se determinó que la MEC pancreática era acelular y libre de ADN (ADN < 50 ^ng.mg-1 de tejido seco), con preservación consistente de colágeno y glicosaminoglicanos según lo reportado por otros^11,15. El análisis de ADN demostró el aclaramiento de ácido desoxirribonucleico en la MEC pancreática acelular y solubilizada (de 4,56 μg/mg ± 3,42 μg/mg a 30,05 ng/mg ± 22,89 ng/mg para el páncreas acelular, p = 0,0001; de 4,56 μg/mg ± 3,42 μg/mg a 22,81 ng/mg ± 11,31 ng/mg para la MEC pancreática solubilizada). (Figura 2).

El colágeno total se cuantificó en el páncreas nativo, en el acelular y en la MEC pancreática solubilizada. Los resultados mostraron un aumento estadísticamente significativo del colágeno en el páncreas acelular y en la MEC pancreática soluble en comparación con el tejido nativo (de 7,35 μg/mg ± 1,68 μg/mg a 27,74 μg/mg ± 2,35 μg/mg para el páncreas acelular p < 0,0001; de 7,35 μg/mg ± 1,68 μg/mg a 26,08 μg/mg ± 3,63 μg/mg para la MEC pancreática solubilizada p < 0,001). Este aumento en el contenido de colágeno se debe al aislamiento y purificación de la MEC de los componentes celulares, que representan un enriquecimiento general de colágeno y sGAG en la MEC en comparación con el órgano nativo (Figura 2).

La cuantificación de los glicosaminoglicanos mostró una disminución estadísticamente significativa del contenido de GAG en el tejido acelular y en la MEC pancreática solubilizada comparable a nuestro estudio previo^11,15, con una disminución de 15,08 μg/mg ± 3,03 μg/mg a 4,87 μg/mg ± 1,20 μg/mg para el páncreas acelular p < 0,001 y de 15,08 μg/mg ± 3,03 μg/mg a 3,45 μg/mg ± 0,20 μg/mg para la MEC pancreática solubilizada (p < 0,01) (Figura 2).

Los islotes encapsulados cultivados en placas tratadas sin cultivo de tejidos fueron viables 8 días después de la encapsulación. Tanto la tinción viva como la muerta mostraron que los islotes cultivados en las tres condiciones diferentes eran viables; sin embargo, hubo una mayor presencia de células muertas cuando no estaban encapsuladas (Figura 3). Los islotes encapsulados mantuvieron su forma esférica con un borde bien redondeado, un diámetro estable y casi ninguna célula individual en cultivo. En el momento analizado, los islotes libres mostraron una tendencia a agregarse, a desarrollar irregularidades en los bordes y formas, y a exhibir un núcleo más oscuro, lo que sugiere un evento necrótico.

Se encontró que tanto los islotes libres como los encapsulados respondían a la glucosa en el punto de tiempo analizado (Figura 3). Los islotes encapsulados en alginato ECM mostraron un aumento significativo en la secreción de insulina después de la estimulación con glucosa alta y la despolarización de KCl en comparación con los islotes encapsulados libres y solo con alginato.

Figura 1: Imágenes histológicas representativas de H&E, tricrómico de Masson y azul alcián. El páncreas humano nativo (A,C,E) y la ECM pancreática humana (B,D,F) se descelularizaron con el protocolo experimental recientemente desarrollado. El panel de H&E demostró una pérdida completa de las estructuras nucleares en comparación con el tejido pancreático nativo. La tinción tricrómica de Masson resalta el marco de la matriz extracelular y la tinción azul alcián resalta el marco del tejido conectivo de la matriz extracelular. Barra de escala = 100 μm para los paneles A, C, D, E, F; Barra de escala = 25 μm para el panel B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Caracterización bioquímica de ECM de páncreas nativo, acelular y pancreática solubilizada. (A) Se confirmó la eliminación satisfactoria de ADN en el páncreas acelular y en la MEC pancreática solubilizada. (B,C) Cuantificación de glicosaminoglicanos y colágeno realizada en el páncreas nativo en comparación con la MEC acelular y solubilizada. El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de páncreas nativo versus descelularizado y ECM nativa vs solubilizada; = p < 0,0001; p < 0,001; **p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Evaluación cualitativa de la viabilidad de los islotes humanos y evaluación cuantitativa de la secreción de insulina. (A) Imágenes de campo claro y Vivo/muerto de islotes humanos aislados cultivados como libres, en cápsulas de alginato y en cápsulas de alginato-ECM en el día 6 después de la encapsulación. (B) Evaluación de la estimulación de la glucosa de islotes humanos aislados cultivados en placa tratada sin cultivo de tejidos en tres entornos diferentes: libre, en cápsulas de alginato y en cápsulas de alginato-ECM en el día 8 después de la encapsulación. Los valores de la secreción de insulina se informaron después de la normalización del ADN. Se realizan comparaciones estadísticas de la secreción de insulina entre las tres condiciones de cultivo en glucosa alta y después de la solución despolarizante de KCl, respectivamente; *p < 0,0 y ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo de descelularización más suave y sin detergentes para producir MEC pancreática. Se prestó atención a la preservación de los componentes de la MEC del parénquima pancreático y a evitar una exposición prolongada del tejido a detergentes químicos iónicos o no iónicos convencionales durante el proceso de descelularización.

El aspecto más innovador del método de descelularización desarrollado es que se evitan los detergentes químicos iónicos y no iónicos clásicos. Nuestra experiencia previa con la producción de ECM pancreática humana 11,12,13,22,34,35 estableció la línea de base para la producción de medios de soporte pancreáticos acelulares. Sin embargo, la infusión con cientos de litros de detergentes químicos a través del conducto pancreático, la arteria mesentérica superior y la arteria esplénica^11,13, requiere técnicas quirúrgicas específicas y no siempre es factible en la producción a gran escala. Y lo que es más importante, la descelularización del tejido en un agitador orbital en lugar de infundir detergentes a través de la vasculatura representa un cambio de paradigma en la metodología, que contribuye enormemente a la facilidad técnica, la consistencia y la viabilidad de la descelularización, lo que mejora la producción de MEC para la traducción. Además, los órganos obtenidos con fines de investigación a menudo se dañan debido a inconsistencias en el proceso de obtención, a veces atribuibles a una anatomía anormal que frustra la canulación. Por lo tanto, nuestro método permitiría procesar todos los órganos para su descelularización. Inferimos que este método podría ser de interés para la descelularización y la producción de MEC a partir de diversos órganos y potencialmente para aplicaciones tanto in vitro como in vivo.

El desarrollo del presente método de descelularización estuvo influenciado por nuestra experiencia previa utilizando Triton X-100 como detergente químico principal 11,13,36. La imposibilidad de cuantificar el remanente de Triton X-100 en la ECM después de la descelularización y la falta de viabilidad en la ampliación del proceso de fabricación en un entorno cGMP llevaron a nuestro grupo a investigar la viabilidad de obtener la descelularización mediante agitación mecánica en lugar de una perfusión de todo el páncreas. Planteamos la hipótesis de que la utilización de una solución hipotónica sería eficiente para precipitar el daño osmótico en las células residentes y exponer el material nuclear celular para un tratamiento enzimático posterior, un proceso dirigido a la eliminación de los residuos de ácido desoxirribonucleico. Siguiendo los enfoques iniciales para descelularizar el páncreas humano agitando el tejido cortado en cubitos en detergentes químicos durante 48 h, observamos que el agua desionizada era eficaz para proporcionar el daño celular necesario para el paso enzimático posterior y las eliminaciones celulares. A continuación, exploramos la opción de reducir la fase sin detergente a las 24 h y confirmamos que el daño mecánico celular debido a la solución hipotónica, el agua desionizada, era capaz de proporcionar una descelularización exitosa al tiempo que evitaba el uso de posibles agentes citotóxicos. Nuestros datos sobre la cuantificación de colágeno y glicosaminoglicanos mostraron tendencias consistentes con nuestras experiencias previas y las observaciones recientes de otros grupos de investigación sobre el páncreas humano^11,15. Además, encontramos que una etapa de solubilización no redujo la cantidad de componentes críticos del ECM, ya que su conservación es crítica para que los andamios de ECM ejerzan la función 15,21,24,36. Los métodos de descelularización del páncreas actualmente discutidos en la literatura³⁷ se caracterizan por el uso de detergentes iónicos o no iónicos y la consecuente pérdida de la composición innata de la MEC, lo que permite inferir que un método más suave, posiblemente sin detergente, preservaría mejor los componentes básicos de la MEC pancreática.

El ECM es el marco 3D que proporciona soporte estructural y bioquímico a las células de los organismos pluricelulares. Las proteínas y estructuras de la MEC desempeñan un papel vital en la determinación, diferenciación, proliferación, supervivencia, polaridad y migración^{de las} células. La justificación para incorporar la MEC pancreática tanto en aplicaciones in vitro como in vivo se basa en la evidencia de que: en los islotes maduros, las interacciones con la MEC u otros materiales de la matriz regulan la supervivencia celular, la proliferación y la secreción de insulina, y ayudan en la preservación y restauración de la morfología de los islotes esféricos 3,21,22,38 ; los islotes parcialmente digeridos que conservan algunas de sus conexiones ECM nativas muestran tasas de apoptosis notablemente reducidas y una funcionalidad GSIS significativamente mayor en comparación con los islotes altamente purificados y sin ECM 38,39,40; y la MEC mejora la función de los islotes al prevenir la infiltración de leucocitos y regular al alza la expresión de la integrina α3 y la quinasa de adhesión focal, una característica crucial para la adhesión e interacción entre las células beta y la MEC 41,42,43.

La secreción de insulina estimulada por glucosa después de la encapsulación de islotes humanos en microcápsulas de alginato muestra cómo la reconstitución de un entorno tridimensional proporciona un entorno más saludable para los islotes en comparación con un cultivo in vitro en placas tratadas sin cultivo de tejidos. La encapsulación con alginato proporciona el mantenimiento de la estructura inicial de los islotes, evitando la aglomeración celular y la dispersión de células individuales, constituyendo así la estructura fisiológica de los islotes humanos. Es bien sabido que la función de los islotes disminuye gradualmente con el tiempo cuando se cultiva in vitro en condiciones normales, y el alginato, un biomaterial inerte, no proporciona suficiente señalización bioquímica para el mantenimiento de la función óptima de los islotes. Nuestro biomaterial ECM demostró tener un impacto positivo in vitro en la viabilidad y la funcionalidad de los islotes cuando se encapsulan con alginato en comparación con el alginato solo. Es necesario realizar más investigaciones para demostrar si la adición de este biomaterial solubilizado podría servir como un paso hacia la mejora de las tecnologías basadas en islotes para sistemas de cultivo in vitro y para posibles aplicaciones in vivo^44,45.

En el protocolo de descelularización presentado se pueden destacar algunos pasos críticos: (1) una disección quirúrgica no óptima del páncreas humano puede conducir a una presencia excesiva de tejido adiposo, lo que perjudicará drásticamente el proceso de descelularización; (2) es posible que no se logre una liofilización efectiva cuando hay un exceso de tejido adiposo; (3) Esto afectará inevitablemente el paso de criomolienda, que no será eficiente.

Se encontraron varias limitaciones utilizando el protocolo presentado: (1) se observó variabilidad de órganos de humano a humano antes y después de la descelularización; (2) también hubo algunos resultados no óptimos de descelularización en órganos derivados de donantes con antecedentes de abuso de alcohol, pacientes con IMC > 30 y acumulación excesiva de tejido adiposo peri e intrapancreático. Concluimos que el páncreas humano de donantes con IMC < 30 se consideró generalmente adecuado para la descelularización.

Los resultados de este estudio muestran que el páncreas humano puede ser descelularizado con un proceso de base osmótica, libre de detergente, para obtener andamios de MEC para su aplicación en medicina de reemplazo de células beta, y manipulación de islotes in vitro. El proceso de fabricación presenta un enfoque factible y reproducible para fines traslacionales y la evitación de detergentes químicos y el uso de un sistema basado en perfusión representan soluciones eficientes y rentables para producir un biomaterial basado en ECM, que cuando se solubiliza podría usarse en investigación y, potencialmente, en entornos clínicos. Existe potencial para evaluar la eficacia de este biomaterial a través de la recapitulación de un nicho óptimo para los islotes pancreáticos y para las células productoras de insulina para mejorar el mantenimiento celular a largo plazo, la viabilidad y la diferenciación celular.

No hay intereses financieros contrapuestos que declarar por parte de ninguno de los coautores.

Este proyecto ha recibido financiación del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención nº 646272. Los islotes pancreáticos humanos se obtuvieron de Prodo Laboratories, Aliso Viejo, CA 92656.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University