Descelularização sem detergente do pâncreas humano para produção de matriz extracelular (MEC) solúvel

O protocolo descrito neste manuscrito explica as etapas para a fabricação de uma matriz extracelular solúvel (MEC) a partir do pâncreas humano. O pó de ECM solubilizado obtido através deste protocolo pode ser usado para a recapitulação do microambiente das ilhotas pancreáticas in vitro e, potencialmente, in vivo.

O transplante de ilhotas (ITx) tem o potencial de se tornar o padrão de tratamento na medicina de reposição de células beta, mas seus resultados permanecem inferiores aos obtidos com o transplante de pâncreas inteiro. Os protocolos atualmente utilizados para o isolamento das ilhotas humanas estão sob escrutínio porque se baseiam na digestão enzimática do órgão, por meio da qual o pâncreas é demolido, suas conexões com o corpo são perdidas e as ilhotas são irreversivelmente danificadas. O dano das ilhotas é caracterizado por fatores críticos, como a destruição da matriz extracelular (MEC), que representa a estrutura 3D do nicho das ilhotas e cuja perda é incompatível com a eufisiologia das ilhotas. Os pesquisadores estão propondo o uso de andaimes baseados em ECM derivados do pâncreas de mamíferos para resolver esse problema e, finalmente, melhorar a viabilidade, função e vida útil das ilhotas. Os métodos atualmente disponíveis para obter esses andaimes são agressivos porque são em grande parte à base de detergente. Assim, propomos um novo método sem detergente que cria menos danos à ECM e pode preservar componentes críticos da ECM pancreática. Os resultados mostram que o protocolo de descelularização recém-desenvolvido permitiu a obtenção da depuração completa do DNA enquanto os componentes da ECM foram retidos. A MEC obtida foi testada quanto à citotoxicidade e encapsulada com ilhotas pancreáticas humanas que apresentaram comportamento celular positivo com secreção de insulina quando estimuladas com desafio de glicose. Coletivamente, propomos um novo método para a descelularização do pâncreas humano sem o uso de detergentes químicos iônicos e não iônicos convencionais. Este protocolo e o ECM obtido com ele podem ser úteis para aplicações in vitro e in vivo.

O isolamento das ilhotas pancreáticas é um processo meticuloso realizado através da digestão enzimática das conexões entre as ilhotas e sua estrutura de suporte extracelular circundante. Essa destruição da matriz extracelular (MEC) é um dos fatores críticos na caracterização dos danos das ilhotas que ocorrem durante os processos de isolamento 1,2,3,4. A MEC peri-ilhota é um componente acelular essencial do pâncreas endócrino. É composto por proteínas e polissacarídeos, que interagem e se reticulam para formar uma rede tridimensional que sustenta estrutural e bioquimicamente a homeostase fisiológica, e auxilia na recriação desse microambiente in vitro ^2,5,6. A perda de processos fundamentais de sinalização entre ilhotas e ECM é reconhecida como um dos fatores contribuintes, o que limita a sobrevivência das ilhotas in vitro e in vivo 2,7,8,9,10.

A ECM derivada de animais e humanos tem sido amplamente utilizada para a recapitulação do microambiente das ilhotas pancreáticas 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Uma vez que a capacidade da ECM de aumentar a fixação, proliferação e manutenção da cultura de células de ilhotas de rato foi relatada pela primeira vez na ^ref.20, muitos outros estudos forneceram fortes evidências de que a restauração da interação da ECM nativa com ilhotas humanas melhora a função das ilhotas^21,22. Por exemplo, dados recentes mostraram que ilhotas encapsuladas com ECM melhoraram significativamente o controle glicêmico em camundongos diabéticos, aumentando e facilitando a entrega de insulina em uma nova plataforma de administração de insulina baseada em células²³. Além disso, estudos demonstraram que a incorporação de componentes críticos da MEC pancreática pode melhorar significativamente a função endócrina das células β^{24 , 25 , 26 , 27} .

Os protocolos de fabricação de ECM presentes na literatura são baseados na aplicação de detergentes químicos, por exemplo, Triton X-100 ou dodecil sulfato de sódio (SDS). Apesar de proporcionar excelente depuração de DNA, os produtos químicos utilizados nos processos de descelularização são citotóxicos, caros e os resíduos no tecido descelularizado trazem preocupações em vista da potencial aplicação clínica.

Com base nessas observações, os objetivos deste estudo foram três: primeiro, desenvolver um método de descelularização para o pâncreas humano com uso mínimo de detergentes químicos iônicos ou não iônicos; Em segundo lugar, para produzir um andaime ECM solúvel para cultura de tecidos; Terceiro, caracterizar a MEC pancreática para avaliar sua citotoxicidade e impacto na função das células das ilhotas. A caracterização é necessária para todas as aplicações baseadas em cultura de células, pois demonstra que a ECM pancreática solubilizada pode ser benéfica na recapitulação do microambiente pancreático para ilhotas isoladas. Aqui está descrito um método eficaz de descelularização sem detergente para o pâncreas humano, caracterização da ECM e o efeito da ECM na viabilidade e função de ilhotas pancreáticas humanas isoladas encapsuladas.

Este estudo de pesquisa foi aprovado pelo comitê de pesquisa humana do Wake Forest Baptist Medical Center. O pâncreas humano foi obtido eticamente de doadores de órgãos por meio do Carolina Donor Services. Os doadores de órgãos foram rastreados para doenças infecciosas relevantes para humanos, de acordo com os regulamentos da UNOS. Os órgãos foram recebidos em solução de preservação estéril, onde foram mantidos até o uso. Após a entrega ao laboratório, todos os órgãos foram inspecionados e amostras do pâncreas nativo foram coletadas para fins histológicos. Os órgãos foram então congelados e armazenados em condições estéreis a -20 °C até uso posterior.

1. Preparação cirúrgica do pâncreas humano

NOTA: Os pâncreas congelados foram descongelados durante a noite a 4 °C.

1. Antes de iniciar a dissecção cirúrgica do pâncreas humano, prepare 1 L de solução de lavagem, consistindo de 950 mL de água deionizada (dH₂O), 50 mL de reagente à base de iodo e solução de Pen/Strep a 1%.
2. Use luvas estéreis e jaleco durante a dissecção cirúrgica. Realize todas as cirurgias sob um capuz de grau de cultura de células para evitar possível contaminação.
3. Transfira o pâncreas da bolsa de transporte estéril para a bacia de placenta estéril. Certifique-se de que o pâncreas esteja orientado com a cabeça do órgão para a esquerda e a cauda para a direita.
4. Disseque cuidadosamente o duodeno da cabeça do pâncreas usando uma tesoura estéril e uma pinça não dentada. Tenha cuidado para não fazer um furo no duodeno, pois isso aumenta as chances de contaminação.
   NOTA: Se for feito um orifício no trato gastrointestinal, prenda rapidamente o orifício e prossiga com a dissecção.
5. Uma vez concluída a dissecção da cabeça do pâncreas, descarte o duodeno em um saco de risco biológico apropriado e siga as diretrizes institucionais para seu descarte.
6. Disseque e descarte todo o tecido extrapancreático remanescente ao redor da cabeça do pâncreas, incluindo os principais vasos sanguíneos e o ducto biliar comum, que geralmente são marcados no momento da obtenção do órgão com suturas não absorvíveis. Descarte o lenço de papel seguindo as diretrizes institucionais.
7. Dissecar e descartar todo o tecido extrapancreático e tecido adiposo peripancreático ao redor da cauda do pâncreas, expondo os vasos sanguíneos esplênicos.
8. Uma vez que o pedículo vascular do baço esteja exposto, remova o baço e disseque os vasos sanguíneos esplênicos em sua totalidade, incluindo aqueles ligados à superfície posterior do pâncreas (a artéria e a veia esplênicas). Descarte o baço e remova o tecido seguindo as diretrizes institucionais.
9. Dissecar e descartar adequadamente qualquer gordura extra-pancreática claramente visível, especialmente a gordura peripancreática.
   NOTA: Ao nível da cauda do pâncreas, o retroperitônio pode ser visível. Este deve ser levantado com pinças não dentadas, removido de acordo com uma pinça cirúrgica e descartado adequadamente. O pâncreas agora deve estar livre de qualquer tecido extra-pancreático.
10. Disseque o pâncreas para obter 1 cm^{e 3} cubos de tecido pancreático usando tesoura cirúrgica, lâminas histológicas esterilizadas ou bisturis cirúrgicos. Os cubos de tecido pancreático obtidos após esta dissecção serão submetidos ao processo de descelularização. O número médio de cubos pancreáticos que sofrem descelularização depende das características intrínsecas do órgão. Em média, entre 40 e 60 cubos pancreáticos foram submetidos à descelularização no estudo apresentado.
11. Prossiga para a etapa 2.1

2. Descelularização do tecido pancreático

NOTA: Este protocolo foi utilizado com pâncreas com peso médio de 100 g; portanto, não é recomendado exceder esse peso ao usar esta técnica de descelularização.

1. Coloque todo o tecido pancreático previamente dissecado na etapa 1.10 em um recipiente plástico estéril (consulte a Tabela de Materiais) com a solução de lavagem e incube por 15 min em temperatura ambiente (TR).
2. Remova o tecido pancreático com a ajuda de uma pinça estéril e coloque-o em um novo recipiente estéril que contenha água deionizada estéril e livre de endotoxinas. Feche firmemente a tampa do recipiente e coloque-o sobre um agitador orbital refrigerado com uma temperatura definida de 4 °C e uma velocidade de agitação entre 180–200 rpm por 24 h.
3. Remova o recipiente com o tecido pancreático e limpe a parte externa adequadamente antes de colocá-lo no capô para continuar o processo.
4. Remova o tecido pancreático usando uma pinça cirúrgica e coloque-o em um novo recipiente estéril, juntamente com 1 L de água deionizada, 50 mg de DNase I e cloreto de magnésio a 0,0025%. Feche firmemente a tampa do recipiente e coloque-o em um agitador orbital, com uma temperatura predefinida de 37 °C e velocidade de agitação de 100 rpm por 6 h.
5. Preparar a solução EDTA-Trizma
   1. Reúna um novo recipiente estéril de 1 L e limpe-o adequadamente antes de introduzi-lo no exaustor. Para preparar 1 L de solução de EDTA-Trizma, adicione o seguinte: 985 mL de água deionizada estéril, 7,5 mL de tampão Tris-HCl e 7,5 mL de solução de EDTA. Armazene-o a 4 °C até o uso.
6. Remova o recipiente que envolve o tecido pancreático e limpe a parte externa adequadamente antes de introduzi-lo no capô para a continuação do processo.
7. Remova o tecido pancreático com a ajuda de uma pinça cirúrgica e coloque-o em um novo recipiente estéril com 1 L de solução à base de EDTA-Trizma. Feche firmemente a tampa do recipiente e coloque-o em um agitador orbital, com uma temperatura predefinida de 4 °C e uma velocidade de agitação entre 180–200 rpm por 18 h.
8. Remova o recipiente que contém o tecido pancreático e limpe a parte externa adequadamente antes de introduzi-lo no exaustor para o processo.
9. Remova o tecido pancreático com a ajuda de uma pinça estéril e coloque-o em um novo recipiente estéril com água deionizada estéril e livre de endotoxinas. Feche firmemente a tampa do recipiente e coloque-o sobre um agitador orbital refrigerado, com uma temperatura definida de 4 °C e velocidade de agitação entre 180 e 200 rpm por 24 h.
   NOTA: Durante este período de processamento, haverá uma mudança perceptível na cor, na qual o tecido parecerá mais brilhante.
10. Coletar o tecido pancreático e armazená-lo em tubos de centrifugação estéreis de 50 mL, atingindo um máximo de 25 mL por tubo para posterior congelamento e liofilização. O número de tubos de centrifugação varia de acordo com o tamanho do pâncreas. Armazene amostras a -80 °C.

3. Produção de pó de ECM pancreático – liofilização e criomoagem

1. Após um mínimo de 24–40 h de armazenamento do material descelularizado a -80 °C, transfira o ECM pancreático para um liofilizador.
2. Transfira o material congelado para um liofilizador, evitando que o material descongele.
   NOTA: A etapa de liofilização leva aproximadamente 3 a 5 dias, dependendo de vários fatores, como a quantidade de material em cada tubo submetido ao processo e a superfície exposta para liofilização. Recomenda-se que o tecido descelularizado não exceda o nível de 25 mL em cada tubo e que os tubos sejam congelados em um ângulo de 45°, permitindo que mais superfície seja prontamente exposta quando a liofilização for iniciada. Remova as tampas dos tubos.
3. Após a liofilização, transfira os materiais para uma coifa de grau de cultura de células.
4. Corte cada pedaço do ECM seco na metade de seu tamanho usando uma tesoura estéril. Essas peças secas de ECM serão submetidas a um processo de moagem automatizado para produzir um pó de ECM. Use um processador automático crio-moído para evitar um aumento na temperatura e subsequente desnaturação das propriedades biológicas do ECM. Certifique-se de ajustar a configuração da criofresadora para obter um pó fino após o processo de moagem.
   NOTA: Neste estudo, foi utilizado pâncreas de doadores com IMC < 30. O pâncreas de doadores com IMC > 30 mostrou uma tendência a conter mais gordura intraparenquimatosa. O processo de liofilização não é considerado ideal e pode ser inibido pelo teor de gordura. Se após a liofilização o tecido estiver visivelmente oleagino, ele deve ser descartado, pois não será ideal para a fabricação do pó de MEC.

4. Solubilização da ECM pancreática

NOTA: Neste ponto, a partir de um pâncreas de tamanho médio (100 g), o rendimento do pó pancreático descelularizado é de 1–2 g.

1. Pesar 1 g de pó de ECM com a ajuda de uma espátula de plástico estéril.
2. Alcançar a solubilização seguindo os protocolos descritos anteriormente: Solubilizar 1 g de ECM em 100 mL de HCl 0,01 M e 100 mg de pepsina por 48 h em TR com agitação constante²⁸.
3. Após 48 h, use NaOH para neutralizar o pH (pH = 7) da ECM ácida, mantendo o béquer contendo a ECM ácida no gelo para evitar a gelificação.
   NOTA: A cinética de gelificação varia de acordo com a temperatura, teor de colágeno, pH e solução neutralizante. Nesta pesquisa, foi utilizado 0,01 M de NaOH. O volume de NaOH adicionado para neutralização do pH foi de aproximadamente 100 mL. Considere medir o pH várias vezes enquanto neutraliza a solução ácida de ECM.
4. Transfira a solução neutra de ECM para tubos de centrífuga estéreis de 50 mL. Feche os tubos e coloque-os em uma centrífuga. Centrifugue os tubos contendo o ECM solubilizado na velocidade máxima (12.000 x g) por 15 min a 4 °C. Após a centrifugação, transfira os tubos para uma capa de cultura de células.
   NOTA: Após a centrifugação da amostra, o componente insolúvel da ECM será depositado no fundo do tubo, enquanto a solução solubilizada da ECM será encontrada na parte superior do sobrenadante.
5. Utilizando técnicas estéreis, coletar o sobrenadante do tubo contendo a solução solubilizada de ECM e transferi-lo para tubos frescos de 50 mL, atingindo um máximo de 25 mL por tubo.
6. Armazene os tubos de solução ECM a -80 °C.

5. Produção de pó de ECM pancreático – liofilização e armazenamento

1. Após pelo menos 24–40 h de armazenamento da solução de ECM solúvel a -80 °C, transfira os tubos para um liofilizador.
2. Transfira o material congelado para um liofilizador, garantindo que o material não descongele.
   NOTA: A etapa de liofilização leva aproximadamente 3 a 5 dias, dependendo de vários fatores, como a quantidade de material em cada tubo submetido ao processo e a superfície exposta para liofilização. Recomenda-se que a solução de ECM solubilizada não exceda o nível de 25 mL em cada tubo e que os tubos sejam congelados em um ângulo de 45° para permitir que mais superfície seja prontamente exposta assim que a liofilização começar. Remova as tampas do tubo de falcão antes da liofilização.
3. Após a liofilização da solução solubilizada de ECM, transfira o material para uma capela de grau de cultura de células. Após a liofilização completa, um pó fino de ECM será visível.
   NOTA: O rendimento obtido é de 700 mg a partir de 1 g de tecido descelularizado.
4. Armazene o pó solubilizado do ECM ou use-o para finalidades da cultura de pilha.
   NOTA: É aconselhável armazenar o ECM a 4 °C para uso imediato, a -20 °C para uso posterior e a -80 °C para armazenamento de longo prazo.

6. Caracterização da ECM pancreática com coloração histológica

1. Colete um pedaço de pâncreas nativo logo após o parto do órgão e antes da descelularização. Fixe isso por 24 h em formol a 10%. Lave as amostras em água desionizada. Desidrate-o em álcool graduado antes de incluí-lo em parafina e corte em seções de 5 mm.
2. Ao final do processo de descelularização, colete uma amostra do material descelularizado e fixe-a por 24 h em formol a 10%. Lave a amostra em água deionizada. Desidrate-o em álcool graduado antes de incluí-lo em parafina e corte em seções de 5 mm.
3. Para verificar uma descelularização bem-sucedida, realize a coloração H&E e DAPI no pâncreas nativo e na contraparte descelularizada.
4. Para caracterização histológica, realizar as colorações Tricrômico de Masson (MT) e Azul de Alcian (AB), que destacarão as estruturas colágenas e GAGs, respectivamente.

7. Caracterização do pó solúvel da ECM

1. Realizar análise do conteúdo de DNA e colágeno total do tecido pancreático nativo e do pó de ECM solúvel, conforme descrito anteriormente²⁹.
2. Quantificar os glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) com base no protocolo fornecido por um kit disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). Use um espectrofotômetro de microplacas para medir o conteúdo de sGAG sulfatado na ECM pancreática em um comprimento de onda de 595 nm³⁰.
   NOTA: Relate o conteúdo de DNA como ng/mg de tecido seco e o conteúdo de colágeno e GAGs como μg/mg de tecido seco.

8. Encapsulamento de ilhotas humanas com a ECM e cultura

NOTA: As ilhotas pancreáticas humanas foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais).

1. Na chegada, cultive as ilhotas pancreáticas humanas em placas tratadas sem cultura de tecidos por 24 h em condições padrão com uma densidade aproximada de 2.000 IEQ em cada placa de 10 cm.
2. Manipular as ilhotas humanas para testar o efeito da ECM na funcionalidade e viabilidade das ilhotas com os seguintes grupos experimentais: ilhotas livres, ilhotas encapsuladas em alginato e ilhotas encapsuladas em alginato-ECM.
   NOTA: Os grupos de ilhotas acima mencionados foram cultivados in vitro sob condição padrão por até 8 dias para avaliar o efeito da ECM na funcionalidade e viabilidade das ilhotas.
3. Pesar o alginato em uma balança e suspendê-lo com HBSS em um tubo de centrifugação para obter uma proporção de 1,5% (p / v). Colocar o tubo da centrífuga num rotador durante a noite a 4 °C.
   NOTA: Um peso molecular entre 75–200 kDA e uma relação G/M de ≤ 1 foram relatados pelo fabricante para o alginato.
4. Pesar 0,1 mg de ECM e suspendê-lo em 1 mL do alginato previamente preparado para obter uma concentração de ECM de 0,1 mg/mL.
5. Encapsular ilhotas pancreáticas humanas em alginato e alginato-ECM de acordo com um protocolo descrito anteriormente³¹. O procedimento é descrito resumidamente abaixo.
   1. Colete e misture suavemente 3.000 IEQ em 1 mL de alginato e 3.000 IEQ em 1 mL de alginato-ECM a uma concentração de ECM de 0,1 mg / mL previamente preparada na etapa 8.4.
   2. Bombeie as suspensões obtidas através de um dispositivo de encapsulamento microfluídico ajustado para 0,2 mL/min e vazão e pressão de ar de 2,0 Pa, respectivamente.
   3. Após a produção, coletar as microcápsulas em 100 mM de banho de CaCl₂ com 10 mM de HEPES. Deixe o alginato reticular por 10 min.
   4. Antes de serem cultivadas, lave as ilhotas encapsuladas com HBSS em condições padrão, por 2–3 min a 37 °C, com 5% de CO₂.
   5. Adicione os meios de cultura (consulte a Tabela de Materiais) e troque dois terços dos meios a cada dois dias até o final do experimento.
      NOTA: As etapas acima devem ser executadas tanto para as ilhotas em alginato quanto para as ilhotas em alginato-ECM.
6. No dia 8, pós-encapsulamento, realizar secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) e análise de DNA para avaliar a produção de insulina e a viabilidade das ilhotas, respectivamente.
7. Obter imagens de campo claro e coloração Viva / Morta de ilhotas livres e encapsuladas para avaliar a morfologia e viabilidade celular.
   NOTA: A avaliação qualitativa das imagens foi realizada para avaliar a saúde das ilhotas. Os parâmetros levados em consideração incluem forma, borda, integridade e diâmetro das ilhotas, bem como a presença de células únicas na cultura.

9. Liberação de insulina estimulada por glicose (GSIS) e medição de DNA

NOTA: No dia 8, pós-encapsulamento, ilhotas pancreáticas humanas foram coletadas e incubadas com tampão de Kreb, contendo concentrações de glicose baixas (2,8 mM) e altas (16,8 mM), seguidas de solução de despolarização de KCl (25 mM). O desafio glicêmico foi realizado com modificação de um protocolo descrito anteriormente³².

1. Insira a resina de filtração de gel em colunas de polipropileno.
2. Insira grupos de tratamento (ilhotas livres ou ilhotas encapsuladas) na porção intermediária da resina de filtração em gel dentro das colunas de polipropileno.
3. Pipetar glicose e soluções despolarizantes para as colunas de polipropileno descritas acima e incubar durante 1 h, pela seguinte ordem: realizar um período de pré-incubação com solução de glucose de baixa molaridade e, em seguida, proceder a uma série de incubações com solução de glucose baixa, alta, baixa e despolarizante, conforme mencionado na NOTA no início da secção 9.
4. Recolher o meio de cada fase de incubação e armazená-lo a -80 °C para análise posterior.
5. Após a incubação e coleta da solução despolarizante, incubar ilhotas pancreáticas humanas com 1 mL de tampão de extração de DNA e armazená-lo até análise posterior.
6. Meça o teor de insulina das incubações de glicose e solução despolarizante com um ensaio ELISA de insulina, seguindo o protocolo do fabricante.
7. Meça o conteúdo de DNA do tampão de extração coletado na etapa 9.5 usando um kit de ensaio de DNA seguindo o protocolo do fabricante.
8. Normalize as medições de insulina de acordo com o conteúdo de DNA.

10. Análise estatística

NOTA: As comparações de grupos referem-se ao mesmo lote de ilhotas humanas com n = 3 avaliações independentes realizadas para cada ensaio descrito neste manuscrito. Os valores são expressos como Média ± DP.

1. Utilizar um software estatístico para realizar o teste de Mann-Whitney para a avaliação da descelularização e análises de remanescentes de DNA, comparar o nativo, o pâncreas descelularizado e o ECM solubibilizado.
2. Realize um teste t não pareado para a avaliação dos glicosaminoglicanos e colágeno entre o nativo, o pâncreas descelularizado e a ECM solubilizada.
3. Realize uma ANOVA de 2 vias com comparações múltiplas post-hoc de Turkey para o Teste de Estimulação de Glicose na avaliação da estimulação das ilhotas no dia 8.
4. Considere a significância estatística em p < 0,05 com designação de *p < 0,05, **p<0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001.

Amostras pancreáticas nativas e acelulares foram processadas para coloração histológica com H&E, MT e AB. A coloração H&E mostrou ausência completa de material nuclear e células, confirmando o sucesso da descelularização. As colorações MT e AB mostraram o arcabouço da MEC, destacando qualitativamente os componentes colágeno e estromal, respectivamente (Figura 1).

Este método permitiu a geração consistente de um pó de ECM a partir do pâncreas humano. Os testes de quantificação de DNA confirmaram a depuração celular satisfatória³³. A MEC pancreática nativa, acelular e solubilizada foi caracterizada bioquimicamente para avaliar a composição biológica básica. A MEC pancreática foi determinada como acelular e livre de DNA (DNA < 50 ^ng.mg-1 de tecido seco), com preservação consistente de colágeno e glicosaminoglicanos, conforme relatado por outros^11,15. A análise de DNA demonstrou depuração do ácido desoxirribonucléico na MEC pancreática acelular e solubilizada (de 4,56 μg/mg ± 3,42 μg/mg para 30,05 ng/mg ± 22,89 ng/mg para o pâncreas acelular p = 0,0001; de 4,56 μg/mg ± 3,42 μg/mg para 22,81 ng/mg ± 11,31 ng/mg para a MEC pancreática solubilizada). (Figura 2).

O colágeno total foi quantificado no pâncreas nativo, na ECM pancreática acelular e na pancreática solubilizada. Os resultados mostraram um aumento estatisticamente significativo do colágeno no pâncreas acelular e na MEC pancreática solúvel em comparação com o tecido nativo (de 7,35 μg/mg ± 1,68 μg/mg para 27,74 μg/mg ± 2,35 μg/mg para o pâncreas acelular p < 0,0001; de 7,35 μg/mg ± 1,68 μg/mg para 26,08 μg/mg ± 3,63 μg/mg para a MEC pancreática solubilizada p < 0,001). Esse aumento no conteúdo de colágeno se deve ao isolamento e purificação da MEC dos componentes celulares, que representam um enriquecimento geral em colágeno e sGAG na MEC em comparação com o órgão nativo (Figura 2).

A quantificação de glicosaminoglicanos mostrou uma diminuição estatisticamente significativa do conteúdo de GAG no tecido acelular e na MEC pancreática solubilizada comparável ao nosso estudo anterior^11,15, com uma diminuição de 15,08 μg/mg ± 3,03 μg/mg para 4,87 μg/mg ± 1,20 μg/mg para o pâncreas acelular p < 0,001 e de 15,08 μg/mg ± 3,03 μg/mg para 3,45 μg/mg ± 0,20 μg/mg para a MEC pancreática solubilizada (p < 0,01) (Figura 2).

As ilhotas encapsuladas cultivadas em placas não tratadas com cultura de tecidos foram viáveis 8 dias após o encapsulamento. Tanto a coloração viva quanto a morta mostraram que as ilhotas cultivadas nas três diferentes condições eram viáveis; no entanto, houve um aumento da presença de células mortas quando não encapsuladas (Figura 3). As ilhotas encapsuladas mantiveram sua forma esférica com uma borda bem arredondada, um diâmetro estável e quase nenhuma célula única em cultura. No momento analisado, as ilhotas livres apresentaram tendência a agregar-se, a desenvolver irregularidades nas bordas e formas, e a exibir um núcleo mais escuro, sugestivo de um evento necrótico.

Verificou-se que as ilhotas livres e encapsuladas respondem à glicose no momento analisado (Figura 3). As ilhotas encapsuladas em ECM-alginato mostraram um aumento significativo na secreção de insulina após alta estimulação de glicose e despolarização de KCl em comparação com ilhotas encapsuladas livres e somente de alginato.

Figura 1: Imagens histológicas representativas de H&E, tricrômico de Masson e azul de Alcian. Pâncreas humano nativo (A, C, E) e ECM pancreática humana (B, D, F) descelularizados com o protocolo experimental recém-desenvolvido. O painel H&E demonstrou uma perda completa das estruturas nucleares em comparação com o tecido pancreático nativo. A coloração tricrômica de Masson destaca a estrutura da matriz extracelular e a coloração Alcian Blue destaca a estrutura do tecido conjuntivo da matriz extracelular. Barra de escala = 100 μm para painéis A,C,D,E,F; Barra de escala = 25 μm para o painel B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Caracterização bioquímica da ECM pancreática nativa, acelular e pancreática solubilizada. (A) Foi confirmada a remoção satisfatória do DNA no pâncreas acelular e na MEC pancreática solubilizada. (B, C) Quantificação de glicosaminoglicanos e colágeno realizada no pâncreas nativo em comparação com a ECM acelular e solubibilizada. A análise estatística foi realizada pelo teste t de pâncreas nativo versus descelularizado e ECM nativo versus solubilizado; = p < 0,0001; p < 0,001; **p < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Avaliação qualitativa da viabilidade das ilhotas humanas e avaliação quantitativa da secreção de insulina. (A) Imagens de campo claro e vivas/mortas de ilhotas humanas isoladas cultivadas como livres, em cápsulas de alginato e em cápsulas de alginato-ECM no dia 6 pós-encapsulamento. (B) Avaliação da estimulação da glicose de ilhotas isoladas humanas cultivadas em placa não tratada com cultura de tecidos em três ambientes diferentes: livre, em cápsulas de alginato e em cápsulas de alginato-ECM no dia 8 pós-encapsulamento. Os valores da secreção de insulina foram relatados após a normalização do DNA. Comparações estatísticas da secreção de insulina são feitas entre as três condições de cultura em glicose alta e após solução despolarizante de KCl, respectivamente; *p < 0,0 e ***p < 0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de descelularização mais suave e sem detergente para produzir ECM pancreática. Foi dada atenção à preservação dos componentes da ECM do parênquima pancreático e à prevenção de uma exposição prolongada do tecido a detergentes químicos iônicos ou não iônicos convencionais durante o processo de descelularização.

O aspecto mais inovador do método de descelularização desenvolvido é evitar detergentes químicos iônicos e não iônicos clássicos. Nossa experiência anterior com a produção de ECM pancreática humana 11,12,13,22,34,35 estabeleceu a linha de base para a produção de meios de suporte pancreáticos acelulares. No entanto, a infusão com centenas de litros de detergentes químicos através do ducto pancreático, da artéria mesentérica superior e da artéria esplênica^11,13 requer técnicas cirúrgicas específicas e nem sempre é viável na produção em larga escala. Mais importante ainda, descelularizar o tecido em um agitador orbital, em vez de infundir detergentes através da vasculatura, representa uma mudança de paradigma na metodologia, contribuindo enormemente para a facilidade técnica, consistência e viabilidade da descelularização, o que aumenta a produção de ECM para tradução. Além disso, os órgãos obtidos para fins de pesquisa são frequentemente danificados devido a inconsistências no processo de aquisição, às vezes atribuíveis à anatomia anormal que frustra a canulação. Portanto, nosso método permitiria que todos os órgãos fossem processados para descelularização. Inferimos que este método pode ser de interesse para a descelularização e a produção de ECM de vários órgãos e potencialmente para aplicações in vitro e in vivo.

O desenvolvimento do presente método de descelularização foi influenciado por nossa experiência anterior usando o Triton X-100 como principal detergente químico 11,13,36. A incapacidade de quantificar o Triton X-100 remanescente na ECM pós-descelularização e a falta de viabilidade em aumentar o processo de fabricação em um ambiente cGMP levaram nosso grupo a investigar a viabilidade de obter descelularização por agitação mecânica em vez de uma perfusão de todo o pâncreas. Nossa hipótese é que a utilização de uma solução hipotônica seria eficiente em precipitar danos osmóticos nas células residentes e expor o material nuclear celular para um tratamento enzimático subsequente, um processo que visa a depuração de resíduos de ácido desoxirribonucléico. Seguindo as abordagens iniciais para descelularizar o pâncreas humano agitando o tecido em cubos em detergentes químicos por 48 h, notamos que a água deionizada foi eficaz em fornecer o dano celular necessário para a etapa enzimática subsequente e remoções celulares. Em seguida, exploramos a opção de reduzir a fase livre de detergente em 24 h e confirmamos que o dano mecânico celular devido à solução hipotônica, água deionizada, foi consistentemente capaz de fornecer uma descelularização bem-sucedida, evitando o uso de potenciais agentes citotóxicos. Nossos dados sobre a quantificação de colágeno e glicosaminoglicanos mostraram tendências consistentes com nossas experiências anteriores e observações recentes de outros grupos de pesquisa sobre o pâncreas humano^11,15. Além disso, descobrimos que uma etapa de solubilização não reduziu a quantidade de componentes críticos do ECM, pois sua preservação é crítica para que os scaffolds do ECM exerçam a função 15,21,24,36. Os métodos de descelularização do pâncreas atualmente discutidos na literatura³⁷ são caracterizados pelo uso de detergentes iônicos ou não iônicos e a consequente perda da composição inata da MEC, permitindo inferir que um método mais suave, possivelmente sem detergente, preservaria melhor os componentes básicos da MEC pancreática.

O ECM é a estrutura 3D que fornece suporte estrutural e bioquímico às células em organismos multicelulares. As proteínas e estruturas da ECM desempenham papéis vitais na determinação, diferenciação, proliferação, sobrevivência, polaridade e migração das células⁶. A justificativa para incorporar a ECM pancreática em aplicações in vitro e in vivo é baseada na evidência de que: em ilhotas maduras, as interações com ECM ou outros materiais da matriz regulam a sobrevivência celular, proliferação e secreção de insulina e auxiliam na preservação e restauração da morfologia das ilhotas esféricas 3,21,22,38 ; ilhotas parcialmente digeridas que retêm algumas de suas conexões nativas de ECM exibem taxas de apoptose marcadamente reduzidas e funcionalidade GSIS significativamente maior em comparação com ilhotas altamente purificadas e livres de ECM 38,39,40; e a ECM melhora a função das ilhotas, impedindo a infiltração de leucócitos e regulando positivamente a expressão da integrina α3 e da quinase de adesão focal, uma característica crucial para a ligação e interação célula-ECM^beta 41,42,43.

A secreção de insulina estimulada por glicose após o encapsulamento de ilhotas humanas em microcápsulas de alginato mostra como a reconstituição de um ambiente tridimensional proporciona um ambiente mais saudável para ilhotas em comparação com uma cultura in vitro em placas tratadas sem cultura de tecidos. A encapsulação com alginato proporciona a manutenção da estrutura inicial das ilhotas, evitando a aglomeração celular e a dispersão de células únicas, constituindo assim a estrutura fisiológica das ilhotas humanas. É bem sabido que a função das ilhotas diminui gradualmente ao longo do tempo quando cultivadas in vitro em condições normais, e o alginato, um biomaterial inerte, não fornece sinalização bioquímica suficiente para a manutenção da função ideal das ilhotas. Nosso biomaterial ECM provou ter um impacto positivo in vitro na viabilidade e na funcionalidade das ilhotas quando encapsuladas com alginato em comparação com apenas alginato. Mais investigações são necessárias para provar se a adição desse biomaterial quando solubilizado pode servir como um passo para o aprimoramento de tecnologias baseadas em ilhotas para sistemas de cultivo in vitro e para potenciais aplicações in vivo ^44,45.

Algumas etapas críticas podem ser destacadas no protocolo de descelularização apresentado: (1) uma dissecção cirúrgica não ótima do pâncreas humano pode levar a uma presença excessiva de tecido adiposo, o que prejudicará drasticamente o processo de descelularização; (2) uma liofilização eficaz pode não ser alcançada quando o tecido adiposo excessivo está presente; (3) isso afetará inevitavelmente a etapa de criomoagem, que não será eficiente.

Várias limitações foram encontradas usando o protocolo apresentado: (1) variabilidade de órgão humano para humano antes e depois da descelularização foi observada; (2) também houve alguns resultados não ótimos de descelularização em órgãos derivados de doadores com história de abuso de álcool, pacientes com IMC > 30 e acúmulo excessivo de tecido adiposo peri e intrapancreático. Concluímos que o pâncreas humano de doadores com IMC < 30 foi geralmente considerado adequado para descelularização.

Os resultados deste estudo mostram que o pâncreas humano pode ser descelularizado com um processo à base de osmótico, sem detergente, para obtenção de scaffolds de MEC para aplicação em medicina de reposição de células beta e manipulação de ilhotas in vitro. O processo de fabricação apresenta uma abordagem viável e reprodutível para fins translacionais e a prevenção de detergentes químicos e o uso de um sistema baseado em perfusão representam soluções eficientes e econômicas para produzir um biomaterial baseado em ECM, que quando solubilizado pode ser usado em pesquisa e potencialmente em ambientes clínicos. Existe potencial para avaliar a eficácia desse biomaterial por meio da recapitulação de um nicho ideal para as ilhotas pancreáticas e para as células produtoras de insulina para melhorar a manutenção celular, a viabilidade e a diferenciação celular a longo prazo.

Não há interesses financeiros concorrentes a serem declarados por nenhum dos coautores.

Este projeto recebeu financiamento do Programa de Pesquisa e Inovação Horizonte 2020 da União Europeia sob o acordo de subvenção nº 646272. As ilhotas pancreáticas humanas foram obtidas dos Laboratórios Prodo, Aliso Viejo, CA 92656.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University