Décellularisation sans détergent du pancréas humain pour la production de matrice extracellulaire soluble (MEC)

Le protocole décrit dans ce manuscrit explique les étapes de fabrication d’une matrice extracellulaire soluble (MEC) à partir du pancréas humain. La poudre ECM solubilisée obtenue grâce à ce protocole peut être utilisée pour la récapitulation du microenvironnement des îlots pancréatiques in vitro et, potentiellement, in vivo.

La transplantation d’îlots (ITx) a le potentiel de devenir la norme de soins dans la médecine de remplacement des cellules bêta, mais ses résultats restent inférieurs à ceux obtenus avec la transplantation de pancréas entier. Les protocoles actuellement utilisés pour l’isolement des îlots de Langerhans humains font l’objet d’un examen minutieux car ils sont basés sur la digestion enzymatique de l’organe, c’est-à-dire que le pancréas est démoli, que ses connexions avec le corps sont perdues et que les îlots sont irréversiblement endommagés. L’atteinte des îlots est caractérisée par des facteurs critiques tels que la destruction de la matrice extracellulaire (MEC), qui représente le cadre 3D de la niche des îlots et dont la perte est incompatible avec l’euphysiologie des îlots. Les chercheurs proposent l’utilisation d’échafaudages basés sur la MEC dérivés du pancréas de mammifère pour résoudre ce problème et, en fin de compte, améliorer la viabilité, la fonction et la durée de vie des îlots. Les méthodes actuellement disponibles pour obtenir de tels échafaudages sont dures car elles sont en grande partie à base de détergent. Ainsi, nous proposons une nouvelle méthode sans détergent qui crée moins de dommages à l’ECM et peut préserver les composants critiques de l’ECM pancréatique. Les résultats montrent que le protocole de décellularisation nouvellement développé a permis d’obtenir une clairance complète de l’ADN tout en conservant les composants ECM. L’ECM obtenue a été testée pour la cytotoxicité et encapsulée avec des îlots pancréatiques humains qui ont montré un comportement cellulaire positif avec la sécrétion d’insuline lorsqu’elle était stimulée par un défi de glucose. Collectivement, nous proposons une nouvelle méthode de décellularisation du pancréas humain sans l’utilisation de détergents chimiques ioniques et non ioniques conventionnels. Ce protocole et l’ECM obtenu avec celui-ci pourraient être utilisés à la fois pour des applications in vitro et in vivo.

L’isolement des îlots pancréatiques est un processus méticuleux réalisé par la digestion enzymatique des connexions entre les îlots et leur structure de soutien extracellulaire environnante. Cette destruction de la matrice extracellulaire (MEC) est l’un des facteurs critiques pour caractériser les dommages des îlots de Langerhans survenant lors des processus d’isolement 1,2,3,4. La MEC péri-îlot est un composant acellulaire essentiel du pancréas endocrinien. Il est composé de protéines et de polysaccharides, qui interagissent et se réticulent pour former un réseau tridimensionnel qui soutient structurellement et biochimiquement l’homéostasie physiologique, et aide à la recréation de ce microenvironnement in vitro ^2,5,6. La perte des processus de signalisation fondamentaux entre les îlots et la MEC est reconnue comme l’un des facteurs contributifs, ce qui limite la survie des îlots in vitro et in vivo 2,7,8,9,10.

La MEC d’origine animale et humaine a été largement utilisée pour la récapitulation du microenvironnement des îlots pancréatiques 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Depuis que la capacité de l’ECM à améliorer l’attachement, la prolifération et le maintien à long terme des cellules d’îlots de Langerhans de rat a été signalée pour la première fois dans la ^réf.20, de nombreuses autres études ont fourni des preuves solides que la restauration de l’interaction native de l’ECM avec les îlots humains améliore la fonction des îlots de Langerhans^21,22. Par exemple, des données récentes ont montré que les îlots encapsulés avec ECM amélioraient considérablement le contrôle glycémique chez les souris diabétiques, améliorant et facilitant l’administration d’insuline dans une nouvelle plate-forme d’administration d’insuline basée sur les cellules²³. De plus, des études ont démontré que l’incorporation de composants critiques de la MEC pancréatique peut améliorer considérablement la fonction endocrinienne des cellules β 24,25,26,27.

Les protocoles de fabrication ECM présents dans la littérature sont basés sur l’application de détergents chimiques, par exemple le Triton X-100 ou le dodécylsulfate de sodium (SDS). Bien qu’ils offrent une excellente clairance de l’ADN, les produits chimiques utilisés dans les processus de décellularisation sont cytotoxiques, coûteux et les résidus sur le tissu décellularisé suscitent des inquiétudes en vue d’une application clinique potentielle.

Sur la base de ces observations, les objectifs de cette étude étaient triples : premièrement, développer une méthode de décellularisation du pancréas humain avec une utilisation minimale de détergents chimiques ioniques ou non ioniques ; Deuxièmement, produire un échafaudage ECM soluble pour la culture tissulaire ; Troisièmement, caractériser la MEC pancréatique afin d’évaluer sa cytotoxicité et son impact sur la fonction des cellules des îlots pancréatiques. La caractérisation est nécessaire pour toutes les applications basées sur la culture cellulaire, car elle démontre que la MEC pancréatique solubilisée pourrait être bénéfique pour récapituler le microenvironnement pancréatique pour les îlots isolés. La présente invention décrit une méthode de décellularisation efficace et sans détergent pour le pancréas humain, la caractérisation de la MEC et l’effet de la MEC sur la viabilité et la fonction des îlots pancréatiques humains isolés encapsulés.

Cette étude de recherche a été approuvée par le comité de recherche humaine du Wake Forest Baptist Medical Center. Les pancréas humains ont été obtenus de manière éthique à partir de donneurs d’organes par l’intermédiaire de Carolina Donor Services. Les donneurs d’organes ont été dépistés pour les maladies infectieuses pertinentes pour l’homme, conformément à la réglementation de l’ONUS. Les organes ont été reçus dans une solution de conservation stérile où ils ont été conservés jusqu’à leur utilisation. Lors de la livraison au laboratoire, tous les organes ont été inspectés et des échantillons du pancréas natif ont été prélevés à des fins histologiques. Les organes ont ensuite été congelés et conservés dans des conditions stériles à -20 °C jusqu’à une nouvelle utilisation.

1. Préparation chirurgicale du pancréas humain

REMARQUE : Les pancréas congelés ont été décongelés pendant la nuit à 4 °C.

1. Avant de commencer la dissection chirurgicale du pancréas humain, préparer 1 L de solution de lavage, composée de 950 mL d’eau désionisée (dH₂O), 50 mL de réactif à base d’iode et une solution Pen/Strep à 1 %.
2. Portez des gants stériles et une blouse de laboratoire pendant la dissection chirurgicale. Effectuez toutes les interventions chirurgicales sous un capot de culture cellulaire pour éviter une éventuelle contamination.
3. Transférez le pancréas du sac de transport stérile dans le bassin placentaire stérile. Assurez-vous que le pancréas est orienté avec la tête de l’organe à gauche et la queue à droite.
4. Disséquez soigneusement le duodénum de la tête du pancréas à l’aide de ciseaux stériles et de pinces non dentées. Veillez à ne pas faire de trou dans le duodénum, car cela augmente les risques de contamination.
   REMARQUE : Si un trou est fait dans le tractus gastro-intestinal, clampez rapidement le trou et procédez à la dissection.
5. Une fois la dissection de la tête du pancréas terminée, jetez le duodénum dans un sac à risque biologique approprié et suivez les directives de l’établissement pour son élimination.
6. Disséquez et jetez tout le tissu extrapancréatique restant autour de la tête du pancréas, y compris les principaux vaisseaux sanguins et le canal cholédoque, qui sont généralement marqués au moment de l’approvisionnement des organes avec des sutures non résorbables. Jetez le mouchoir en suivant les directives de l’établissement.
7. Disséquez et jetez tout le tissu adipeux extrapancréatique et péripancréatique entourant la queue du pancréas, exposant les vaisseaux sanguins spléniques.
8. Une fois que le pédicule vasculaire de la rate est exposé, retirez la rate et disséquez les vaisseaux sanguins spléniques dans leur intégralité, y compris ceux attachés à la surface postérieure du pancréas (l’artère et la veine spléniques). Éliminez la rate et retirez les tissus conformément aux directives de l’établissement.
9. Disséquez et éliminez de manière appropriée toute graisse extra-pancréatique clairement visible, en particulier la graisse péripancréatique.
   REMARQUE : Au niveau de la queue du pancréas, le rétropéritoine peut être visible. Celui-ci doit être soulevé à l’aide d’une pince non dentée, retiré en conséquence avec une pince chirurgicale et éliminé correctement. Le pancréas doit maintenant être exempt de tout tissu extra-pancréatique.
10. Disséquez le pancréas pour obtenir des cubes de tissu pancréatique de 1 cm³ à l’aide de ciseaux chirurgicaux, de lames histologiques stérilisées ou de scalpels chirurgicaux. Les cubes de tissu pancréatique obtenus après cette dissection subiront le processus de décellularisation. Le nombre moyen de cubes pancréatiques qui subissent une décellularisation dépend des caractéristiques intrinsèques de l’organe. En moyenne, entre 40 et 60 cubes pancréatiques ont subi une décellularisation dans l’étude présentée.
11. Passez à l’étape 2.1

2. Décellularisation du tissu pancréatique

REMARQUE : Ce protocole a été utilisé avec un pancréas d’un poids moyen de 100 g ; Par conséquent, il n’est pas recommandé de dépasser ce poids lors de l’utilisation de cette technique de décellularisation.

1. Placez tout le tissu pancréatique préalablement disséqué à l’étape 1.10 dans un récipient en plastique stérile (voir Tableau des matériaux) avec la solution de lavage et incubez pendant 15 min à température ambiante (RT).
2. Retirez le tissu pancréatique à l’aide d’une pince stérile et placez-le dans un nouveau récipient stérile contenant de l’eau déminéralisée stérile et sans endotoxines. Fermez fermement le bouchon du récipient et placez-le sur un agitateur orbital réfrigéré avec une température de consigne de 4 °C et une vitesse d’agitation comprise entre 180 et 200 tr/min pendant 24 h.
3. Retirez le récipient avec le tissu pancréatique et nettoyez l’extérieur de manière appropriée avant de le placer dans la hotte pour continuer le processus.
4. Retirez le tissu pancréatique à l’aide d’une pince chirurgicale et placez-le dans un nouveau récipient stérile, avec 1 L d’eau désionisée, 50 mg de DNase I et 0,0025 % de chlorure de magnésium. Fermez fermement le bouchon du récipient et placez-le dans un agitateur orbital, avec une température préréglée de 37 °C et une vitesse d’agitation de 100 tr/min pendant 6 h.
5. Préparer la solution EDTA-Trizma
   1. Rassemblez un nouveau récipient stérile de 1 L et nettoyez-le correctement avant de l’introduire dans la hotte. Pour préparer 1 L de solution d’EDTA-Trizma, ajoutez ce qui suit : 985 mL d’eau désionisée stérile, 7,5 mL de tampon Tris-HCl et 7,5 mL de solution d’EDTA. Conservez-le à 4 °C jusqu’à utilisation.
6. Retirez le récipient renfermant le tissu pancréatique et nettoyez l’extérieur de manière appropriée avant de l’introduire dans la hotte pour la poursuite du processus.
7. Retirez le tissu pancréatique à l’aide d’une pince chirurgicale et placez-le dans un nouveau récipient stérile avec 1 L de solution à base d’EDTA-Trizma. Fermez fermement le bouchon du récipient et placez-le dans un agitateur orbital, avec une température préréglée de 4 °C et une vitesse d’agitation comprise entre 180 et 200 tr/min pendant 18 h.
8. Retirez le récipient contenant le tissu pancréatique et nettoyez l’extérieur de manière appropriée avant de l’introduire dans la hotte pour le processus.
9. Retirez le tissu pancréatique à l’aide d’une pince stérile et placez-le dans un nouveau récipient stérile avec de l’eau déminéralisée stérile sans endotoxines. Fermez fermement le bouchon du récipient et placez-le sur un agitateur orbital réfrigéré, avec une température de consigne de 4 °C et une vitesse d’agitation comprise entre 180 et 200 tr/min pendant 24 h.
   REMARQUE : Au cours de cette période de traitement, il y aura un changement notable de couleur, dans lequel le tissu apparaîtra plus brillant.
10. Prélever le tissu pancréatique et le stocker dans des tubes de centrifugation stériles de 50 ml, jusqu’à un maximum de 25 ml par tube pour la congélation et la lyophilisation ultérieures. Le nombre de tubes de centrifugation varie en fonction de la taille du pancréas. Conservez les échantillons à -80 °C.

3. Production de poudre ECM pancréatique – lyophilisation et cryo-broyage

1. Après un minimum de 24 à 40 h de stockage du matériau décellularisé à -80 °C, transférez l’ECM pancréatique dans un lyophilisateur.
2. Transférez le matériau congelé dans un lyophilisateur, en empêchant le matériau de dégeler.
   REMARQUE : L’étape de lyophilisation prend environ 3 à 5 jours en fonction de plusieurs facteurs, tels que la quantité de matériau dans chaque tube soumis au processus et la surface exposée pour la lyophilisation. Il est recommandé que le tissu décellularisé ne dépasse pas le niveau de 25 mL dans chaque tube et que les tubes soient congelés à un angle de 45°, ce qui permet d’exposer facilement une plus grande surface une fois que la lyophilisation commence. Retirez les couvercles des tubes.
3. Après lyophilisation, transférez les matériaux dans une hotte de culture cellulaire.
4. Coupez chaque morceau de l’ECM séché en deux fois sa taille à l’aide de ciseaux stériles. Ces pièces ECM séchées seront soumises à un processus de broyage automatisé pour produire une poudre ECM. Utilisez un processeur automatique cryo-broyé pour éviter une augmentation de la température et la dénaturation ultérieure des propriétés biologiques de l’ECM. Assurez-vous d’ajuster le réglage de la machine de cryo-broyage pour obtenir une poudre fine après le processus de broyage.
   REMARQUE : Dans cette étude, le pancréas de donneurs ayant un IMC < 30 a été utilisé. Le pancréas de donneurs ayant un IMC > 30 a montré une tendance à contenir plus de graisse intraparenchymateuse. Le processus de lyophilisation n’est pas considéré comme optimal et peut être inhibé par la teneur en matières grasses. Si, après lyophilisation, le tissu est visiblement oléagineux, il doit être jeté car il ne sera pas optimal pour la fabrication de la poudre ECM.

4. Solubilisation de l’ECM pancréatique

REMARQUE : À ce stade, à partir d’un pancréas de taille moyenne (100 g), le rendement de la poudre pancréatique décellularisée est de 1 à 2 g.

1. Pesez 1 g de poudre ECM à l’aide d’une spatule en plastique stérile.
2. Réaliser la solubilisation en suivant les protocoles décrits précédemment : solubiliser 1 g de MEC dans 100 mL de HCl 0,01 M et 100 mg de pepsine pendant 48 h à RT avec agitation constante²⁸.
3. Après 48 h, utilisez du NaOH pour neutraliser le pH (pH = 7) de l’ECM acide tout en gardant le bécher contenant l’ECM acide sur de la glace pour éviter la gélification.
   REMARQUE : La cinétique de gélification varie en fonction de la température, de la teneur en collagène, du pH et de la solution neutralisante. Dans cette étude, 0,01 M de NaOH a été utilisé. Le volume de NaOH ajouté pour la neutralisation du pH était d’environ 100 ml. Envisagez de mesurer le pH plusieurs fois tout en neutralisant la solution acide de MEC.
4. Transférez la solution neutre de MEC dans des tubes à centrifuger stériles de 50 ml. Fermez les tubes et placez-les dans une centrifugeuse. Centrifuger les tubes contenant l’ECM solubilisé à vitesse maximale (12 000 x g) pendant 15 min à 4 °C. Après la centrifugation, transférez les tubes dans une hotte de culture cellulaire.
   REMARQUE : Après la centrifugation de l’échantillon, le composant insoluble de l’ECM sera déposé au fond du tube, tandis que la solution solubilisée de l’ECM se trouvera en haut dans le surnageant.
5. À l’aide de techniques stériles, prélever le surnageant du tube contenant la solution de MEC solubilisée et le transférer dans des tubes frais de 50 mL, jusqu’à un maximum de 25 mL par tube.
6. Stockez les tubes de solution ECM à -80 °C.

5. Production de poudre ECM pancréatique – lyophilisation et stockage

1. Après au moins 24 à 40 h de stockage de la solution soluble d’ECM à -80 °C, transférez les tubes dans un lyophilisateur.
2. Transférez le matériau congelé dans un lyophilisateur, en veillant à ce qu’il ne décongèle pas.
   REMARQUE : L’étape de lyophilisation prend environ 3 à 5 jours en fonction de plusieurs facteurs, tels que la quantité de matériau dans chaque tube soumis au processus et la surface exposée pour la lyophilisation. Il est recommandé que la solution ECM solubilisée ne dépasse pas le niveau de 25 mL dans chaque tube et que les tubes soient congelés à un angle de 45° pour permettre d’exposer facilement une plus grande surface une fois que la lyophilisation commence. Retirez les couvercles du tube de faucon avant la lyophilisation.
3. Après lyophilisation de la solution ECM solubilisée, transférez le matériau dans un capot de culture cellulaire. Après lyophilisation complète, une fine poudre ECM sera visible.
   REMARQUE : Le rendement obtenu est de 700 mg à partir de 1 g de tissu décellularisé.
4. Conservez la poudre ECM solubilisée ou utilisez-la à des fins de culture cellulaire.
   REMARQUE : Il est conseillé de stocker l’ECM à 4 °C pour une utilisation immédiate, à -20 °C pour une utilisation ultérieure et à -80 °C pour un stockage à long terme.

6. Caractérisation de la MEC pancréatique avec coloration histologique

1. Prélever un morceau de pancréas natif peu de temps après l’administration de l’organe et avant la décellularisation. Fixez-le pendant 24 heures dans du formol à 10 %. Lavez les échantillons dans de l’eau déminéralisée. Déshydratez-le dans de l’alcool gradué avant de l’enrober dans de la paraffine et coupez-le en sections de 5 mm.
2. À la fin du processus de décellularisation, prélevez un échantillon de la matière décellularisée et fixez-le pendant 24 h dans du formol à 10 %. Lavez l’échantillon dans de l’eau déminéralisée. Déshydratez-le dans de l’alcool gradué avant de l’enrober dans de la paraffine et coupez-le en sections de 5 mm.
3. Pour vérifier une décellularisation réussie, effectuez une coloration H&E et DAPI sur le pancréas natif et l’homologue décellularisé.
4. Pour la caractérisation histologique, effectuez les colorations Trichrome (MT) et Bleu Alcian (AB) de Masson, qui mettront en évidence les structures collagène et GAGs, respectivement.

7. Caractérisation de la poudre ECM soluble

1. Effectuez une analyse de la teneur en ADN et du collagène total du tissu pancréatique natif et de la poudre ECM soluble comme décrit précédemment²⁹.
2. Quantifier les glycosaminoglycanes sulfatés (sGAG) sur la base du protocole fourni par un kit disponible dans le commerce (voir la table des matériaux). À l’aide d’un spectrophotomètre de microplaques, vous pouvez mesurer la teneur en sGAG sulfatée dans la MEC pancréatique à une longueur d’onde de 595 nm³⁰.
   REMARQUE : Déclarer la teneur en ADN en ng/mg de tissu sec et la teneur en collagène et en GAG en μg/mg de tissu sec.

8. L’encapsulation des îlots humains avec l’ECM et la culture

REMARQUE : Les îlots pancréatiques humains ont été obtenus commercialement (voir le tableau des matériaux).

1. À l’arrivée, cultiver les îlots pancréatiques humains dans des plaques non traitées pour la culture tissulaire pendant 24 h dans des conditions standard avec une densité approximative de 2 000 IEQ dans chaque plaque de 10 cm.
2. Manipuler les îlots humains pour tester l’effet de la MEC sur la fonctionnalité et la viabilité des îlots avec les groupes expérimentaux suivants : îlots libres, îlots encapsulés dans de l’alginate et îlots encapsulés dans de l’alginate-ECM.
   REMARQUE : Les groupes d’îlots mentionnés ci-dessus ont été cultivés in vitro dans des conditions standard pendant une période pouvant aller jusqu’à 8 jours afin d’évaluer l’effet de la MEC sur la fonctionnalité et la viabilité des îlots.
3. Peser l’alginate sur une balance et le suspendre avec HBSS dans un tube de centrifugation afin d’obtenir un rapport de 1,5 % (p/v). Placez le tube de centrifugation sur un rotateur pendant une nuit à 4 °C.
   REMARQUE : Une masse moléculaire comprise entre 75 et 200 kDA et un rapport G/M de ≤ 1 ont été signalés par le fabricant pour l’alginate.
4. Peser 0,1 mg de MEC et le suspendre dans 1 mL de l’alginate préalablement préparé afin d’avoir une concentration de MEC de 0,1 mg/mL.
5. Encapsuler des îlots pancréatiques humains dans de l’alginate et de l’alginate-ECM selon un protocole³¹ précédemment décrit. La procédure est décrite brièvement ci-dessous.
   1. Prélever délicatement et mélanger 3 000 IEQ dans 1 mL d’alginate et 3 000 IEQ dans 1 mL d’alginate-ECM à une concentration ECM de 0,1 mg/mL préalablement préparée à l’étape 8.4.
   2. Pompez les suspensions obtenues à l’aide d’un dispositif d’encapsulation microfluidique réglé à 0,2 mL/min et à un débit et une pression d’air de 2,0 Pa, respectivement.
   3. Lors de la production, recueillir les microcapsules dans 100 mM de bain de CaCl₂ avec 10 mM de HEPES. Laisser l’alginate se réticuler pendant 10 min.
   4. Avant d’être cultivés, laver les îlots encapsulés avec du HBSS dans des conditions standard, pendant 2 à 3 min à 37 °C, avec 5 % de CO₂.
   5. Ajouter le milieu de culture (voir la table des matières) et changer les deux tiers du milieu tous les deux jours jusqu’à la fin de l’expérience.
      REMARQUE : Les étapes ci-dessus doivent être effectuées à la fois pour les îlots en alginate et les îlots en alginate-ECM.
6. Le jour 8, après l’encapsulation, effectuez une analyse de la sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) et de l’ADN pour évaluer la production d’insuline et la viabilité des îlots, respectivement.
7. Obtenez des images en fond clair et des colorations vivantes/mortes d’îlots libres et encapsulés pour évaluer la morphologie et la viabilité cellulaires.
   REMARQUE : Une évaluation qualitative des images a été effectuée afin d’évaluer la santé des îlots. Les paramètres pris en compte comprennent la forme, la bordure, l’intégrité et le diamètre des îlots, ainsi que la présence de cellules uniques en culture.

9. Libération d’insuline stimulée par le glucose (GSIS) et mesure de l’ADN

REMARQUE : Le 8e jour, après l’encapsulation, des îlots pancréatiques humains ont été prélevés et incubés avec un tampon de Kreb, contenant des concentrations de glucose faibles (2,8 mM) et élevées (16,8 mM), suivi d’une solution de dépolarisation du KCl (25 mM). Le test de provocation glycémique a été réalisé avec modification d’un protocole précédemment décrit³².

1. Insérer la résine de filtration en gel dans les colonnes en polypropylène.
2. Insérez des groupes de traitement (îlots libres ou îlots encapsulés) dans la partie centrale de la résine de filtration en gel à l’intérieur des colonnes en polypropylène.
3. Pipeter le glucose et les solutions dépolarisantes dans les colonnes de polypropylène décrites ci-dessus et incuber pendant 1 h, dans l’ordre suivant : effectuer une période de pré-incubation avec une solution de glucose à faible molarité, puis procéder à une série d’incubations avec une solution de glucose faible, élevée, faible et dépolarisante, comme mentionné dans le REMARQUE au début de la section 9.
4. Prélever le milieu de chaque phase d’incubation et le stocker à -80 °C pour une analyse ultérieure.
5. Après l’incubation et la collecte de la solution dépolarisante, incuber des îlots pancréatiques humains avec 1 mL de tampon d’extraction d’ADN et le conserver jusqu’à une analyse plus approfondie.
6. Mesurez la teneur en insuline des incubations de glucose et de la solution dépolarisante à l’aide d’un test ELISA d’insuline, en suivant le protocole du fabricant.
7. Mesurez la teneur en ADN du tampon d’extraction collecté à l’étape 9.5 à l’aide d’un kit de dosage de l’ADN en suivant le protocole du fabricant.
8. Normalisez les mesures d’insuline en fonction du contenu en ADN.

10. Analyse statistique

REMARQUE : Les comparaisons de groupes se réfèrent au même lot d’îlots humains avec n = 3 évaluations indépendantes effectuées pour chaque essai décrit dans ce manuscrit. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± en écart-type.

1. Utilisez un logiciel statistique pour effectuer le test de Mann-Whitney pour l’évaluation de la décellularisation et les analyses des restes d’ADN, comparez le pancréas natif, le pancréas décellularisé et l’ECM solubilisé.
2. Effectuez un test t non apparié pour l’évaluation des glycosaminoglycanes et du collagène entre le pancréas natif, le pancréas décellularisé et l’ECM solubilisé.
3. Effectuer une ANOVA à 2 voies avec les comparaisons multiples post-hoc de la Turquie pour le test de stimulation du glucose dans l’évaluation de la stimulation des îlots de Langerhans le jour 8.
4. Considérons la signification statistique à p < 0,05 avec la désignation de *p < 0,05, **p<0,01, ***p < 0,001 et ****p < 0,0001.

Des échantillons pancréatiques natifs et acellulaires ont été traités pour la coloration histologique avec H&E, MT et AB. La coloration H&E a montré une absence totale de matière nucléaire et de cellules, confirmant une décellularisation réussie. Les colorations MT et AB ont montré le cadre de l’ECM, mettant en évidence qualitativement les composants collagènes et stromaux, respectivement (Figure 1).

Cette méthode a permis de générer de manière cohérente une poudre ECM à partir du pancréas humain. Les tests de quantification de l’ADN ont confirmé une clairance cellulaire satisfaisante³³. Les MEC pancréatiques natives, acellulaires et solubilisées ont été caractérisées biochimiquement afin d’évaluer la composition biologique de base. Il a été déterminé que la MEC pancréatique était acellulaire et exempte d’ADN (ADN < 50 ^ng.mg-1 de tissu sec), avec une préservation constante du collagène et des glycosaminoglycanes comme rapporté par d’autres ^11,15. L’analyse de l’ADN a démontré la clairance de l’acide désoxyribonucléique dans la MEC pancréatique acellulaire et solubilisée (de 4,56 μg/mg ± 3,42 μg/mg à 30,05 ng/mg ± 22,89 ng/mg pour le pancréas acellulaire p = 0,0001 ; de 4,56 μg/mg ± 3,42 μg/mg à 22,81 ng/mg ± 11,31 ng/mg pour la MEC pancréatique solubilisée). (Figure 2).

Le collagène total a été quantifié dans le pancréas natif, dans la MEC pancréatique acellulaire et dans la MEC pancréatique solubilisée. Les résultats ont montré une augmentation statistiquement significative du collagène dans le pancréas acellulaire et dans la MEC pancréatique soluble par rapport au tissu natif (de 7,35 μg/mg ± 1,68 μg/mg à 27,74 μg/mg ± 2,35 μg/mg pour le pancréas acellulaire p < 0,0001 ; de 7,35 μg/mg ± 1,68 μg/mg à 26,08 μg/mg ± 3,63 μg/mg pour la MEC pancréatique solubilisée p < 0,001). Cette augmentation de la teneur en collagène est due à l’isolement et à la purification de l’ECM des composants cellulaires, ce qui représente un enrichissement global en collagène et en sGAG dans l’ECM par rapport à l’organe natif (Figure 2).

La quantification des glycosaminoglycanes a montré une diminution statistiquement significative de la teneur en GAG dans le tissu acellulaire et la MEC pancréatique solubilisée comparable à notre étude précédente^11,15, avec une diminution de 15,08 μg/mg ± 3,03 μg/mg à 4,87 μg/mg ± 1,20 μg/mg pour le pancréas acellulaire p < 0,001 et de 15,08 μg/mg ± 3,03 μg/mg à 3,45 μg/mg ± 0,20 μg/mg pour la MEC pancréatique solubilisée (p < 0,01) (Figure 2).

Les îlots encapsulés cultivés dans des plaques non traitées pour la culture tissulaire étaient viables 8 jours après l’encapsulation. Les taches vivantes et mortes ont montré que les îlots cultivés dans les trois conditions différentes étaient viables ; cependant, il y avait une présence accrue de cellules mortes lorsqu’elles n’étaient pas encapsulées (Figure 3). Les îlots encapsulés ont conservé leur forme sphérique avec une bordure bien arrondie, un diamètre stable et presque aucune cellule unique en culture. Au point temporel analysé, les îlots libres ont montré une tendance à s’agréger, à développer des irrégularités aux frontières et aux formes, et à présenter un noyau plus foncé, suggérant un événement nécrotique.

Les îlots libres et encapsulés se sont révélés sensibles au glucose au moment analysé (figure 3). Les îlots encapsulés dans l’ECM-alginate ont montré une augmentation significative de la sécrétion d’insuline après une stimulation élevée du glucose et une dépolarisation du KCl par rapport aux îlots encapsulés libres et à l’alginate seul.

Figure 1 : Images histologiques représentatives H&E, Trichrome de Masson et Bleu Alcien. Le pancréas humain natif (A, C, E) et l’ECM pancréatique humain (B, D, F) se sont décellularisés avec le protocole expérimental nouvellement développé. Le panel H&E a démontré une perte complète des structures nucléaires par rapport au tissu pancréatique natif. La coloration trichrome de Masson met en évidence la structure de la matrice extracellulaire et la coloration au bleu d’Alcian met en évidence la structure du tissu conjonctif de la matrice extracellulaire. Barre d’échelle = 100 μm pour les panneaux A, C, D, E, F ; Barre d’échelle = 25 μm pour le panneau B. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2 : Caractérisation biochimique de la MEC pancréatique native, acellulaire et solubilisée. (A) L’élimination satisfaisante de l’ADN dans le pancréas acellulaire et dans la MEC pancréatique solubilisée a été confirmée. (B, C) Quantification des glycosaminoglycanes et du collagène effectuée dans le pancréas natif par rapport à la MEC acellulaire et solubilisée. L’analyse statistique a été effectuée par le test t du pancréas natif par rapport au pancréas décellularisé et par la MEC native par rapport à la MEC solubilisée ; = p < 0,0001 ; p < 0,001 ; **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Évaluation qualitative de la viabilité des îlots humains et évaluation quantitative de la sécrétion d’insuline. (A) Images en fond clair et en direct/mort d’îlots humains isolés cultivés comme libres, dans des capsules d’alginate et dans des capsules d’alginate-ECM au jour 6 après l’encapsulation. (B) Évaluation de la stimulation du glucose d’îlots humains isolés cultivés sur une plaque traitée sans culture tissulaire dans trois contextes différents : libre, dans des gélules d’alginate et dans des gélules d’alginate-ECM au jour 8 après l’encapsulation. Les valeurs de la sécrétion d’insuline ont été rapportées après la normalisation de l’ADN. Des comparaisons statistiques de la sécrétion d’insuline sont effectuées entre les trois conditions de culture dans une solution dépolarisante à forte teneur en glucose et après KCl, respectivement ; *p < 0,0 et ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’objectif de ce travail était de développer un protocole de décellularisation plus doux et sans détergent pour produire une MEC pancréatique. Une attention particulière a été accordée à la préservation des composants ECM du parenchyme pancréatique et à l’évitement d’une exposition prolongée des tissus à des détergents chimiques ioniques ou non ioniques conventionnels pendant le processus de décellularisation.

L’aspect le plus innovant de la méthode de décellularisation développée est l’évitement des détergents chimiques ioniques et non ioniques classiques. Notre expérience antérieure avec la production de ECM pancréatique humain 11,12,13,22,34,35 a établi la référence pour la production de milieux de soutien pancréatique acellulaires. Néanmoins, l’infusion de centaines de litres de détergents chimiques à travers le canal pancréatique, l’artère mésentérique supérieure et l’artère splénique^11,13, nécessite des techniques chirurgicales spécifiques et n’est pas toujours réalisable en production à grande échelle. Plus important encore, la décellularisation du tissu dans un agitateur orbitaire plutôt que d’infuser des détergents à travers le système vasculaire représente un changement de paradigme dans la méthodologie, contribuant énormément à la facilité technique, à la cohérence et à la faisabilité de la décellularisation, ce qui améliore la production d’ECM pour la traduction. De plus, les organes obtenus à des fins de recherche sont souvent endommagés en raison d’incohérences dans le processus d’approvisionnement, parfois attribuables à une anatomie anormale qui empêche la canulation. Par conséquent, notre méthode permettrait à tous les organes d’être traités pour la décellularisation. Nous en déduisons que cette méthode pourrait être intéressante pour la décellularisation et la production d’ECM à partir de divers organes et potentiellement pour des applications in vitro et in vivo.

Le développement de la méthode de décellularisation actuelle a été influencé par notre expérience antérieure d’utilisation du Triton X-100 comme principal détergent chimique 11,13,36. L’incapacité de quantifier le Triton X-100 restant sur la post-décellularisation ECM et le manque de faisabilité de l’expansion du processus de fabrication dans un environnement cGMP ont conduit notre groupe à étudier la faisabilité d’obtenir une décellularisation par secousse mécanique plutôt qu’une perfusion de l’ensemble du pancréas. Nous avons émis l’hypothèse que l’utilisation d’une solution hypotonique serait efficace pour précipiter les dommages osmotiques dans les cellules résidentes et exposer le matériel nucléaire cellulaire pour un traitement enzymatique ultérieur, un processus visant à éliminer les résidus d’acide désoxyribonucléique. Après des approches initiales pour décellulariser le pancréas humain en secouant des tissus coupés en dés dans des détergents chimiques pendant 48 h, nous avons remarqué que l’eau désionisée était efficace pour fournir les dommages cellulaires nécessaires à l’étape enzymatique ultérieure et aux éliminations cellulaires. Nous avons ensuite exploré l’option de réduire la phase sans détergent à 24 h et avons confirmé que les dommages mécaniques cellulaires dus à la solution hypotonique, l’eau déminéralisée, étaient constamment capables de fournir une décellularisation réussie tout en évitant l’utilisation d’agents cytotoxiques potentiels. Nos données sur la quantification du collagène et des glycosaminoglycanes ont montré des tendances cohérentes avec nos expériences précédentes et les observations récentes d’autres groupes de recherche sur le pancréas humain^11,15. De plus, nous avons constaté qu’une étape de solubilisation ne réduisait pas la quantité de composants critiques de l’ECM, car leur préservation est critique pour que les échafaudages ECM exercent la fonction 15,21,24,36. Les méthodes de décellularisation du pancréas actuellement discutées dans la littérature³⁷ sont caractérisées par l’utilisation de détergents ioniques ou non ioniques et la perte conséquente de la composition innée de la MEC, ce qui nous permet de déduire qu’une méthode plus douce, éventuellement sans détergent, préserverait mieux les composants de base de la MEC pancréatique.

L’ECM est le cadre 3D qui fournit un soutien structurel et biochimique aux cellules des organismes multicellulaires. Les protéines et les structures ECM jouent un rôle essentiel dans la détermination, la différenciation, la prolifération, la survie, la polarité et la migration des cellules⁶. La raison d’être de l’incorporation de la MEC pancréatique dans les applications in vitro et in vivo est basée sur les preuves que : dans les îlots matures, les interactions avec la MEC ou d’autres matériaux matriciels régulent la survie cellulaire, la prolifération et la sécrétion d’insuline, et aident à la préservation et à la restauration de la morphologie des îlots sphériques 3,21,22,38 ; les îlots partiellement digérés qui conservent certaines de leurs connexions ECM natives présentent des taux d’apoptose nettement réduits et une fonctionnalité GSIS significativement plus élevée par rapport aux îlots hautement purifiés et sans ECM 38,39,40 ; et la MEC améliore la fonction des îlots en empêchant l’infiltration des leucocytes et en régulant à la hausse l’expression de l’intégrine α3 et de la kinase d’adhésion focale, une caractéristique cruciale pour l’attachement et l’interaction entre les cellules bêta et la MEC 41,42,43.

La sécrétion d’insuline stimulée par le glucose suite à l’encapsulation d’îlots humains dans des microcapsules d’alginate montre comment la reconstitution d’un environnement tridimensionnel fournit un environnement plus sain pour les îlots par rapport à une culture in vitro sur des plaques non traitées par culture tissulaire. L’encapsulation avec de l’alginate permet de maintenir la structure initiale des îlots, évitant l’agglutination cellulaire et la dispersion des cellules individuelles, constituant ainsi la structure physiologique des îlots humains. Il est bien connu que la fonction des îlots décline progressivement au fil du temps lorsqu’ils sont cultivés in vitro dans des conditions normales, et que l’alginate, un biomatériau inerte, ne fournit pas une signalisation biochimique suffisante pour le maintien d’une fonction optimale des îlots. Notre biomatériau ECM s’est avéré avoir un impact positif in vitro sur la viabilité et la fonctionnalité des îlots lorsqu’il est encapsulé avec de l’alginate par rapport à l’alginate seul. Des recherches plus approfondies sont nécessaires pour prouver si l’ajout de ce biomatériau une fois solubilisé pourrait constituer une étape vers l’amélioration des technologies basées sur les îlots pour les systèmes de culture in vitro et pour des applications in vivo potentielles^44,45.

Certaines étapes critiques peuvent être mises en évidence dans le protocole de décellularisation présenté : (1) une dissection chirurgicale non optimale du pancréas humain peut entraîner une présence excessive de tissu adipeux, ce qui altérera considérablement le processus de décellularisation ; (2) une lyophilisation efficace peut ne pas être obtenue en présence d’un excès de tissu adipeux ; (3) Cela affectera inévitablement l’étape de cryo-broyage, qui sera inefficace.

Plusieurs limites ont été constatées à l’aide du protocole présenté : (1) la variabilité des organes d’homme à homme avant et après la décellularisation a été observée ; (2) il y avait également des résultats non optimaux de décellularisation dans des organes provenant de donneurs ayant des antécédents d’abus d’alcool, de patients ayant un IMC > 30 et une accumulation excessive de tissu adipeux péri- et intra-pancréatique. Nous avons conclu que le pancréas humain provenant de donneurs ayant un IMC < 30 était généralement considéré comme approprié pour la décellularisation.

Les résultats de cette étude montrent que le pancréas humain peut être décellularisé à l’aide d’un procédé osmotique et sans détergent, afin d’obtenir des échafaudages ECM destinés à être utilisés en médecine de remplacement des cellules bêta et en manipulation des îlots de Langerhans in vitro. Le processus de fabrication présente une approche réalisable et reproductible à des fins translationnelles et l’évitement des détergents chimiques et l’utilisation d’un système basé sur la perfusion représentent des solutions efficaces et rentables pour produire un biomatériau à base d’ECM, qui, une fois solubilisé, pourrait être utilisé dans la recherche et potentiellement dans des contextes cliniques. Il est possible d’évaluer l’efficacité de ce biomatériau en récapitulant une niche optimale pour les îlots pancréatiques et pour les cellules productrices d’insuline afin d’améliorer le maintien cellulaire à long terme, la viabilité et la différenciation cellulaire.

Il n’y a aucun intérêt financier concurrent à déclarer par l’un des coauteurs.

Ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 646272. Les îlots pancréatiques humains ont été obtenus auprès de Prodo Laboratories, Aliso Viejo, CA 92656.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University