Dezellularisierung der humanen Bauchspeicheldrüse ohne Detergenzienz zur Herstellung löslicher extrazellulärer Matrix (ECM)

Das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll erklärt die Schritte zur Herstellung einer löslichen extrazellulären Matrix (ECM) aus der menschlichen Bauchspeicheldrüse. Das durch dieses Protokoll erhaltene solubilisierte EZM-Pulver kann für die Rekapitulation der Mikroumgebung von Pankreasinseln in vitro und möglicherweise in vivo-Umgebungen verwendet werden.

Die Inseltransplantation (ITx) hat das Potenzial, zum Standard in der Betazellersatzmedizin zu werden, aber ihre Ergebnisse sind nach wie vor schlechter als bei der Transplantation der gesamten Bauchspeicheldrüse. Die Protokolle, die derzeit für die Isolierung menschlicher Inselzellen verwendet werden, stehen auf dem Prüfstand, da sie auf der enzymatischen Verdauung des Organs basieren, bei der die Bauchspeicheldrüse zerstört wird, ihre Verbindungen zum Körper verloren gehen und Inselzellen irreversibel geschädigt werden. Die Schädigung von Inselzellen ist durch kritische Faktoren gekennzeichnet, wie z.B. die Zerstörung der extrazellulären Matrix (ECM), die das 3D-Gerüst der Inselnische darstellt und deren Verlust mit der Euphysiologie der Inselchen unvereinbar ist. Forscher schlagen die Verwendung von EZM-basierten Gerüsten vor, die aus der Bauchspeicheldrüse von Säugetieren gewonnen werden, um dieses Problem zu lösen und letztendlich die Lebensfähigkeit, Funktion und Lebensdauer der Inselzellen zu verbessern. Die derzeit verfügbaren Methoden zur Gewinnung solcher Gerüste sind rau, da sie größtenteils auf Detergenzien basieren. Daher schlagen wir eine neue, waschmittelfreie Methode vor, die weniger ECM-Schäden verursacht und kritische Komponenten der Pankreas-EZM erhalten kann. Die Ergebnisse zeigen, dass das neu entwickelte Dezellularisierungsprotokoll es ermöglichte, eine vollständige DNA-Clearance zu erreichen, während die EZM-Komponenten erhalten blieben. Die erhaltene EZM wurde auf Zytotoxizität getestet und mit menschlichen Pankreasinseln verkapselt, die ein positives zelluläres Verhalten bei der Insulinsekretion zeigten, wenn sie mit Glukoseprovokation stimuliert wurden. Gemeinsam schlagen wir eine neue Methode zur Dezellularisierung der menschlichen Bauchspeicheldrüse ohne den Einsatz herkömmlicher ionischer und nichtionischer chemischer Detergenzien vor. Dieses Protokoll und die damit erhaltene EZM könnten sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen von Nutzen sein.

Die Isolierung der Pankreasinseln ist ein sorgfältiger Prozess, der durch die enzymatische Verdauung der Verbindungen zwischen den Inseln und ihrer extrazellulären umgebenden Stützstruktur durchgeführt wird. Diese Zerstörung der extrazellulären Matrix (ECM) ist einer der kritischen Faktoren bei der Charakterisierung der Schädigung von Inselzellen, die während der Isolationsprozesse stattfindet 1,2,3,4. Die peri-isletäre EZM ist ein essentieller azellulärer Bestandteil der endokrinen Bauchspeicheldrüse. Es besteht aus Proteinen und Polysacchariden, die interagieren und sich vernetzen, um ein dreidimensionales Netz zu bilden, das strukturell und biochemisch die physiologische Homöostase unterstützt und bei der Wiederherstellung dieser In-vitro-Mikroumgebung hilft ^2,5,6. Der Verlust grundlegender Signalprozesse zwischen Inselzellen und EZM wird als einer der beitragenden Faktoren anerkannt, der das Überleben der Inselzellen in vitro und in vivo einschränkt 2,7,8,9,10.

Tierische und menschliche EZM wurden häufig für die Rekapitulation der Mikroumgebung der Pankreasinseln verwendet 11,12,13,14,15,16,17,18,19. Seit die Fähigkeit der EZM, die Anhaftung, Proliferation und langfristige Aufrechterhaltung von Kulturzellen von Ratten zu verbessern, erstmals in ^Ref.20 berichtet wurde, haben viele andere Studien starke Beweise dafür geliefert, dass die Wiederherstellung der nativen EZM-Interaktion mit menschlichen Inselzellen die Inselfunktion verbessert^21,22. Jüngste Daten haben beispielsweise gezeigt, dass mit EZM verkapselte Inselzellen die glykämische Kontrolle bei diabetischen Mäusen signifikant verbesserten, indem sie die Abgabe von Insulin in einer neuartigen zellbasierten Insulinabgabeplattform verbesserten und erleichterten²³. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass der Einbau kritischer Komponenten der Pankreas-EZM die endokrine Funktion der β-Zellen signifikant verbessern kann 24,25,26,27.

Die in der Literatur vorhandenen ECM-Herstellungsprotokolle basieren auf der Anwendung chemischer Reinigungsmittel, z. B. Triton X-100 oder Natriumdodecylsulfat (SDS). Trotz einer hervorragenden DNA-Clearance sind Chemikalien, die in Dezellularisierungsprozessen verwendet werden, zytotoxisch, teuer, und Rückstände auf dem dezellularisierten Gewebe geben Anlass zur Sorge im Hinblick auf eine mögliche klinische Anwendung.

Basierend auf diesen Beobachtungen verfolgte diese Studie drei Ziele: Erstens, eine Dezellularisierungsmethode für die menschliche Bauchspeicheldrüse mit minimalem Einsatz von ionischen oder nichtionischen chemischen Detergenzien zu entwickeln; Zweitens, um ein lösliches EZM-Gerüst für die Gewebekultur herzustellen; Drittens, die Charakterisierung der pankreatischen EZM zu erreichen, um ihre Zytotoxizität und ihren Einfluss auf die Funktion der Inselzellen zu bewerten. Die Charakterisierung ist für alle zellkulturbasierten Anwendungen notwendig, da sie zeigt, dass solubilisierte Pankreas-EZM bei der Rekapitulation der Pankreas-Mikroumgebung für isolierte Inselzellen von Vorteil sein könnte. Hierin wird ein wirksames, detergenzienfreies Dezellularisierungsverfahren für die menschliche Bauchspeicheldrüse, die Charakterisierung der EZM und die Wirkung der EZM auf die Lebensfähigkeit und Funktion von eingekapselten isolierten menschlichen Pankreasinseln beschrieben.

Diese Forschungsstudie wurde vom Humanforschungsausschuss des Wake Forest Baptist Medical Center genehmigt. Menschliche Bauchspeicheldrüse wurde ethisch einwandfrei von Organspendern über Carolina Donor Services gewonnen. Organspender wurden gemäß den UNOS-Vorschriften auf Infektionskrankheiten untersucht, die für den Menschen relevant sind. Die Organe wurden in einer sterilen Konservierungslösung erhalten, wo sie bis zur Verwendung aufbewahrt wurden. Bei der Übergabe an das Labor wurden alle Organe inspiziert und Proben der nativen Bauchspeicheldrüse für histologische Zwecke entnommen. Anschließend wurden die Organe eingefroren und bis zur weiteren Verwendung steril bei -20 °C gelagert.

1. Chirurgische Aufbereitung der menschlichen Bauchspeicheldrüse

HINWEIS: Gefrorene Bauchspeicheldrüse wurden über Nacht bei 4 °C aufgetaut.

1. Vor Beginn der chirurgischen Dissektion der menschlichen Bauchspeicheldrüse 1 l Waschlösung, bestehend aus 950 mL deionisiertem Wasser (dH₂O), 50 ml Reagenz auf Jodbasis und 1% Pen/Streptokokken-Lösung, vorbereiten.
2. Tragen Sie während der chirurgischen Dissektion sterile Handschuhe und einen Laborkittel. Führen Sie alle Operationen unter einer Haube in Zellkulturqualität durch, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden.
3. Übertragen Sie die Bauchspeicheldrüse aus dem sterilen Transportbeutel in das sterile Plazentabecken. Stellen Sie sicher, dass die Bauchspeicheldrüse mit dem Kopf des Organs nach links und dem Schwanz nach rechts ausgerichtet ist.
4. Präparieren Sie den Zwölffingerdarm vorsichtig mit einer sterilen Schere und einer nicht gezahnten Pinzette vom Kopf der Bauchspeicheldrüse. Achten Sie darauf, kein Loch in den Zwölffingerdarm zu bohren, da dies die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination erhöht.
   HINWEIS: Wenn ein Loch in den Magen-Darm-Trakt gemacht wird, klemmen Sie das Loch schnell fest und fahren Sie mit der Dissektion fort.
5. Sobald die Dissektion des Bauchspeicheldrüsenkopfes abgeschlossen ist, entsorgen Sie den Zwölffingerdarm in einem geeigneten Biohazard-Beutel und befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für seine Entsorgung.
6. Präparieren und verwerfen Sie das gesamte extrapankreatische Gewebe, das um den Kopf der Bauchspeicheldrüse herum verbleibt, einschließlich der großen Blutgefäße und des Gallengangs, die normalerweise zum Zeitpunkt der Organentnahme mit nicht resorbierbaren Nähten markiert sind. Entsorgen Sie das Taschentuch gemäß den institutionellen Richtlinien.
7. Präparieren und verwerfen Sie das gesamte extrapankreatische Gewebe und das peripankreatische Fettgewebe, das den Schwanz der Bauchspeicheldrüse umgibt, und legen Sie die Milzblutgefäße frei.
8. Sobald der Gefäßstiel der Milz freigelegt ist, entfernen Sie die Milz und präparieren Sie die Milzblutgefäße in ihrer Gesamtheit, einschließlich derjenigen, die an der hinteren Oberfläche der Bauchspeicheldrüse (Milzarterie und Vene) befestigt sind. Entsorgen Sie die Milz und entfernen Sie Gewebe gemäß den institutionellen Richtlinien.
9. Präparieren und entsorgen Sie das extrapankreatische Fett, das deutlich sichtbar ist, insbesondere das peripankreatische Fett.
   HINWEIS: Auf Höhe des Pankreasschwanzes kann das Retroperitoneum sichtbar sein. Diese sollte mit einer nicht gezahnten Pinzette angehoben, entsprechend mit einer chirurgischen Zange entfernt und fachgerecht entsorgt werden. Die Bauchspeicheldrüse sollte nun frei von überschüssigem Pankreasgewebe sein.
10. Präparieren Sie die Bauchspeicheldrüse, um 1 cm³ Würfel Pankreasgewebe mit einer chirurgischen Schere, sterilisierten histologischen Klingen oder chirurgischen Skalpellen zu erhalten. Die nach dieser Dissektion gewonnenen Würfel des Pankreasgewebes werden dem Dezellularisierungsprozess unterzogen. Die durchschnittliche Anzahl der Pankreaswürfel, die einer Dezellularisierung unterzogen werden, hängt von den intrinsischen Eigenschaften des Organs ab. Im Durchschnitt wurden in der vorliegenden Studie zwischen 40 und 60 Pankreaswürfel dezellularisiert.
11. Fahren Sie mit Schritt 2.1 fort

2. Dezellularisierung des Pankreasgewebes

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde bei Bauchspeicheldrüse mit einem Durchschnittsgewicht von 100 g angewendet; Daher wird nicht empfohlen, dieses Gewicht bei dieser Dezellularisierungstechnik zu überschreiten.

1. Das gesamte zuvor in Schritt 1.10 präparierte Pankreasgewebe mit der Waschlösung in einen sterilen Kunststoffbehälter (siehe Materialtabelle) geben und 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
2. Entnehmen Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe mit Hilfe einer sterilen Pinzette und legen Sie es in ein neues steriles Gefäß, das steriles, endotoxinfreies deionisiertes Wasser enthält. Verschließen Sie den Deckel des Behälters fest und stellen Sie ihn 24 h lang mit einer eingestellten Temperatur von 4 °C und einer Schüttelgeschwindigkeit zwischen 180 und 200 U/min auf einen gekühlten Orbitalschüttler.
3. Entfernen Sie den Behälter mit dem Bauchspeicheldrüsengewebe und reinigen Sie die Außenseite entsprechend, bevor Sie ihn zur Fortsetzung des Vorgangs in die Haube einsetzen.
4. Entfernen Sie das Pankreasgewebe mit einer chirurgischen Zange und legen Sie es zusammen mit 1 l deionisiertem Wasser, 50 mg DNase I und 0,0025 % Magnesiumchlorid in einen neuen sterilen Behälter. Schließen Sie den Deckel des Behälters fest und stellen Sie ihn 6 Stunden lang in einen Orbitalschüttler mit einer voreingestellten Temperatur von 37 °C und einer Schüttelgeschwindigkeit von 100 U/min.
5. Bereiten Sie die EDTA-Trizma-Lösung vor
   1. Sammeln Sie einen neuen sterilen 1-Liter-Behälter und reinigen Sie ihn entsprechend, bevor Sie ihn in die Haube einsetzen. Um 1 l EDTA-Trizma-Lösung herzustellen, fügen Sie Folgendes hinzu: 985 mL steriles deionisiertes Wasser, 7,5 mL Tris-HCl-Puffer und 7,5 mL EDTA-Lösung. Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern.
6. Entfernen Sie den Behälter, der das Pankreasgewebe umschließt, und reinigen Sie die Außenseite entsprechend, bevor Sie ihn in die Haube einführen, um den Vorgang fortzusetzen.
7. Entnehmen Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe mit Hilfe einer chirurgischen Zange und geben Sie es in einen neuen sterilen Behälter mit 1 l EDTA-Trizma-basierter Lösung. Schließen Sie den Deckel des Behälters fest und stellen Sie ihn in einen Orbitalschüttler mit einer voreingestellten Temperatur von 4 °C und einer Schüttelgeschwindigkeit zwischen 180 und 200 U/min für 18 Stunden.
8. Entfernen Sie den Behälter mit dem Pankreasgewebe und reinigen Sie die Außenseite entsprechend, bevor Sie ihn für den Vorgang in die Haube einführen.
9. Entnehmen Sie das Pankreasgewebe mit Hilfe einer sterilen Pinzette und legen Sie es in ein neues steriles Gefäß mit sterilem, endotoxinfreiem, deionisiertem Wasser. Schließen Sie den Deckel des Behälters fest und stellen Sie ihn auf einen gekühlten Orbitalschüttler mit einer eingestellten Temperatur von 4 °C und einer Schüttelgeschwindigkeit zwischen 180 und 200 U/min für 24 Stunden.
   HINWEIS: Während dieser Verarbeitungszeit kommt es zu einer spürbaren Farbveränderung, bei der das Gewebe heller erscheint.
10. Sammeln Sie das Pankreasgewebe und lagern Sie es in sterilen 50-ml-Zentrifugationsröhrchen, wobei ein Maximum von 25 mL pro Röhrchen für das anschließende Einfrieren und die Gefriertrocknung erreicht wird. Die Anzahl der Zentrifugationsröhrchen variiert je nach Größe der Bauchspeicheldrüse. Lagern Sie die Proben bei -80 °C.

3. Herstellung von Pankreas-EZM-Pulver – Lyophilisation und Kryo-Mahlen

1. Nach mindestens 24–40 h Lagerung des dezellularisierten Materials bei -80 °C wird die Pankreas-EZM in einen Gefriertrockner überführt.
2. Füllen Sie das gefrorene Material in einen Gefriertrockner und verhindern Sie ein Auftauen des Materials.
   HINWEIS: Der Gefriertrocknungsschritt dauert ca. 3 bis 5 Tage, abhängig von mehreren Faktoren, wie z. B. der Materialmenge in jedem Röhrchen, das den Prozess durchläuft, und der für die Gefriertrocknung freigelegten Oberfläche. Es wird empfohlen, dass das dezellularisierte Gewebe den Gehalt von 25 ml in jedem Röhrchen nicht überschreitet und dass die Röhrchen in einem Winkel von 45° eingefroren werden, so dass nach Beginn der Lyophilisation mehr Oberfläche leicht freigelegt werden kann. Entfernen Sie die Deckel von den Tuben.
3. Nach der Lyophilisierung werden die Materialien in eine Haube in Zellkulturqualität überführt.
4. Schneiden Sie jedes Stück der getrockneten ECM mit einer sterilen Schere in die Hälfte seiner Größe. Diese getrockneten ECM-Teile werden einem automatisierten Mahlprozess unterzogen, um ein ECM-Pulver herzustellen. Verwenden Sie einen kryogemahlenen automatischen Prozessor, um einen Temperaturanstieg und eine anschließende Denaturierung der biologischen Eigenschaften der ECM zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Einstellung der Kryo-Fräsmaschine anzupassen, um nach dem Mahlvorgang ein feines Pulver zu erhalten.
   HINWEIS: In dieser Studie wurden Bauchspeicheldrüse von Spendern mit einem BMI < 30 verwendet. Pankreata von Spendern mit einem BMI > 30 zeigten eine Tendenz, mehr intraparenchymales Fett zu enthalten. Der Prozess der Gefriertrocknung wird als nicht optimal angesehen und kann durch den Fettgehalt gehemmt werden. Wenn das Gewebe nach der Lyophilisierung sichtbar ölhaltig ist, muss es verworfen werden, da es für die Herstellung des ECM-Pulvers nicht optimal ist.

4. Solubilisierung der Pankreas-EZM

HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt beträgt die Ausbeute des dezellularisierten Pankreaspulvers bei einer durchschnittlich großen Bauchspeicheldrüse (100 g) 1–2 g.

1. Wiegen Sie 1 g ECM-Pulver mit Hilfe eines sterilen Kunststoffspatels.
2. Erreichen Sie eine Solubilisierung gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen: Solubilizieren Sie 1 g ECM in 100 mL 0,01 M HCl und 100 mg Pepsin für 48 h bei RT unter ständigem Rühren²⁸.
3. Nach 48 h wird NaOH verwendet, um den pH-Wert (pH = 7) der sauren EZM zu neutralisieren, während das Becherglas mit der sauren EZM auf Eis gehalten wird, um eine Gelierung zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Gelierungskinetik variiert je nach Temperatur, Kollagengehalt, pH-Wert und Neutralisationslösung. In dieser Forschungsstudie wurden 0,01 M NaOH verwendet. Das Volumen an NaOH, das für die pH-Neutralisation zugegeben wurde, betrug etwa 100 ml. Erwägen Sie, den pH-Wert mehrmals zu messen, während Sie die saure ECM-Lösung neutralisieren.
4. Die neutrale ECM-Lösung in sterile 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführen. Verschließen Sie die Röhrchen und legen Sie sie in eine Zentrifuge. Die Röhrchen mit dem solubilisierten ECM werden 15 min lang bei maximaler Drehzahl (12.000 x g) bei 4 °C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden die Röhrchen in eine Zellkulturhaube überführt.
   HINWEIS: Nach dem Zentrifugieren der Probe lagert sich die unlösliche Komponente der ECM am Boden des Röhrchens ab, während sich die gelöste ECM-Lösung oben im Überstand befindet.
5. Sammeln Sie mit sterilen Techniken den Überstand des Röhrchens mit der löslichen ECM-Lösung und überführen Sie es in frische 50-ml-Röhrchen, wobei ein Maximum von 25 mL pro Röhrchen erreicht wird.
6. Lagern Sie die Röhrchen der ECM-Lösung bei -80 °C.

5. Herstellung von Pankreas-ECM-Pulver – Lyophilisierung und Lagerung

1. Nach mindestens 24–40 h Lagerung der löslichen ECM-Lösung bei -80 °C werden die Röhrchen in einen Gefriertrockner überführt.
2. Füllen Sie das gefrorene Material in einen Gefriertrockner und stellen Sie sicher, dass das Material nicht auftaut.
   HINWEIS: Der Gefriertrocknungsschritt dauert ca. 3 bis 5 Tage, abhängig von mehreren Faktoren, wie z. B. der Materialmenge in jedem Röhrchen, das den Prozess durchläuft, und der für die Gefriertrocknung freigelegten Oberfläche. Es wird empfohlen, dass die lösliche ECM-Lösung den Gehalt von 25 mL in jedem Röhrchen nicht überschreitet und dass die Röhrchen in einem Winkel von 45° eingefroren werden, damit nach Beginn der Gefriertrocknung mehr Oberfläche leicht freigelegt werden kann. Entfernen Sie vor der Lyophilisierung die Deckel vom Falkenröhrchen.
3. Nach der Lyophilisierung der löslichen ECM-Lösung wird das Material in eine Haube in Zellkulturqualität überführt. Nach vollständiger Lyophilisation ist ein feines EZM-Pulver sichtbar.
   HINWEIS: Die erzielte Ausbeute beträgt 700 mg aus 1 g dezellularisiertem Gewebe.
4. Lagern Sie das lösliche ECM-Pulver oder verwenden Sie es für Zellkulturzwecke.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, das ECM bei 4 °C für den sofortigen Gebrauch, bei -20 °C für den späteren Gebrauch und bei -80 °C für die Langzeitlagerung zu lagern.

6. Charakterisierung der Pankreas-EZM mit histologischer Färbung

1. Entnehmen Sie ein Stück nativer Bauchspeicheldrüse kurz nach der Entbindung des Organs und vor der Dezellularisierung. Fixieren Sie dies für 24 Stunden in 10% Formalin. Waschen Sie die Proben in entionisiertem Wasser. Dehydrieren Sie es in abgestuftem Alkohol, bevor Sie es in Paraffin einbetten, und schneiden Sie es in 5 mm große Abschnitte.
2. Am Ende des Dezellularisierungsprozesses wird eine Probe des dezellularisierten Materials entnommen und 24 Stunden lang in 10 % Formalin fixiert. Waschen Sie die Probe in entionisiertem Wasser. Dehydrieren Sie es in abgestuftem Alkohol, bevor Sie es in Paraffin einbetten, und schneiden Sie es in 5 mm große Abschnitte.
3. Um eine erfolgreiche Dezellularisierung zu verifizieren, führen Sie H&E- und DAPI-Färbungen sowohl an der nativen Bauchspeicheldrüse als auch am dezellularisierten Gegenstück durch.
4. Zur histologischen Charakterisierung führen Sie die Masson-Färbungen Trichrom (MT) und Alcianblau (AB) durch, die die kollagenen bzw. GAGs-Strukturen hervorheben.

7. Charakterisierung des löslichen ECM-Pulvers

1. Durchführung einer DNA-Analyse des DNA-Gehalts und des Gesamtkollagens des nativen Pankreasgewebes und des löslichen EZM-Pulvers, wie zuvor beschrieben²⁹.
2. Quantifizieren Sie sulfatierte Glykosaminoglykane (sGAG) auf der Grundlage des Protokolls, das in einem kommerziell erhältlichen Kit bereitgestellt wird (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie ein Mikrotiterplatten-Spektralphotometer, um den sulfatierten sGAG-Gehalt in der Pankreas-ECM bei einer Wellenlänge von 595 nm³⁰ zu messen.
   HINWEIS: Der DNA-Gehalt ist als ng/mg des Trockengewebes und der Kollagen- und GAG-Gehalt als μg/mg des Trockengewebes anzugeben.

8. Verkapselung menschlicher Inselzellen mit der EZM und Kultur

HINWEIS: Menschliche Pankreasinseln wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Nach der Ankunft werden die menschlichen Pankreasinseln in nicht gewebekulturbehandelten Platten 24 Stunden lang unter Standardbedingungen mit einer Dichte von ca. 2.000 IEQ in jeder 10 cm großen Platte kultiviert.
2. Manipulieren Sie die menschlichen Inseln, um die Wirkung der EZM auf die Funktionalität und Lebensfähigkeit der Inseln mit den folgenden experimentellen Gruppen zu testen: Freie Inseln, in Alginat eingekapselte Inselzellen und in Alginat-EZM eingekapselte Inseln.
   HINWEIS: Die oben genannten Inselgruppen wurden in vitro unter Standardbedingungen für bis zu 8 Tage kultiviert, um die Wirkung der EZM auf die Funktionalität und Lebensfähigkeit der Inselzellen zu beurteilen.
3. Alginat auf einer Waage wiegen und mit HBSS in ein Zentrifugationsröhrchen suspendieren, um ein Verhältnis von 1,5 % (w/v) zu erhalten. Das Zentrifugenröhrchen über Nacht bei 4 °C auf einen Rotator stellen.
   HINWEIS: Für das Alginat gab der Hersteller ein Molekulargewicht zwischen 75–200 kDA und ein G/M-Verhältnis von ≤ 1 an.
4. Wiegen Sie 0,1 mg ECM und suspendieren Sie es in 1 mL des zuvor hergestellten Alginats, um eine ECM-Konzentration von 0,1 mg/ml zu erreichen.
5. Verkapselung menschlicher Pankreasinseln in Alginat und Alginat-ECM gemäß einem zuvor beschriebenen Protokoll³¹. Die Vorgehensweise wird im Folgenden kurz beschrieben.
   1. 3.000 IEQ in 1 ml Alginat und 3.000 IEQ in 1 ml Alginat-EZM werden vorsichtig in einer zuvor in Schritt 8.4 hergestellten ECM-Konzentration von 0,1 mg/ml gesammelt und gemischt.
   2. Pumpen Sie die erhaltenen Suspensionen durch eine mikrofluidische Verkapselungsvorrichtung, die auf 0,2 mL/min und eine Durchflussrate bzw. einen Luftdruck von 2,0 Pa eingestellt ist.
   3. Sammeln Sie die Mikrokapseln nach der Herstellung in 100 mM CaCl_2-Bad mit 10 mM HEPES. Lassen Sie das Alginat 10 Minuten lang vernetzen.
   4. Vor der Kultivierung werden die verkapselten Inselzellen unter Standardbedingungen 2–3 Minuten lang bei 37 °C mit HBSS mit 5 % CO₂ gewaschen.
   5. Fügen Sie das Nährmedium hinzu (siehe Materialtabelle) und wechseln Sie bis zum Ende des Experiments alle zwei Drittel des Mediums.
      HINWEIS: Die obigen Schritte müssen sowohl für die Inselzellen in Alginat als auch für Inselzellen in Alginat-ECM durchgeführt werden.
6. Führen Sie am 8. Tag, nach der Verkapselung, eine glukosestimulierte Insulinsekretion (GSIS) und eine DNA-Analyse durch, um die Insulinproduktion bzw. die Lebensfähigkeit der Inselzellen zu beurteilen.
7. Erhalten Sie Hellfeldbilder und Lebend-/Totfärbungen von freien und verkapselten Inseln, um die zelluläre Morphologie und Lebensfähigkeit zu beurteilen.
   HINWEIS: Eine qualitative Bewertung der Bilder wurde durchgeführt, um den Gesundheitszustand der Inselchen zu beurteilen. Zu den berücksichtigten Parametern gehören Form, Rand, Integrität und Durchmesser der Inselzellen sowie das Vorhandensein einzelner Zellen in Kultur.

9. Glukosestimulierte Insulinfreisetzung (GSIS) und DNA-Messung

HINWEIS: An Tag 8, nach der Verkapselung, wurden humane Pankreasinseln entnommen und mit Kreb-Puffer inkubiert, der niedrige (2,8 mM) und hohe (16,8 mM) Glukosekonzentrationen enthielt, gefolgt von KCl-Depolarisationslösung (25 mM). Die Glukoseprovokation wurde unter Modifikation eines zuvor beschriebenen Protokolls durchgeführt³².

1. Setzen Sie das Gelfiltrationsharz in Polypropylensäulen ein.
2. Setzen Sie Behandlungsgruppen (freie oder verkapselte Inseln) in den mittleren Teil des Gelfiltrationsharzes innerhalb der Polypropylensäulen ein.
3. Pipettieren Sie Glukose und depolarisierende Lösungen in die oben beschriebenen Polypropylensäulen und inkubieren Sie 1 h lang in der folgenden Reihenfolge: Führen Sie eine Vorinkubationsphase mit niedriger Molaritätsglukoselösung durch, dann fahren Sie mit einer Reihe von Inkubationen mit niedriger, hoher, niedriger und depolarisierender Glukoselösung fort, wie in der Anmerkung zu Beginn von Abschnitt 9 erwähnt.
4. Sammeln Sie das Medium aus jeder Inkubationsphase und lagern Sie es bei -80 °C für die anschließende Analyse.
5. Nach der Inkubation und Entnahme der depolarisierenden Lösung werden die menschlichen Pankreasinseln mit 1 ml DNA-Extraktionspuffer inkubiert und bis zur weiteren Analyse gelagert.
6. Messen Sie den Insulingehalt aus den Inkubationen der Glukose und der depolarisierenden Lösung mit einem Insulin-ELISA-Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers.
7. Messen Sie den DNA-Gehalt aus dem Extraktionspuffer, der in Schritt 9.5 entnommen wurde, mit einem DNA-Assay-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
8. Normalisieren Sie die Insulinmessungen entsprechend dem DNA-Gehalt.

10. Statistische Auswertung

HINWEIS: Gruppenvergleiche beziehen sich auf dieselbe Charge menschlicher Inselzellen mit n = 3 unabhängigen Bewertungen, die für jeden in diesem Manuskript beschriebenen Assay durchgeführt wurden. Die Werte werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.

1. Verwenden Sie eine Statistiksoftware, um den Mann-Whitney-Test zur Beurteilung der Dezellularisierung und DNA-Restanalysen durchzuführen, vergleichen Sie die native, die dezellularisierte Bauchspeicheldrüse und die solubilisierte EZM.
2. Führen Sie einen ungepaarten t-Test zur Beurteilung der Glykosaminoglykane und des Kollagens zwischen der nativen, der dezellularisierten Bauchspeicheldrüse und der solubilisierten EZM durch.
3. Führen Sie eine 2-Wege-ANOVA mit post-hoc Mehrfachvergleichen der Türkei für den Glukosestimulationstest bei der Beurteilung der Inselstimulation an Tag 8 durch.
4. Betrachten Sie die statistische Signifikanz bei p < 0,05 mit der Bezeichnung *p < 0,05, **p<0,01, ***p < 0,001 und ****p < 0,0001.

Native und azelluläre Pankreasproben wurden für die histologische Färbung mit H&E, MT und AB aufbereitet. Die H&E-Färbung zeigte das völlige Fehlen von Kernmaterial und Zellen, was eine erfolgreiche Dezellularisierung bestätigt. MT- und AB-Färbungen zeigten das Gerüst der EZM und hoben qualitativ kollagene bzw. stromale Komponenten hervor (Abbildung 1).

Diese Methode ermöglichte die konsistente Erzeugung eines EZM-Pulvers aus der menschlichen Bauchspeicheldrüse. DNA-Quantifizierungstests bestätigten eine zufriedenstellende Zellclearance³³. Native, azelluläre und lösliche pankreatische EZM wurden biochemisch charakterisiert, um die grundlegende biologische Zusammensetzung zu beurteilen. Es wurde festgestellt, dass die Pankreas-EZM azellulär und DNA-frei ist (DNA < 50 ^ng.mg-1 des Trockengewebes), mit konsistenter Konservierung von Kollagen und Glykosaminoglykanen, wie von anderen berichtet^11,15. Die DNA-Analyse zeigte die Clearance von Desoxyribonukleinsäure sowohl in der azellulären als auch in der solubilisierten Pankreas-EZM (von 4,56 μg/mg ± 3,42 μg/mg auf 30,05 ng/mg ± 22,89 ng/mg für die azelluläre Bauchspeicheldrüse p = 0,0001; von 4,56 μg/mg ± 3,42 μg/mg auf 22,81 ng/mg ± 11,31 ng/mg für die solubilisierte Pankreas-EZM). (Abbildung 2).

Das Gesamtkollagen wurde in der nativen Bauchspeicheldrüse, in der azellulären und in der solubilisierten Pankreas-EZM quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten einen statistisch signifikanten Anstieg des Kollagens in der azellulären Bauchspeicheldrüse und in der löslichen Pankreas-EZM im Vergleich zum nativen Gewebe (von 7,35 μg/mg ± 1,68 μg/mg auf 27,74 μg/mg ± 2,35 μg/mg für die azelluläre Bauchspeicheldrüse p < 0,0001; von 7,35 μg/mg ± 1,68 μg/mg auf 26,08 μg/mg ± 3,63 μg/mg für die solubilisierte pankreasische EZM p < 0,001). Dieser Anstieg des Kollagengehalts ist auf die Isolierung und Reinigung der EZM aus den zellulären Komponenten zurückzuführen, die eine Gesamtanreicherung an Kollagen und sGAG in der EZM im Vergleich zum nativen Organ darstellen (Abbildung 2).

Die Quantifizierung der Glykosaminoglykane zeigte eine statistisch signifikante Abnahme des GAG-Gehalts im azellulären Gewebe und in der solubilisierten Pankreas-EZM, vergleichbar mit unserer vorherigen Studie^11,15, mit einer Abnahme von 15,08 μg/mg ± 3,03 μg/mg auf 4,87 μg/mg ± 1,20 μg/mg für die azelluläre Bauchspeicheldrüse p < 0,001 und von 15,08 μg/mg ± 3,03 μg/mg auf 3,45 μg/mg ± 0,20 μg/mg für die solubilisierte Pankreas-EZM (p < 0,01) (Abbildung 2).

Verkapselte Inselzellen, die in nicht mit Gewebekulturen behandelten Platten kultiviert wurden, waren 8 Tage nach der Verkapselung lebensfähig. Sowohl die Lebend- als auch die Totfärbung zeigten, dass Inseln, die unter den drei verschiedenen Bedingungen kultiviert wurden, lebensfähig waren; es gab jedoch ein erhöhtes Vorhandensein von toten Zellen, wenn sie nicht verkapselt waren (Abbildung 3). Verkapselte Inselzellen behielten ihre kugelförmige Form mit einem gut abgerundeten Rand, einem stabilen Durchmesser und fast keinen einzelnen Zellen in Kultur. Zum analysierten Zeitpunkt zeigten freie Inselzellen eine Tendenz zur Aggregation, zur Entwicklung von Unregelmäßigkeiten an den Rändern und Formen und zur Hervorhebung eines dunkleren Kerns, was auf ein nekrotisches Ereignis hindeutet.

Es wurde festgestellt, dass sowohl freie als auch verkapselte Inselzellen zum analysierten Zeitpunkt auf Glukose reagierten (Abbildung 3). In ECM-Alginat verkapselte Inselzellen zeigten einen signifikanten Anstieg der Insulinsekretion nach hoher Glukosestimulation und KCl-Depolarisation im Vergleich zu freien und nur Alginat-verkapselten Inseln.

Abbildung 1: Repräsentative H&E-, Masson's Trichrome und Alcian Blue histologische Bilder. Die native humane Bauchspeicheldrüse (A,C,E) und die humane Pankreas-EZM (B,D,F) wurden mit dem neu entwickelten experimentellen Protokoll dezellularisiert. Das H&E-Panel zeigte einen vollständigen Verlust der Kernstrukturen im Vergleich zum nativen Pankreasgewebe. Die Trichrom-Färbung nach Masson hebt das Gerüst der extrazellulären Matrix hervor, und die Alcian-Blau-Färbung hebt das Bindegewebsgerüst der extrazellulären Matrix hervor. Maßstabsleiste = 100 μm für Paneele A,C,D,E,F; Maßstabsleiste = 25 μm für Panel B. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Biochemische Charakterisierung der nativen Pankreas-, azellulären und solubilisierten Pankreas-EZM. (A) Es wurde eine zufriedenstellende Entfernung von DNA in der azellulären Bauchspeicheldrüse und in der solubilisierten Pankreas-EZM bestätigt. (B,C) Die Quantifizierung von Glykosaminoglykanen und Kollagen wird in der nativen Bauchspeicheldrüse im Vergleich zur azellulären und solubilisierten EZM durchgeführt. Die statistische Analyse wurde durch den t-Test von nativer vs. dezellularisierter Bauchspeicheldrüse und nativer vs. solubilisierter EZM durchgeführt; = p < 0,0001; p < 0,001; **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Qualitative Bewertung der Lebensfähigkeit menschlicher Inselzellen und quantitative Bewertung der Insulinsekretion. (A) Hellfeld- und Lebend-/Totbilder von isolierten menschlichen Inseln, die als frei kultiviert wurden, in Alginatkapseln und in Alginat-ECM-Kapseln am Tag 6 nach der Verkapselung. (B) Bewertung der Glukosestimulation von isolierten menschlichen Inseln, die auf nicht gewebekulturell behandelten Platten in drei verschiedenen Umgebungen kultiviert wurden: frei, in Alginatkapseln und in Alginat-ECM-Kapseln am Tag 8 nach der Verkapselung. Die Werte der Insulinsekretion wurden nach DNA-Normalisierung berichtet. Statistische Vergleiche der Insulinsekretion werden zwischen den drei Kulturbedingungen in hoher Glukose bzw. nach KCl-Depolarisationslösung durchgeführt; *p < 0,0 und ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ziel dieser Arbeit war es, ein schonenderes, detergenzienfreies Dezellularisierungsprotokoll zur Herstellung von Pankreas-ECM zu entwickeln. Dabei wurde auf den Erhalt der EZM-Bestandteile des Pankreasparenchyms geachtet und auf die Vermeidung einer langwierigen Gewebeexposition gegenüber herkömmlichen ionischen oder nichtionischen chemischen Detergenzien während des Dezellularisierungsprozesses.

Der innovativste Aspekt des entwickelten Dezellularisierungsverfahrens ist der Verzicht auf klassische ionische und nichtionische chemische Detergenzien. Unsere bisherigen Erfahrungen mit der Produktion von humaner Pankreas-EZM 11,12,13,22,34,35 legten die Grundlage für die Produktion von azellulären pankreasunterstützenden Medien dar. Dennoch erfordert die Infusion mit Hunderten von Litern chemischer Detergenzien durch den Pankreasgang, die Arteria mesenterica superior und die Arteria splenica^11,13 spezifische chirurgische Techniken und ist in der Großproduktion nicht immer durchführbar. Am wichtigsten ist, dass die Dezellularisierung des Gewebes in einem Orbitalschüttler anstelle der Infusion von Detergenzien durch das Gefäßsystem einen Paradigmenwechsel in der Methodik darstellt und enorm zur technischen Einfachheit, Konsistenz und Machbarkeit der Dezellularisierung beiträgt, was die ECM-Produktion für die Translation verbessert. Darüber hinaus werden Organe, die zu Forschungszwecken beschafft werden, häufig aufgrund von Inkonsistenzen im Beschaffungsprozess beschädigt, die manchmal auf eine abnormale Anatomie zurückzuführen sind, die die Kanülierung vereitelt. Daher würde unsere Methode es ermöglichen, alle Organe für die Dezellularisierung aufzubereiten. Wir schließen daraus, dass diese Methode für die Dezellularisierung und die Produktion von EZM aus verschiedenen Organen und möglicherweise sowohl für in vitro als auch für in vivo Anwendungen von Interesse sein könnte.

Die Entwicklung des vorliegenden Dezellularisierungsverfahrens wurde durch unsere früheren Erfahrungen mit Triton X-100 als Hauptchemikativmittel 11,13,36 beeinflusst. Da es nicht möglich war, den Rest von Triton X-100 in der ECM-Postdezellularisierung zu quantifizieren, und die mangelnde Durchführbarkeit bei der Skalierung des Herstellungsprozesses in einer cGMP-Umgebung unsere Gruppe dazu veranlasste, die Machbarkeit einer Dezellularisierung durch mechanisches Schütteln anstelle einer Perfusion der gesamten Bauchspeicheldrüse zu untersuchen. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Verwendung einer hypotonen Lösung effizient sein würde, um osmotische Schäden in lebenden Zellen auszufällen und zelluläres Kernmaterial für eine anschließende enzymatische Behandlung freizulegen, ein Prozess, der auf die Beseitigung von Desoxyribonukleinsäureresten abzielt. Nach ersten Ansätzen zur Dezellularisierung der menschlichen Bauchspeicheldrüse durch Schütteln von gewürfeltem Gewebe in chemischen Detergenzien für 48 Stunden stellten wir fest, dass deionisiertes Wasser wirksam bei der Bereitstellung der zellulären Schäden war, die für den nachfolgenden enzymatischen Schritt und die Zellentfernung erforderlich waren. Anschließend untersuchten wir die Möglichkeit, die detergenzienfreie Phase nach 24 h zu reduzieren und bestätigten, dass zelluläre mechanische Schäden durch die hypotone Lösung, deionisiertes Wasser, durchweg in der Lage waren, eine erfolgreiche Dezellularisierung zu gewährleisten und gleichzeitig den Einsatz potenzieller zytotoxischer Wirkstoffe zu vermeiden. Unsere Daten zur Quantifizierung von Kollagen und Glykosaminoglykanen zeigten konsistente Trends mit unseren früheren Erfahrungen und den jüngsten Beobachtungen der menschlichen Bauchspeicheldrüse durch andere Forschungsgruppen^11,15. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass ein Solubilisierungsschritt die Menge der kritischen Komponenten der ECM nicht reduzierte, da ihre Konservierung für die Ausübung der Funktion von EZM-Gerüsten entscheidend ist 15,21,24,36. Die derzeit in der Literatur diskutierten Methoden zur Dezellularisierung der Bauchspeicheldrüse³⁷ zeichnen sich durch die Verwendung ionischer oder nichtionischer Detergenzien und den daraus resultierenden Verlust der angeborenen EZM-Zusammensetzung aus, was den Schluss zulässt, dass eine schonendere Methode, möglicherweise ohne Detergenz, die Grundkomponenten der Pankreas-EZM besser erhalten würde.

Die EZM ist das 3D-Gerüst, das die Zellen in mehrzelligen Organismen strukturell und biochemisch unterstützt. EZM-Proteine und -Strukturen spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung, Differenzierung, Proliferation, dem Überleben, der Polarität und der Migration von Zellen⁶. Die Begründung für die Einbeziehung der Pankreas-EZM sowohl in vitro- als auch in vivo-Anwendungen basiert auf der Evidenz, dass: In reifen Inselzellen regulieren Wechselwirkungen mit EZM oder anderen Matrixmaterialien das Überleben, die Proliferation und die Insulinsekretion der Zellen und tragen zur Erhaltung und Wiederherstellung der^{Morphologie der} kugelförmigen Inselzellen bei 3,21,22,38 ; teilweise verdaute Inselzellen, die einige ihrer nativen ECM-Verbindungen beibehalten, weisen im Vergleich zu hochgereinigten und ECM-freien Inselzellen deutlich reduzierte Apoptoseraten und eine signifikant höhere GSIS-Funktionalität auf 38,39,40; und die EZM verbessert die Inselfunktion, indem sie die Infiltration von Leukozyten verhindert und die Expression von α3-Integrin und fokaler Adhäsionskinase hochreguliert, ein entscheidendes Merkmal für die Bindung und Interaktion zwischen Betazellen und EZM 41,42,43.

Die glukosestimulierte Insulinsekretion nach der Verkapselung menschlicher Inselzellen in Alginat-Mikrokapseln zeigt, wie die Rekonstitution einer dreidimensionalen Umgebung im Vergleich zu einer In-vitro-Kultur auf nicht mit Gewebekulturen behandelten Platten eine gesündere Umgebung für Inselzellen bietet. Die Verkapselung mit Alginat sorgt für die Beibehaltung der ursprünglichen Struktur der Inseln, vermeidet die zelluläre Verklumpung und Dispersion einzelner Zellen und bildet somit die physiologische Struktur der menschlichen Inseln. Es ist allgemein bekannt, dass die Inselfunktion im Laufe der Zeit allmählich abnimmt, wenn sie in vitro unter normalen Bedingungen kultiviert wird, und Alginat, ein inertes Biomaterial, keine ausreichende biochemische Signalübertragung für die Aufrechterhaltung einer optimalen Inselfunktion liefert. Es hat sich gezeigt, dass unser ECM-Biomaterial in vitro einen positiven Einfluss auf die Lebensfähigkeit und Funktionalität der Inselzellen hat, wenn es mit Alginat verkapselt ist, verglichen mit reinem Alginat. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um zu beweisen, ob die Zugabe dieses Biomaterials nach der Solubilisierung als Schritt zur Verbesserung inselbasierter Technologien für In-vitro-Kultursysteme und für potenzielle In-vivo-Anwendungen dienen^{könnte 44,45}.

Einige kritische Schritte können in dem vorgestellten Dezellularisierungsprotokoll hervorgehoben werden: (1) Eine nicht optimale chirurgische Dissektion der menschlichen Bauchspeicheldrüse kann zu einem übermäßigen Vorhandensein von Fettgewebe führen, was den Dezellularisierungsprozess drastisch beeinträchtigt; (2) eine wirksame Lyophilisierung kann nicht erreicht werden, wenn überschüssiges Fettgewebe vorhanden ist; (3) Dies wirkt sich unweigerlich auf den Kryo-Mahlschritt aus, der ineffizient sein wird.

Unter Verwendung des vorgestellten Protokolls wurden mehrere Einschränkungen festgestellt: (1) Die Variabilität der Organe von Mensch zu Mensch vor und nach der Dezellularisierung wurde beobachtet; (2) Es gab auch einige nicht optimale Ergebnisse der Dezellularisierung bei Organen, die von Spendern mit Alkoholmissbrauch in der Vorgeschichte, Patienten mit einem BMI > 30 und einer übermäßigen Ansammlung von peri- und intrapankreatischem Fettgewebe stammten. Wir kamen zu dem Schluss, dass humane Pankreaten von Spendern mit einem BMI < 30 im Allgemeinen als geeignet für die Dezellularisierung angesehen wurden.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die menschliche Bauchspeicheldrüse mit einem osmotischen, waschmittelfreien Verfahren dezellularisiert werden kann, um EZM-Gerüste für die Anwendung in der Betazellersatzmedizin und die Inselmanipulation in vitro zu erhalten. Der Herstellungsprozess stellt einen praktikablen und reproduzierbaren Ansatz für translationale Zwecke dar, und die Vermeidung sowohl chemischer Detergenzien als auch die Verwendung eines perfusionsbasierten Systems stellen effiziente und kostengünstige Lösungen zur Herstellung eines ECM-basierten Biomaterials dar, das nach der Solubilisierung in der Forschung und möglicherweise im klinischen Umfeld eingesetzt werden könnte. Es besteht Potenzial in der Bewertung der Wirksamkeit dieses Biomaterials durch die Rekapitulation einer optimalen Nische für die Pankreasinseln und für insulinproduzierende Zellen, um die langfristige Zellerhaltung, Lebensfähigkeit und zelluläre Differenzierung zu verbessern.

Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen, die von einem der Koautoren angegeben werden müssen.

Dieses Projekt wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 646272 gefördert. Die humanen Pankreasinseln wurden von Prodo Laboratories, Aliso Viejo, CA 92656, gewonnen.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University