Novas técnicas de microscopia requerem o desenvolvimento de ferramentas adequadas para a compreensão correta dos processos biológicos estudados. Este protocolo descreve as etapas de processamento de imagem necessárias para o rastreamento de molécula única, incluindo estimativa de parâmetros de difusão lateral e quantificação do tamanho da mancha ao longo de toda a sua trajetória na membrana celular. Este protocolo combina o uso de várias peças de software, incluindo ImageJ, MATLAB e uTrack, bem como algumas proteínas que foram desenvolvidas especificamente para este protocolo.
Este método é ilustrado com o rastreamento de receptores de membrana sob microscopia leve, mas pode ser aplicado a qualquer estrutura semelhante a partículas cujas trajetórias podem ser rastreadas ao longo do tempo em uma sequência de vídeo. Esta técnica se relaciona com a pesquisa básica e não tem aplicação direta em um ambiente clínico. No entanto, pode ser utilizado para auxiliar na caracterização de eventos biológicos tanto em diferentes doenças quanto, portanto, na identificação de novos alvos terapêuticos.
Este protocolo é relevante para o rastreamento de partículas em membranas celulares, como mostrado neste vídeo, mas também pode ser aplicado para o rastreamento de células completas, bactérias, nanopartículas em um fluido, ou qualquer outro objeto cujo centro possa ser bem determinado. Este protocolo é fácil de usar e requer apenas conhecimento de cultura celular e técnicas de microscopia. As diferentes técnicas e ferramentas de informática empregadas neste protocolo podem intimidar um novo usuário.
A demonstração visual ajuda a usar essa técnica com confiança. Para começar, cresça células Jurkat, transfem-nas com um vetor receptor de quimioterapia monomérica com células registradas em GFP e selecionem células com baixos níveis de expressão do vetor rotulado, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Adicione mídia contendo o ligante CXCL12 ou controle de mídia a cada pratos de microwell de 35 milímetros revestidos de fibronectina que foram revestidos com fibronectina, e incubar por uma hora a 37 graus Celsius.
Em seguida, adicione células classificadas a cada prato e incubar por 20 minutos antes de fotografar as células. Após a incubação, transfira o primeiro prato de células para um estágio de microscópio TIRF e vire para o objetivo de imersão de óleo de 100x. Localize e foque nas células usando campo brilhante para minimizar os efeitos de fotobleaching.
Em seguida, mude para o modo TIRF e realize um ajuste de foco fino usando baixa intensidade de laser. Adquira filmes de aproximadamente 50 segundos de comprimento, minimizando o intervalo de tempo entre os quadros. Para cada arquivo de vídeo de condição experimental, crie uma nova pasta seguindo as instruções da estrutura de arquivos descritas no protocolo de texto deste vídeo.
Abra o vídeo com Fiji ou ImageJ arrastando e soltando o arquivo na barra de menu fiji e clique em OK para importar o arquivo LIF usando bioformats. Para projetar uma máscara, também importe a imagem multicanal correspondente. Em seguida, crie uma máscara criando primeiro uma única imagem com os canais úteis para o design da máscara.
Selecione Imagem no menu da barra e clique em Cores seguidas de Canais Divididos para mostrar os diferentes canais como imagens separadas. Mescle novamente os três canais em uma única imagem selecionando Imagem no menu da barra, indo para Color e selecionando Canais de Mesclagem. Certifique-se de selecionar os canais apropriados e, em seguida, pressione OK para gerar uma nova imagem não empilhada.
Sincronize as duas janelas indo ao menu da barra, selecionando Analisar e, em seguida, indo para Ferramentas e selecionando Sync Windows. Uma nova janela com as possibilidades de imagem sincronizada será mostrada. Agora, com as duas janelas sincronizadas, a mesma região em ambas as janelas pode ser cortada.
Vá para Imagem no menu do bar e selecione Crop. Com a ferramenta de seleção retangular, desenhe a região de interesse. As duas imagens cortadas mostrarão individualmente.
Em seguida, dessincronizar ambas as janelas. Se nenhuma máscara foi criada, desenhe a região de interesse com a ferramenta de seleção e a cultura. Depois disso, salve o vídeo como uma sequência de imagem no diretório Videosec.
Em seguida, selecione a imagem multicanal, vá para Plugins no menu e selecione Editor de Segmentação para abrir o plugin do editor de segmentação. Escolha a ferramenta de seleção à mão livre e use-a para selecionar um rótulo verde e projetar a máscara mais externa. Uma vez projetado, pressione o botão Plus na opção de seleção da janela composta, e a máscara selecionada será exibida no visualizador.
Repita este passo para todos os rótulos. Uma vez que todas as máscaras são projetadas, salve a máscara com o mesmo nome do arquivo do vídeo, com o nome:máscara.tif. Abra o MATLAB e adicione o diretório uTrack ao caminho, indo para Definir caminho e selecionando Adicionar Com.
Em seguida, mude o Diretório de Trabalho para o diretório contendo a série a ser analisada. Invoque uTrack digitando GUI Seletor de Filme no console e pressionando Enter. Isso fará com que a janela de seleção do filme seja aberta.
Pressione o botão Novo Filme e aguarde que a janela de adição de filme apareça. Pressione no Canal Adicionar para escolher o diretório com o vídeo e preencha os parâmetros de informações do filme. Defina o diretório de saída para os resultados do uTrack para Resultados, em seguida, pressione as Configurações avançadas do canal, preencha os parâmetros relacionados à aquisição e salve.
Depois de criar o filme, pressione continue na janela de seleção de filmes. Aqui, uTrack perguntará sobre o tipo de objeto a ser analisado. Escolha partículas simples e, em seguida, a janela do painel de controle aparecerá.
Em seguida, selecione o primeiro passo, Passo 1:Detecção e clique em Configuração. A janela de encaixe do modelo de mistura gaussiana de configuração aparecerá. Digite as configurações conforme mostrado aqui e pressione Aplicar.
No painel de controle, clique em Executar para executar a etapa de detecção. Após alguns minutos, verifique os resultados pressionando o botão Resultado. O filme mostra círculos vermelhos nas partículas detectadas.
Se nenhum círculo vermelho for mostrado, então este passo não funcionou corretamente e você deve tentar novamente. Agora, mescle as partículas que foram detectadas em faixas que abrangem vários quadros, configurando os parâmetros como mostrado aqui. Em seguida, pressione Executar no painel de controle.
Em seguida, execute a Análise de Faixas. Defina as configurações, como mostrado aqui, e pressione Aplicar e Executar. Verifique os resultados pressionando primeiro o botão Resultado e, em seguida, clique em Mostrar o número da janela de opções de filme e verifique quadro por quadro que cada faixa foi corretamente identificada, marcando manualmente partículas que não são partículas verdadeiras.
No MATLAB, digite o comando como mostrado aqui. Este comando fará com que o programa leia todas as trajetórias e calcule os coeficientes de difusão. Em seguida, exclua trajetórias correspondentes a pontos ou trajetórias incorretamente identificados, dando a lista de pontos a serem excluindo.
Calcule os coeficientes de difusão instantâneas para cada uma das faixas desta célula seguindo o protocolo de texto que acompanha. Neste caso, calcule o coeficiente de difusão para um tempo de atraso é igual a 4 chamado D1 a 4. Quando terminar, decomponha as trajetórias em trajetórias curtas e longas.
Para analisar longas trajetórias, digite o comando como mostrado aqui para classificar o tipo de movimento através de seu espectro de escala de momentos. Analise a intensidade de cada partícula ao longo de sua trajetória. Configure esse comportamento básico de muitas maneiras diferentes seguindo o protocolo de texto que acompanha.
Em seguida, reúna as informações de difusão e intensidade para todas as trajetórias. Reúna apenas as informações de difusão e intensidade para trajetórias curtas. Por fim, reúna o dimensionamento do espectro de momentos e as informações de intensidade digitando o seguinte, onde há muito tempo é o sufixo usado anteriormente.
O uso das técnicas descritas neste protocolo permite o rastreamento automatizado de partículas detectadas em filmes de microscopia de fluorescência e a análise de suas características dinâmicas. A partir desta análise, pode-se obter características diferentes com base em variações de estímulos. Isso inclui o percentual de manchas imóveis baseadas em quatro estímulos diferentes, a porcentagem de trajetórias longas de mais de 50 quadros e os tipos de movimento ao longo das trajetórias como quebrado por movimentos direcionados, livres ou confinados.
Além disso, o coeficiente de difusão, intensidades médias de manchas e número de receptores por partícula podem ser determinados. Isso mostra a distribuição dos valores de coeficiente de difusão curta para cada ponto em resposta a diferentes estímulos. A linha vermelha representa o valor médio, este gráfico semelhante mostra as intensidades médias de pontos para cada ponto ao longo de seus primeiros 20 quadros em resposta aos mesmos estímulos.
Novamente, a linha vermelha representa o valor médio de intensidade. Como a intensidade média corrigida de uma mancha está relacionada com o número de proteínas fluorescentes presentes neste local, pode-se calcular diretamente o número de receptores por partícula, como mostrado aqui. MATLAB é uma linguagem de programação sensível a casos.
Você pode variar os nomes de variáveis em relação aos descritos neste protocolo, mas certifique-se de ser consistente em sua nomeação. Os nomes das funções não podem ser alterados, e vírgulas, cólons e semi-cólons são importantes para uma sintaxe correta. A microscopia de molécula única permite a visualização de proteínas de membrana individual com resolução espacial-temporal sem precedentes e oferece oportunidades únicas para revelar aspectos não previstos da biologia celular.
Este protocolo abre novas portas para a análise quantitativa de vídeos de microscopia em células e biologia molecular.
