Name: intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model
Uploaded: 2018-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
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Nós gostaríamos de reconhecer Gundula Hertl o seu apoio.

Todos os procedimentos neste protocolo foram aprovados por diretrizes e legislação de bem-estar Animal alemão. Considere o uso de 10 a 12 semanas de idade NMRI nus ratos e camundongos C57Bl/6 (doador: fêmea velha; destinatário: masculino) durante os experimentos. Use Camundongos NMRI para isolamento ilhéu. Manter os ratos sob condições definidas de acordo com regulamentos locais instalações animais.
1. indução do Diabetes por estreptozotocina
<ol><li>Dia -4, medir o peso corporal de 10 a 12 semanas de idade NMRI nude os ratos e camundongos C57Bl/6, usando uma máquina de pesagem.</li>
	<li>De acordo com o peso do corpo medido, prepare uma dose de 180 mg/kg de estreptozotocina em 0,1 mL de soro fisiológico por rato. Nota: Estreptozotocina deve ser recentemente preparada antes do uso e coberta com papel de alumínio, como é sensível à luz.</li>
	<li>Os ratos syngeneic e alogênico injete cada um com uma única dose de 0,1 mL de estreptozotocina (180 mg/kg) intraperitonealmente usando uma agulha de 26-G.</li>
	<li>Dia -3, -2 e -1 coletam 2-4 µ l de sangue por punção das veias de cauda de ratos não jejuou.</li>
	<li>Use 2-4 µ l de amostra de sangue por tira teste para medir a glicose no sangue em camundongos NMRI e camundongos C57Bl/6 Nota: Neste momento, 80% dos ratos devem se tornar diabético (20 mmol/L).<ol>
<li>Use rato para transplante de ilhotas quando seus níveis de glicose atingem 20 mmol/L.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolamento de ilhotas pancreáticas de ratos
<ol><li>Anestesia os ratos com cetamina (100 mg/kg de peso) e xilazina (20 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal com uma agulha de 26-G. Nota: Os volumes de ketamina e xilazina foram determinados de acordo com o peso corporal dos animais (0,10 mL/10g).</li>
	<li>Manter os ratos em posição supina e desinfectar com solução de iodo-povidona. Confirme a eutanásia adequada, verificando o reflexo de pedal. Nota: Em caso de C57Bl/6 raspe a região abdominal.</li>
	<li>Segure a pele com uma pinça fina e fazer uma incisão com uma tesoura para expor na cavidade abdominal. Coloque uma compressa de gaze estéril, o situs intestino para a esquerda e fora da cavidade abdominal.</li>
	<li>Ajustar o estômago em outra direção para localizar o pâncreas e outros associados tecidos.</li>
	<li>Atingir a aorta e fazer um pequeno corte para drenar o sangue. Use gaze esterilizada para absorção de sangue.</li>
	<li>Remova cuidadosamente o intestino. Separe o pâncreas do estômago e baço.</li>
	<li>Excisar o pâncreas e coloque-o em um prato de Petri fresco. Remova todos os materiais indesejados, tais como gordura, usando fórceps.</li>
	<li>Encher uma seringa de 5 mL com 4 mL de colagenase e injetar no pâncreas, com uma agulha de 26-G (solução: 30 mg de colagenase em 12 mL de solução de Hank).</li>
	<li>Picar o pâncreas com uma tesoura para aumentar a área de superfície para uma melhor digestão e transferir para um tubo de tampa vermelha 12 mL. Nota: Hank está equilibrada solução salina: HBSS 10 x (100 mL), penicilina-estreptomicina (10 mL), gentamicina (1 mL), ciprofloxacina (10 mL), HEPES (35 mL), água destilada, H2O (900 mL)</li>
	<li>Execute uma digestão por 10 min a 37 ° C em um banho de água a agitação. Vórtice a amostra três vezes em intervalos regulares por 15 s.</li>
	<li>Misture o pâncreas digerido vigorosamente à mão por 3 min e coloque-o no gelo por 10 s.</li>
	<li>Adicione 6 mL de solução de Hank fria para parar a reação de digestão e centrifugar 560 x g por 3 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e dissolva a pelota em 10 mL de meio de soro (P/FCS) bezerro Parker/fetal à temperatura ambiente. Nota: Média P/FCS: TCM-199 10 x (100 mL), FCS (50 mL), penicilina-estreptomicina (10 mL), HEPES (20 mL), água destilada, H2O (900 mL)</li>
	<li>Identifica as ilhotas com base na sua morfologia (esferoide, cor marrom-dourado) sob um microscópio de luz. Evite ilhotas com centros de escuros. Verifique se há pureza e viabilidade através da realização de ditizona coloração sob um microscópio de luz. Nota: Ditizona vincula-se ao íon zinco e fornece a mancha de cor vermelha para os ilhéus.</li>
	<li>Use uma pipeta de 1 mL para contar e escolher Ilhéus sob um microscópio de luz e transferi-los para um prato de Petri fresco (60 x 15 mm), contendo 4 mL do meio P/FCS. Nota: O volume de P /meio de FCS numa caixa de Petri não deve exceder 4 mL para garantir a disponibilidade de oxigênio.</li>
	<li>Manter as ilhotas isoladas em 4 mL de meio de P/FCS durante a noite a 37 ° C numa incubadora.</li>
</ol>3. preparação dos animais para transplante de ilhotas
<ol><li>Remover as ilhotas isoladas da incubadora a 37 ° C e colocá-los em um banco do fluxo. Centro de Ilhéus com um movimento circular oscilante da caixa de Petri.</li>
	<li>Encha uma seringa de 1 mL (agulha 23-G azul) com 0,1 mL do meio P/FCS. Em seguida, adicione 350 Ilhéus em 0,3 mL de solução de Hank. Manter a seringa na posição vertical para permitir que os ilhéus resolver.</li>
	<li>Diminuir o volume de 0,05 mL e substituir a agulha 23-G azul com uma agulha de 26-G marrom. A mesma seringa, adicione 0,15 mL de Ficoll (médio gradiente de densidade) na parte superior para alcançar um volume final de 0,2 mL na seringa. Evite bolhas de ar.</li>
	<li>Mantenha a seringa na posição vertical e girá-lo ligeiramente para evitar a aglutinação de ilhotas. Os ilhéus vão resolver no cone da seringa dentro de 2-3 min.</li>
	<li>Medir os níveis corpo peso e sangue glicose dos ratos destinatários; os níveis de glicose do sangue devem ser em torno de 20 mmol/L.</li>
	<li>Anestesia os ratos com cetamina (100 mg/kg de peso) e xilazina (20 mg/kg de peso corporal) por injeção intraperitoneal com agulha 26-G.</li>
	<li>Coloque os ratos em posição supina sobre uma placa térmica quente (37 ° C). Verifique a profundidade da anestesia por beliscar o dedo do pé.</li>
	<li>Limpe a região abdominal com solução de iodo-povidona (desinfectante da pele). Para evitar os olhos de secagem, mantê-los húmida com pomada. Nota: Em caso de C57Bl/6 raspe a região abdominal.</li>
</ol>4. ilhéu transplante através da rota Intraportal
<ol><li>No dia 0, começa com uma laparotomia, mantendo a pele com pinças e fazendo um 2-3 cm-incisão longa com uma tesoura. Lugar uma gaze esterilizada molhada comprimir em torno das bordas da ferida para mantê-lo úmido.</li>
	<li>Coloque a compressa de gaze estéril, o situs intestino para a esquerda e fora da cavidade abdominal. Nota: Mantenha o intestino húmidas durante todo o processo com solução de NaCl 0,9% previamente aquecida ou gaze estéril embebido em solução salina normal.</li>
	<li>Mova o duodeno e localize o pâncreas. Localize a veia portal situada no local ventral, empurrando para cima o pâncreas. Usar um dedo e o polegar para expor a veia porta e, uma vez expostos, punção-lo perto do fígado.</li>
	<li>Dentro de 1 min, lentamente e com firmeza Injete os ilhéus (0,2 mL do passo 3.4) a veia porta sob a inspeção de lupa para evitar qualquer vazamento de Ilhéus. Nota: Após a injeção, verifique sempre para Ilhéus remanescentes na seringa. Tome 1 mL de mídia P/FCS em uma seringa, embutida em um prato de Petri fresco e contagem sob um microscópio.</li>
	<li>Coloque um medidor estéril no local da punção e aplicar pressão com o dedo indicador (profundidade de penetração: 0,5-1 cm) por 6 min parar o sangramento. Nota: O volume injetado não deve exceder 0,2 mL. Pressão e volume excessivo podem danificar os ilhéus devido à tensão de cisalhamento.</li>
	<li>Coloque cuidadosamente o intestino situs, peritônio, camada muscular abdominal e fáscia volta à sua posição.</li>
	<li>Usando fórceps, levantar a pele, fechar a incisão do músculo com sutura de seda e a camada superior da pele com clipes de 2-3.</li>
	<li>Limpe a superfície com desinfectante da pele, aplique um curandeiro de ferida e coloque os ratinhos em gaiolas individuais. Ferida curandeiro fornece uma camada de acrilato resistente à água e proteger de maceração e infecção secundária. Nota: Observar os ratos até eles recuperaram a consciência suficiente, fornecer tramadol (0,2 mg / rato) juntamente com líquidos. Neste protocolo, os ratos recuperaram da anestesia rapidamente e administração de tramadol reduziu a dor. Após 7 dias, deve curar a ferida.</li>
	<li>Alimente os ratos com água e comida normal. Excreção de urina e consumo de alimentos e água aumentará após a injeção de estreptozotocina.</li>
	<li>Medir os níveis de glicose de sangue todos os dias durante a primeira semana e depois uma vez por semana em ratos syngeneic. Em camundongos alogênico, medir os níveis de glicose do sangue, três vezes por semana por até 15 dias.</li>
</ol>

<ol>
	<li>McCall, M., Shapiro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+islet+transplantation.">Update on islet transplantation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (7), a007823 (2012).</li><li>Shapiro, A. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+facing+islet+transplantation+for+the+treatment+of+type+1+diabetes+mellitus.">Challenges facing islet transplantation for the treatment of type 1 diabetes mellitus.</a> Journal of Clinical Investigation. 114 (7), 877-883 (2004).</li><li>Su, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+islets+are+essential+for+successful+intraportal+transplantation+in+a+diabetes+mouse+model.">Small islets are essential for successful intraportal transplantation in a diabetes mouse model.</a> Scandinavian Journal of Immunology. 72 (6), 504-510 (2010).</li><li>Rekittke, N. E., Ang, M., Rawat, D., Khatri, R., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+Therapy+of+Type+1+Diabetes+Mellitus:+From+Pancreatic+Islet+Transplantation+to+Mesenchymal+Stem+Cells.">Regenerative Therapy of Type 1 Diabetes Mellitus: From Pancreatic Islet Transplantation to Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells International. 2016, 22 (2016).</li></ol>

Todos os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.

Neste estudo, a rota intraportal de transplante de ilhotas é explorada. Este protocolo é altamente eficaz no alívio de estresse diabética e oferece uma oportunidade em profundidade para explorar estudos de transplante de ilhotas. Este protocolo confirma que cerca de 350 murino ilhotas são capazes de reverter o estado hiperglicêmico. Além disso, nenhum dos ratos morreu durante o procedimento, e o controle glicêmico foi alcançado em todos os destinatários. Níveis de glicose no corpo peso e sangue foram gravados regularmente para refletir a competência, padrão e funcionalidade de ilhotas transplantadas em reverter a hiperglicemia. Em camundongos syngeneically transplantados, níveis de glicose no sangue foram medidos todos os dias durante a primeira semana e uma vez por semana depois disso. Após o transplante de ilhotas, condição hipóxica e outros fatores desencadear as células endoteliais secretam fatores de pro-angiogênico como VEGF após 14 dias e, assim, aumentar o enxerto vascular no fígado, como mostrado na Figura 3. Em camundongos alogênico, níveis de glicose no sangue foram medidos três vezes por semana por até 15 dias. Após 15 dias, ilhotas transplantadas foram rejeitadas no modelo alogênico devido a um ataque imune, a menos que drogas imunossupressoras são administradas
Existem vários protocolos de isolamento ilhéu publicados na literatura10,11. O mais simples é escolher ilhotas manualmente com base no seu tamanho e morfologia após digestão de colagenase. Este é um dos passos cruciais para selecionar somente Ilhéus e evitar as células exócrinas, detritos, etc. Selected Ilhéus deve ser mantidas a 37 ° C durante a noite em uma incubadora para permitir-lhes para se recuperar do estresse mecânico encontrado durante a digestão procedimento. Seleção da dose de estreptozotocina e o transplante de ilhotas intraportal também são chave para este protocolo. A temperatura corporal deve ser regulamentada e mantido usando uma placa térmica durante todo o procedimento cirúrgico. Gaze estéril deve ser aplicada com a pressão mínima para 6 min no local da punção para evitar sangramento. Os ratos devem ser mantidos sob observação até recobra a consciência suficiente.
Determinadas etapas neste protocolo podem ser modificadas. Por exemplo, a otimização do tempo de digestão e o volume de colagenase podem aumentar o rendimento de ilhotas em cepas de ratos diferentes. Em vez da indução rápida do diabetes (180 mg/kg de estreptozotocina), aumentar lentamente a hiperglicemia pode ser induzida usando uma dose mais baixa durante um período prolongado de tempo (por exemplo, 40 mg/kg/estreptozotocina dia durante 5 dias consecutivos). Isto poderia fornecer melhor enxertia de ilhotas transplantadas. Outros sites, tais como a medula óssea, bolsa omental, região intramuscular, superfície da mucosa gástrica, baço e rins podem ser explorados como alternativas para a veia intraportal.
Pobre enxertia de ilhotas transplantadas é ainda uma grande preocupação em ensaios clínicos. Outros incluem uma escassez de doadores, inconsistências na manutenção de níveis de glicose no sangue após o transplante, imunossupressão e reações mediadas por sangue12,13. Falta de métodos para avaliar a enxertia adequada é outro obstáculo. Transplante de ilhotas de rastreamento por ressonância magnética ou imagens de bioluminescência possivelmente poderia substituir os métodos clássicos tais como o teste de tolerância à glicose ou peptídeo-c. No futuro, poderá fornecer as células-tronco transplantadas juntamente com ilhotas nutricional e imunomoduladores suporte14.

Transplante de ilhotas é uma abordagem promissora para tratar o tipo 1 diabetes mellitus1. A primeira tentativa de transferir um fragmento do pâncreas de ovelhas em um paciente diabético foi realizada por Watson Williams em 1893. No entanto, um grande avanço em transplante clínico ilhéu foi alcançado com o protocolo de Edmonton, e daí em diante, uma série de programas nacionais foram desenvolvidos2. No passado, vários sites, tais como a medula óssea, bolsa omental, região intramuscular, superfície da mucosa gástrica, baço e cápsula renal, foram explorados em modelos pré-clínicos, mas o sistema venoso portal é considerado como um do local adequado e eficaz para programas clínicos3,4,5,6.
Administração exógena de insulina pode ser substituída por infusão ilhéu na veia portal. Isto é considerado um local preferido, porque o suprimento de oxigênio é comparável ao que no pâncreas nativo devido a localização a jusante da confluência do portal artéria e veia. Além disso, há uma grande área de superfície, para que a estrutura tridimensional dos ilhéus pode ser preservada, e vascularização poderia ser facilitado5. Em um rato diabético destinatário, 2.000 equivalentes humanos ou suínos ilhéu ou 350 rato ilhotas são suficientes para reverter o estado hiperglicêmico7,8. Euglicêmico níveis foram relatados por 15 dias no modelo destinatário de rato de ilhotas xenogénicas e no modelo do rato para alogênico e por mais de 120 dias no syngeneic-rato para transplante.
Fatores relevantes para a eficácia do transplante de ilhotas através da veia porta são anestesia adequada, método de punção e hemostasia9. Anestesia pode ser induzida por inalação (5% de isoflurano) ou injeção (cetamina, xilazina ou pentobarbital), e as substâncias são muitas vezes combinadas. Para controle da profundidade e tempo de anestesia, deve ser dada atenção ao estado do mouse, como a cor da membrana mucosa, tampa do olho, reflexo corneal, frequência respiratória e temperatura corporal. É importante assegurar que o animal não está se esforçando e que sobreviva a operação. A temperatura pode ser mantida por aquecimento de diferentes dispositivos, como almofadas de aquecimento, lâmpadas de luz vermelha, etc. A quente chapa térmica tem sido usada para manter uma temperatura de 25-30 ° C entre o rato e a mesa de operação, o que impede a ocorrência de hipotermia. As doses dos anestésicos são importantes, porque todos eles são metabolizados pelo fígado, e a função hepática pode ser transitoriamente desordenada por infusão de suspensão o ilhéu. O ponto de punção ideal para a veia porta é a posição entre a primeira e a segunda veia tributário.
O número de Ilhéus e o volume de injeção se destina também influencia o resultado do transplante, como um volume excessivo pode aumentar a tensão de cisalhamento. Um volume de 0,2 mL é considerado adequado para o transplante de ilhotas na veia portal. A ferida puncionar (agulha de calibre 26) induz sangramento da veia portal, que precisa ser interrompido de forma oportuna e eficaz. Gaze estéril ou um dedo pode ser aplicado com pressão mínima no local da punção por cerca de 6 min parar o sangramento. Tomados juntos, portal ilhéu injeção é eficaz e oferece o Regulamento sobre níveis de glicose em modelos do rato diabético quimicamente induzida.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>BALB/c mice</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>NMRI nude mice</td><td>Charles River (Sulzfeld, Germany)</td><td></td><td>(10-12 weeks)</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Bela-pharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CEVA TIERGESUNDHEIT GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 23G and 26G needle</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gauze</td><td>Fuhrmann</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Shaking Water bath</td><td>Kotterman</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Braun</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Meter&amp;nbsp;</td><td>One Touch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm Thermal Plate</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braunol (povidone-iodide solution)</td><td>B.Braun Melsungen AG</td><td>3864154</td><td></td></tr><tr><td>Liposic Edo - Sprinkled Ointment (eye ointment)</td><td>Dr. G Mann Chem.-Pharm.&amp;nbsp; GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fa. Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Bench</td><td>Herdus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Silk Suture Vicryl</td><td>Braun</td><td></td><td>(7.5 *1.75mm)</td></tr><tr><td>Michel Clamps (clips)</td><td>Aesculap&amp;nbsp;</td><td>BN507R</td><td></td></tr><tr><td>P/FCS Solution</td><td>Gibco</td><td>21180-021</td><td></td></tr><tr><td>TCM-199 (10x)</td><td>Gibco</td><td>21180-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Biochrom</td><td>L 1613</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Solution</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocin</td><td>Calbiochem</td><td>572204</td><td></td></tr><tr><td>OPSITE-spray (wound healer)</td><td>Smith and nephew</td><td>66004978</td><td></td></tr><tr><td>Reugular food</td><td>Altromin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Head light LED 16042 (magnifying glass)</td><td>Eschenbach</td><td>16042</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse PECAM-1(CD31) monoclonal primary antibody</td><td>Millipore, Chemicon</td><td>CBL1337</td><td>Dilution (1:100)</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat secondary antibody</td><td>Dianova</td><td>712095153</td><td>Dilution (1:400)</td></tr><tr><td>Polyclonal guinea pig anti-insulin primay antibody</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Dilution (1:500)</td></tr><tr><td>Donkey anti-guinea pig secondary antibody</td><td>Dianova</td><td>706-259-148</td><td>Dilution (1:400)</td></tr></tbody></table>

intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model

Transplante de ilhotas pancreáticas para reduzir a hiperglicemia é altamente bem sucedido em roedores com diabetes quimicamente induzida. O local mais comum de transplante em transplante experimental de ilhotas é a cápsula renal. No entanto, quanto menos se sabe sobre a interação das ilhotas pancreáticas com componentes do sangue, também faz sentido utilizar a abordagem da veia porta em transplante experimental de ilhotas.
Este protocolo demonstra uma técnica de transplante de ilhotas intraportal em camundongos NMRI. Estreptozotocina (180 mg/kg) é injetada intraperitonealmente para induzir hiperglicemia em ratos do destinatários. Eles são considerados como diabético a um nível de glicose do sangue não-jejum maiores que 20 mmol/L. Um dia antes da transplantação, ilhotas pancreáticas do mouse são isoladas do pâncreas de doador por digestão de colagenase; um mínimo de 350 ilhéus são utilizados por beneficiário diabético. Dependendo do rendimento de isolamento ilhéu, dois ou mais ratos de doador são utilizados por beneficiário. Depois da cultura durante a noite a 37 ° C, ilhotas são administradas para o destinatário fígado através da veia portal. Após a cirurgia, os ratos são protegidos em casas de Makrolon vermelhas e observados até está acordado. Esse protocolo mantém controle glicêmico para 120 dias em camundongos syngeneic e 15 dias em ratos alogênico.

Estudou-se a competência de ilhotas transplantadas em ratos diabéticos induzidos quimicamente. Os ilhéus foram transplantados através do sistema venoso portal no modelo de ratos diabéticos. A relação de doador-beneficiário foi 2:1. No modelo de rato syngeneic, dois ratos de doadores foram utilizados para obter 350 Ilhéus. Os ilhéus foram então transplantados em ratos diabéticos. No dia 1 observou-se uma redução no nível de glicose no sangue após transplante, sugerindo um papel de ilhotas do pâncreas transplantados em reduzir o nível de glicose no sangue. Estreptozotocina aumentou o nível de glicose do sangue até aproximadamente 22 mmol/L. Uma queda do nível de glicose do sangue para 4,6 mmol/L (dia 1) foi observada após transplante de ilhotas (figura 1A). Normoglycemia foi mantida até 121 dias, conforme mostrado na figura 1A. O nível de glicose no corpo peso e sangue aproximadamente seguia o mesmo padrão. Após a injeção de estreptozotocina e cirurgia, diminuiu o peso do corpo. 2 dia em diante, ele tendia a se elevam em direção normal, de 25,3 g (dia 4) para 29,7 g (dia 121), como mostrado na figura 1B.
Em caso de histocompatibilidade (MHC) ratos incompatíveis, 350 ilhotas de dois camundongos C57Bl/6 (H2d) foram transplantados para diabéticos camundongos BALB/c (H2b). Após injeção de estreptozotocina, a glicose no sangue aumentou até 26,6 mmol/L. Após transplante de ilhotas, o nível de glicose no sangue caiu para 4,4 mmol/L (dia 1; Figura 2A). Normoglycemia (4.44 a 7.2 mmol/L) foi observado por até 10 dias, mas não depois de 15 dias (20.1 mmol/L). O peso corporal de ratos diabéticos caiu de 26 g (dia -3) para 23 g (dia 0) e na sequência de 21,5 g (dia 1). Após o transplante, o peso do corpo gradualmente recuperou 23 g (dia 2) a 25 g (dia 10). Devido à incompatibilidade de MHC, aumentou o nível de glicose no sangue e o peso corporal diminuiu 10 dias após o transplante de ilhotas (Figura 2B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig1.jpg"> Figura 1 : Efeito do transplante de ilhotas syngeneic. (A) o nível de glicose no sangue foi medido em pontos de tempo diferentes em ratos diabéticos induzido por estreptozotocina (n = 3). Uma única dose de estreptozotocina (180 mg/kg) foi injetada antes do transplante de ilhotas de 350 para cada destinatário (dia 0). O nível de glicose do sangue (mmol/L) foi medido por 121 dias (dia -3: 17 ± 2,3; dia 0: 22,6 ± 1; dia 1: 4,6 ± 0,3; dia 5: 7,5 ± 0,4; e dia 121: 5,3 ± 0,09). (B) aumento no peso corporal após transplante de ilhotas. Os dados acima representam a média ± desvio-padrão. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig2.jpg"> Figura 2 : Efeito de transplante alogênico ilhéu. (A) o nível de glicose no sangue foi medido em pontos de tempo diferentes em ratos diabéticos induzido por estreptozotocina (n = 2). Uma única dose de estreptozotocina (180 mg/kg) foi injetada antes do transplante de ilhotas pancreáticas 350 (dia 0). O nível de glicose do sangue (mmol/L) foi medido por até 15 dias (dia -1: 25,5 ± 5,3; dia 0: 26,6 ± 1,4; dia 2:8 ± 0,9; dia 10: 6,2 ± 0,08; e dia 15: 20,1 ± 1,6). Normoglycemic estado foi mantido por até 10 dias e, posteriormente, as concentrações de glucose do sangue aumentaram. (B) acompanhamento do peso corporal antes e após o transplante de ilhotas. Os dados representam a média ± desvio-padrão. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57559/57559fig3.jpg"> Figura 3 : Imagens de immunostaining representante das ilhotas do pâncreas transplantadas no fígado: Lave a fígado seção (5 µm) com PBS, bloco com soro de burro de 10%, seguido de incubação overnight a 4 ° C, com o anticorpo primário de insulina (1: 500) e plaquetas célula endotelial adesão molécula PECAM-1 anticorpo primário (1: 100). No dia seguinte, mancha com anticorpos secundários por 1h, lave com PBS, mancha de contador com Hoechst e capturar as imagens com Leica microscópio fluorescente. <a href="/files/ftp_upload/57559/57559fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

Intraportal transplante de ilhotas pancreáticas no modelo de Mouse

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

9.4K visualizações.  Clinical Research Lab. Transplante de ilhotas pancreáticas é uma maneira de conseguir normoglycemia no diabetes tipo 1. Este artigo centra-se na técnica de transplante através da rota intraportal para manter os níveis normais de glicose em ratos diabéticos.

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A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Medicina

Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

Transplante de ilhotas pancreáticas para a cápsula renal de ratos diabéticos

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

Biologia

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Transplante de islotes apoiado em andaimes na almofada de gordura epidídmica de ratos diabéticos

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Bioengenharia

Mouse Model for Pancreas Transplantation Using a Modified Cuff Technique

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the availability of the widest range of molecular probes and reagents to perform in vivo as well as in vitro studies. Based on our experience with various murine transplantation models, we developed a heterotopic pancreas transplantation model in mice with the intent to analyze mechanisms underlying severe ischemia reperfusion injury-associated early graft damage. In contrast to previously described techniques using suture techniques, herein we describe a new procedure using a non-suture cuff technique. 
In recent years, we have performed more than 300 pancreas transplantations in mice with an overall success rate of &gt;90%, a success rate never described before in mouse pancreas transplantation. The backbone of this non-suture cuff technique for graft revascularization consists of two major steps: (I) pulling the recipient vessel over a polyethylene/polyamide cuff and fixing it with a circumferential ligature, and (II) placing the donor vessel over the everted recipient vessel and fixing it with a second circumferential ligature. The resultant continuity of the endothelial layer results in less thrombogenic lesions with high patency rates and, finally, high success rates.
In this model, arterial anastomosis is achieved by pulling the abdominal aorta of the donor graft over the everted common carotid artery of the recipient animal. Venous drainage of the graft is achieved by pulling the portal vein of the graft over the everted external jugular vein of the recipient. This manuscript provides details and crucial steps of the organ recovery and organ implantation procedures, which will allow researchers with microsurgical skills to perform the transplantation successfully in their laboratories.

Among abdominal solid organ transplantation, pancreatic grafts are prone to develop severe ischemia reperfusion injury-associated graft damage, leading eventually to early graft loss. This protocol describes a model of murine pancreas transplantation using a non-suture cuff technique, ideally suited for analyzing these early, deleterious damages.

Modelo do rato para transplante de pâncreas, usando uma técnica modificada do manguito

Mouse models have several advantages in transplantation research, including easy handling, a variety of genetically well-defined strains, and the ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

Modelo de transplante de tecido adiposo branco subcutâneo inguinal (ISWAT) de Isletas murina

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Minimizando o sangramento da veia do portal pós-infusão durante o transplante de ilhotas intrahápticas em camundongos

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging study, with an abdominal imaging window, enabled visualization of the cellular dynamics in abdominal organs in vivo. However, due to the soft sheet-like architecture of the mouse pancreas that can be easily influenced by physiologic movement (e.g., peristalsis and respiration), it was difficult to perform stabilized longitudinal in vivo imaging over several weeks at the cellular level to identify, track, and quantify islets or cancer cells in the mouse pancreas. Herein, we describe a method for implanting a novel supporting base, an integrated pancreatic intravital imaging window, that can spatially separate the pancreas from the bowel for longitudinal time-lapse intravital imaging of the pancreas microstructure. Longitudinal in vivo imaging with the imaging window enables stable visualization, allowing for the tracking of islets over a period of 3 weeks and high-resolution three-dimensional imaging of the microstructure, as evidenced here in an orthotopic pancreatic cancer model. With our method, further intravital imaging studies can elucidate the pathophysiology of various diseases involving the pancreas at the cellular level.

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

In vivo high-resolution imaging of the pancreas was facilitated with the pancreatic intravital imaging window.

Visualização de nível celular longitudinal estabilizada do pâncreas em um modelo murino com uma janela de imagem intravital pancreática

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Um método de transplante de ilhotas para o omento no Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Grafting Pancreatic Islets: A Method to Implant Pancreatic Islets into the Anterior Chamber of the Mouse Eye for In Vivo Imaging

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61234/" target="_blank">A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the Anterior Eye Chamber</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This video describes the protocol for grafting human pancreatic islets into the anterior chamber of the mouse&#8217;s eye to monitor revascularization of human islet grafts in vivo. It also helps to understand the contribution of recipient versus donor cells in promoting the encapsulation and vascularization of the graft.

Enxertia de ilhotas pancreáticas: um método para implantar ilhotas pancreáticas na câmara anterior do olho do camundongo para imagens in vivo

Source: Nilsson, J.et. al.&#160;A Longitudinal In Vivo Imaging and Quantification of Human Pancreatic Islet Grafting and Contributing Host Cells in the ...