Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de General Medical Ciências, dos institutos nacionais de saúde, sob número de prêmio R35GM124868 e pela Duke University.

1. configuração de Layout e alinhamento
<ol>
	<li>Instalação e colimação de excitação o rastreamento a laser<ol>
		<li>Apor o laser à tabela óptico usando um monte de casa construída. A montagem é uma placa de alumínio simples com furos para a cabeça do laser e óptica mesa de montagem. O laser deve ser firmemente presa para um monte de metal para a estabilidade e a dissipação de calor. Para este trabalho, use um 488 nm laser de estado sólido para iluminação (Figura 1), embora o comprimento de onda pode ser selecionado para atender um determinado fluoróforo ou experimentar. Um fator crítico é que o comprimento de onda do laser se encaixam a escala de trabalho 2D-EOD, que é determinada principalmente pela placa de onda entre os dois defletores (Figura 1: W2). O laser de 488 nm efetivamente pode excitar a verde ou amarela proteína fluorescente (GFP/YFP), que são comuns etiquetas fluorescentes em experimentos de células vivas.</li>
		<li>Ajustar a altura do feixe de laser e direção usando um par de espelhos dieléctricos (Figura 1: M). Certifique-se de que o feixe de laser é paralelo à tabela óptica e ajustá-lo a uma altura adequada. Nota: A altura deve ser escolhida com base na plataforma do microscópio. Esta altura deve ser mantida para todos os espelhos subsequentes utilizados neste protocolo, embora isso não vai ser declarado explicitamente.</li>
		<li>Desbloqueem o feixe com um par de lentes (Figura 1: L1 e L2). As distâncias focais das lentes deve ser escolhidas com cuidado para evitar o ponto do laser sendo cortado pela abertura da 2D-EOD. Recorte é evidente por uma mudança na forma feixe do laser após a passagem com a 2D-EOD. A qualidade da colimação aqui é muito importante porque as aberrações vão ser amplificadas por lentes subsequentes e qualquer divergência deteriora o desempenho da deflexão 2D-EOD. Idealmente, Desbloqueem o feixe, centrando-se o raio de um ponto de pelo menos 20 metros de distância.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque uma pinhole (Figura 1: PH) de tamanho apropriado no foco da primeira lente de colimação (Figura 1: L1).<ol>
		<li>Escolha um tamanho adequado pinhole. O tamanho do pinhole pode ser escolhido com base no seguinte cálculo: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Onde λ é o comprimento de onda do laser, f é a distância focal da lente primeira, e D é o diâmetro do feixe de entrada.</li>
		<li>Monte o pinhole num palco 3D tradução para que ele pode ser colocado precisamente no foco da primeira lente de colimação.</li>
		<li>Ajuste a posição do pinhole. Coloque um medidor de energia do laser após o pinhole e ajustar a posição de pinhole na XYZ para maximizar a leitura do medidor de energia. Se for observado um anel de difração, bloqueá-lo com uma íris colocada antes a 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação do polarizador de Glan-Thompson<ol>
		<li>Colocar o polarizador de Glan-Thompson (Figura 1: GP) após a segunda lente de colimação (Figura 1: L2) para limpar a polarização do feixe de laser. Gire o polarizador para encontrar a máxima de transmissão com o medidor de energia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação de EODs<ol>
		<li>Use 2 EODs (Figura 1: EOD1 &#38; EOD2) para desviar o laser nas direções X e Y. Maximize a transmissão do laser, ajustando a guinada, o passo e a altura de cada EOD.</li>
		<li>Alinhe os dois EODs em relação uns aos outros usando o marcador de alinhamento fornecido pelo fabricante do lado de cada defletor.</li>
		<li>Aplica um teste padrão para o controlador da EOD-2D para inspecionar a saída da EOD. Isso pode ser visita do cavaleiro (Figura 2) via o FPGA descrito abaixo ou uma onda de seno simples fornecida por um gerador de função. Para o melhor desempenho, a deflexão por cada defletor deve ser paralela à direção X ou Y de nanopositioner o piezo. Neste sentido é ditado pela direção angular dos defletores sobre o eixo de transmissão. Para girar a direção de deflexão sem mover a 2D-EOD, coloque um prisma pomba após a EOD-2D para alinhar os eixos de deflexão para os eixos de nanopositioner piezo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação da placa de meia onda<ol>
		<li>Coloque uma placa de meia onda (Figura 1: W1) entre o polarizador de Glan-Thompson (Figura 1: GP) e a EOD-2D para ajustar o laser entrado feixe de polarização com os eixos de deflexão da 2D-EOD. Coloque uma lente longa focal (300 mm) após a 2D-EOD e uma câmera de sCMOS no foco do laser. Em seguida, ligue o EOD-2D para gerar visita do cavaleiro descrita a seguir (Figura 2). Gire a placa de meia onda até uma distribuição uniformemente quadrado do laser é observada na câmera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação de um feixe de gastar lente par e par de lente do relé<ol>
		<li>Colocar um par de lentes (Figura 1: L3 e L4) após a EOD-2D para expandir o feixe para preencher a abertura traseira da lente objetiva (Figura 1: OL) e outro par de lentes (Figura 1: L5 e L6) para relé do plano focal para o objectivo de microscópio. Não se esqueça de deixar espaço suficiente entre estes dois pares de lentes, como a lente de TAG será instalada entre eles em uma etapa posterior.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instale o filtro dicroico, divisor de feixe 10/90, com foco, lente, APD, objectiva e filtro de emissão de fluorescência para completar o percurso da deteção.<ol>
		<li>Instale o filtro dicroico (Figura 1: DC) para refletir o laser em direção da lente objetiva. Ajustar o laser para ir em linha reta através do centro da lente objetiva usando duas íris na parte superior e inferior de um tubo de lente longa.</li>
		<li>Instalar um divisor de feixe 10/90 (Figura 1: BS) por que 10% da luz é refletida para geração de imagens por uma câmera de sCMOS (descritas abaixo) e 90% de passes através da APD para rastreamento.</li>
		<li>Alinhe a APD. Concentre-se o laser sobre uma lamela pela lente objetiva. Use o reflexo da lamela para alinhar elementos tudo a jusante, colocando uma lamela no foco objetivo e verificar a intensidade da leitura do APD. Depois o divisor de feixe, instalar a APD lente de focalização (Figura 1: L7) seguido da APD em uma cena 3D tradução. Colocar a lente forma a reflexão do laser do objectivo atravessa o centro da lente.</li></ol></li></ol>A posição da APD pode ser otimizada ajustando a posição 3D para maximizar a intensidade da reflexão do laser sobre a lamela. A posição da APD está na posição ideal quando uma mudança da posição do detector em qualquer direção diminui a intensidade.
		<li>Instalar um filtro de emissão de fluorescência longpass (Figura 1: F) antes do divisor de feixe para remover a luz refletida e dispersa.</li>
	
	
	<li>Instalação da lente TAG<ol>
		<li>Colocar a TAG lente entre os dois pares de lentes (entre Figura 1: L4 e L5) como mencionado antes e mostrado na Figura 1. Ajuste a guinada, densidade, altura e posição lateral de forma a que o feixe passa perpendicularmente através das lentes do centro da TAG.</li>
	</ol>
	</li>

2... preparação da amostra.
<ol>
	<li>Preparação de partículas fixas<ol>
		<li>Diluir a 190 grânulos fluorescentes de nm para ~ 5 × 108 grânulos/mL em PBS. Adicionar solução de grânulos 400 µ l sobre uma lamela e montagem no suporte da amostra da fase piezoeléctrico (o volume de contas dependerá do porta-amostras; o diâmetro da câmara de titular de amostra usado aqui é de 18 mm). Para os grânulos usados aqui, PBS faz com que as partículas depositar na lamela.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparação de partículas em movimento livre<ol>
		<li>Diluir a 110 grânulos fluorescentes de nm para ~ 5 × 108 grânulos/mL com água. Adicionar 400 µ l de solução de grânulos no sentido uma lamela e monte no porta-amostras da fase piezoelétrico.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. otimizar parâmetros de controle
<ol>
	<li>Raster scan partículas fixas<ol>
		<li>Colocar uma amostra de partículas fixas no microscópio.</li>
		<li>Liga o laser, micropositioner controlador, piezo nanopositioner controlador, controlador de lente de TAG e controlador de EOD. Observe que a ordem não é crítica. Execute o nanopositioner piezo em circuito fechado.</li>
		<li>Raster scan a amostra em XYZ usando um personalizado varredura programa de software (Figura S3, software disponível mediante solicitação dos autores), que dirige a 2D-EOD em uma visita cavaleiro (Figura 2), recolhe contagens da APD, dirige o piezo nanopositioner e realiza o cálculo de posição (Figura S2). O tamanho do passo é 40 nm e o intervalo de varredura é de 2 µm.<ol>
			<li>Para colocar a lamela no foco do objectivo, retire o filtro de emissão de fluorescência e usar a reflexão do laser da lamela para maximizar a intensidade do sinal em função da posição Z da micropositioner. Depois de colocar a amostra no plano focal, coloque de volta o filtro de emissão de fluorescência.</li>
			<li>Abra o programa de digitalização. Defina o intervalo de varredura e o tamanho do passo, digitando o número em 'start', 'Concluir' e 'passo'. Primeiro defina um grande intervalo de varredura e o tamanho do passo para localizar uma partícula (por exemplo, 10 x 10 µm escala com tamanho de passo 200 nm). Depois de encontrar a partícula, o intervalo de varredura de encolher e diminuir o tamanho do passo (por exemplo, 2 x 2 µm escala com tamanho de passo de 100 nm). Clique no botão de 'digitalizar' para executar uma varredura de quadriculação 3D para encontrar o foco fluorescente.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configurações de lente de marca (ver também Figura 3)<ol>
		<li>Clique sobre o software de controle de lente de TAG. Clique em 'conectar', 'alimentação ligada' sequencialmente.</li>
		<li>Para alterar a fase de saída dos sinais de gatilho, é necessário alterar o modo de gatilho de saída. Primeiro, altere o modo de 'RGB' para 'Multiplane' e depois mudar de volta. Agora a fase pode ser alterado (Figura 3b).</li>
		<li>Defina a fase de saída a ser 0 °, 90 ° e 270 °. Enquanto podem ser usadas qualquer três fases que cobrem o espaço de fase, estes três são encontrados para trabalhar bem empiricamente (Figura 3C).</li>
		<li>Selecione a configuração de frequência de 68.500 Hz.</li>
		<li>Para encontrar a frequência ideal é muitas vezes necessário alterar o intervalo de pesquisa de frequência. Clique em 'avançadas', 'configuração'. Alterar o ' Max. Freq(Hz)' da coluna 0 de 70.000 Hz Hz 71.500. Isto pode ser ajustado para qualquer faixa de frequência é apropriada. Clique em 'Salvar calibração', 'Exit calibração' (Figura 3d).</li>
		<li>Para tornar a nova calibração eficaz, alternar a ressonância para outra frequência (por exemplo, 189.150 Hz) e então volta para a configuração de frequência de 68.500 Hz (Figura 3e).</li>
		<li>Mude gradualmente a amplitude de 35%. Clique em 'Bloquear ressonância'. Após a frequência estiver bloqueada, clique em 'Desbloquear ressonância' (Figura 3e). A lente de TAG está pronta para usar agora.</li>
		<li>Para calibrar, alterar os parâmetros que são usados na estimativa para tornar a posição estimada igual à posição real, como mostrado na Figura 4e, f. entrada do intervalo de varredura de x, y, e z e, em seguida, clique o 'scan' botão para digitalizar a amostra em XYZ para mover o partícula através o ponto do laser em movimento. A posição da partícula como digitalização através do foco do laser deve concordar com a posição de partícula estimada determinada pelo loop de estimativa de posição (Figura S1). A relação entre a posição estimada e a verdadeira posição (Figura 4D) pode ser extraída imagens posição estimada (Figura 4f). Se as posições não concordar, ajuste os valores de posição do laser (ck) usado no loop de estimativa de posição (Figura S1).</li>
		<li>Alinhar a lente de TAG<ol>
			<li>Quando o controlador de lente TAG está desligado, o raster imagens de partícula (descritas abaixo) tiradas antes de instalar o lente de TAG e depois instalando lente TAG deve olhar idêntico digitalizadas. Em seguida, execute a pilha de partícula fluorescente Z digitalização movendo o objectivo com o nanopositioner de z para ajustar a posição e o ângulo da lente de TAG (Figura 4). Ajuste a posição da lente TAG até que não haja nenhum desvio nas imagens de partícula no plano XY na direção Z, que é alcançada quando não há alteração na posição XY da partícula em função da posição Z (Figura 4D). O sistema de rastreamento é pronto para uso após o alinhamento da lente TAG.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalação da câmera de sCMOS para o monitoramento de partículas<ol>
		<li>Instale uma câmera sCMOS para visualizar as partículas enquanto eles estão sendo controlados. Instale o sCMOS somente depois que todos os componentes do sistema de rastreamento foram instalados e otimizados.</li></ol></li></ol>Carregar uma amostra de partículas fluorescentes fixo sobre o microscópio e execute o programa de rastreamento para bloquear uma partícula do volume focal objectiva. Em seguida, instale a lente de distância focal de 100 mm (Figura 1: L8) e sCMOS. Ajuste a posição de sCMOS para que a imagem da partícula é focada para o ponto de menor e mais brilhante.
	
	

4. em tempo real 3D Tracking de difundir livremente nanopartículas
<ol>
	<li>Coloque o 110 nm livre movendo-se a amostra de partículas no microscópio.</li>
	<li>Liga do laser, posicionador micro controlador, piezo nanopositioner controller, controlador de lente de TAG e controlador de EOD. Execute o nanopositioner piezo em malha aberta. Defina o TAG lente software conforme item 3.2.</li>
	<li>Abrir e executar o software de rastreamento (disponível mediante solicitação dos autores). Defina a posição de parâmetros de avaliação para seus valores otimizados, que foram encontrados na secção 3.</li>
	<li>Para colocar a lamela no foco do objectivo, retire o filtro de emissão de fluorescência e usar a reflexão do laser da lamela para maximizar a intensidade do sinal em função da posição Z da micropositioner. Depois de encontrar a lamela, aumente o foco posição 15 µm para focalizar o laser longe a lamela e para a solução. Coloque de volta o filtro de emissão de fluorescência.</li>
	<li>Defina as constantes de controle integral. As constantes de controle integral podem ser definidas, começando com um valor baixo e lentamente aumentando até oscilações podem ser vistas em leituras de posição da partícula. Uma vez que as oscilações são observadas, defina as constantes de controle integral para 80% do valor causando as oscilações. Valores típicos será em torno de 0,012 para o 'ganho integral' de XY e 0,004 para o Z 'ganho integral'.</li>
	<li>Definir os limiares de rastreamento em 'Limite de faixa' e 'Mínimo faixa' e começar o experimento de controle, clicando em 'Search' e 'Auto Track'. O limiar para o rastreamento de terminação é definido ligeiramente superior ao nível de plano de fundo e o limiar para desencadeamento de rastreamento é cerca de duas vezes superior ao fundo. Aqui, o limiar para desencadeamento de rastreamento é de 3 kHz e o limiar para acabar com a trajetória é 1,5 kHz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Embora muitas variedades de 3D única partícula métodos de rastreamento têm surgido nos últimos anos, robusto acompanhamento em tempo real de difusão 3D de alta velocidade em taxas de contagem de fótons de baixa com uma configuração simples ainda é um desafio, o que limita sua aplicação biológica importante problemas. O método 3D-DyPLoT descrito em endereços este protocolo estes desafios de várias maneiras. Em primeiro lugar, as vias de excitação e deteção são simplificadas muito comparado a outras implementações fazendo alinhamento simples e robusto. Em segundo lugar, o movimento laser ponto e algoritmo de estimativa de posição fornecem estimativas de posição exata para o circuito de retroalimentação, fazendo com que o feedback mais estável. Em terceiro lugar, o intervalo de detecção efetivamente grandes (1 x 1 x 4 µm) do local do laser dinamicamente em movimento permite rastreamento de partículas em movimento rápidos. Para ver por que esta área da deteção grande é fundamental, é importante considerar o tempo de resposta intrínseca do nanopositioner piezoelétrico. Estágios piezoelétrico de alta velocidade têm ressonâncias na ordem de 1 kHz, limitando o tempo de resposta para ser da ordem de 1 ms. em 1 ms, uma 100 nm nanopartículas com um coeficiente de difusão de 4 µm2/s, será difusa em média 90 nm do centro da difração-li volume de deteção mited. Este é apenas o deslocamento médio e verdadeiramente aleatório movimento irá expor a passos muito maiores do que isso, levando à partícula deixando o volume focal e terminando a trajetória atual. A situação é ainda pior para partículas menores, onde cada vez maiores passos difusiva térmicos levam à perda de controle. A área efetivamente grandes de detecção permite que o sistema de rastreamento superar a defasagem fase piezoelétrico intrínseca e recuperar-se de grandes saltos difusiva na posição da partícula, aumentando a robustez geral do mecanismo de acompanhamento. Finalmente, a área de scan amplo permite que o sistema facilmente pegar novas partículas, permitindo trajetórias consecutivas para ser rapidamente adquiriu e grandes conjuntos de dados compilados.
O usuário deve ter em mente que existem algumas etapas críticas. Primeiro, o alinhamento de ambos a 2D-EOD e a lente de TAG são críticos. Ambos devem ser bem alinhados para obter a melhor precisão. Em segundo lugar, os parâmetros que são usados na estimativa posição na digitalização passo fixo de partículas devem ser bem calibrados (ver Figura 4). A posição da partícula estimado deve coincidir com a posição da partícula correspondente ao centro da gama de varredura a laser. Finalmente, as constantes integrante do gabarito (Keu) devem ser ajustadas cuidadosamente, começando com um valor pequeno e depois ÓLICAS até oscilações são observadas, em seguida, recuar para cerca de 80% desse valor.
Existem algumas advertências sobre 3D-DyPLoT para manter em mente dependendo da aplicação desejada. Enquanto a estimativa de posição otimizada é projetada para uso com o movimento Browniano, é também adequado para movimento direcional. O algoritmo pode ser aplicado diretamente a qualquer tipo de movimento uma vez que é apenas a incerteza da posição que se presume para ser Gaussian, não a posição da partícula real. Para casos onde persistente movimento linear é esperado, um termo adicional pode ser adicionado ao termo previsão no algoritmo de estimativa de posição (ver equação 3 nas Informações complementares).
A seleção dos parâmetros para o 2D-EOD e a etiqueta deve ser cuidadosamente ponderada, ao configurar o 3D-DyPLoT. De particular importância é o bin tempo utilizado para a visita do cavaleiro verificada pelo 2D-EOD. Em um cenário ideal, excursão do cavaleiro iria ser sincronizado para o período da lente TAG para garantir a amostragem eficiente. No entanto, é fundamental considerar o tempo de resposta da EOD-2D para mudanças na tensão de passo. Para a unidade usada aqui, há um tempo de resposta 2-3 µs após a tensão é aplicada antes do ponto desejado é atingido. Hora 20 µs bin, isto é cerca de 10-15% do tempo a coleção. Reduzindo o tempo para que coincide com o período de lente de TAG de ~ 14 µs aumenta a fração do tempo bin, que é o tempo de latência da 2D-EOD. Isto leva a valores incorretos do laser sobre a posição e posição incorreta estimativas.
Outro fator para o experimentador manter em mente é a resolução temporal. Enquanto os dados mostrados aqui são coletados em uma taxa de dados de 100 kHz, a resolução temporal final é definida em última análise, pelo qual os dados são usados para a medição de posição. Se a leitura do nanopositioner é usada como a posição da partícula (Figura 6), a resolução temporal dependerá do valor da constante controle integral. Por exemplo, para o controle integral, mostrada na Figura 6a–,d, a resposta de fase é da ordem de 1 ms, enquanto que para Figura 6e–h, é da ordem de 10 ms. se mais rápida a resolução temporal é desejada, em seguida, o fóton por fóton resultado do algoritmo de estimação de posição será correlacionar com a taxa de contagem de fótons. Por exemplo, uma taxa de emissão de 10 kHz produz 100 µs resolução temporal e uma taxa de emissão de 100 kHz produz uma resolução temporal de 10 µs. Além disso, desde a precisão segue um <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq2.jpg"> relação41, a precisão espacial e temporal são acoplados. Como resultado, o brilho da sonda determina tanto a precisão espacial e temporal.
Neste protocolo, descrevemos a configuração, layout e alinhamento de partícula única 3D em tempo real, alta velocidade, método que utiliza uma lente de TAG para mover dinamicamente um ponto laser focalizado para obter a estimativa de posição da partícula rápida e 2D-EOD de rastreamento. Em seguida, descrevemos métodos de otimização de preparação e parâmetro de amostra. 3D-DyPLoT fornece um método robusto e relativamente simples de bloqueio para mover-se rápido e humilde, emitindo partículas difusiva. O layout simples óptico permite facilmente adicionado para porta lateral de qualquer stand microscópio existente para que ele pode ser combinado com módulos de imagem. Com este protocolo, esperamos que o RT-3D-SPT pode ser que mais amplamente implementado pelos investigadores mais para resolver rápido, três processos biológicos dimensionais.

O surgimento de técnicas avançadas de imagem abriu uma janela para ver a estrutura cada vez mais detalhada de fenômenos celulares, todo o caminho até o nível molecular. Métodos como reconstrução óptica estocástico microscopia (Tempestade)1,2,3, localização de foto-ativado microscopia (PALM)4,5,6,7 , estruturada iluminação microscopia (SIM)8,9,10,11e estimulou a emissão depleção microscopia (STED)12,13, 14 tem ido muito além do limite de difração para entregar detalhe sem precedentes na estrutura e função das células vivas. No entanto, completo entendimento de como esses sistemas se comportam requer informações dinâmicas, bem como informações estruturais. Os métodos de super-resolução listados acima envolvem um trade-off entre resolução espacial e resolução temporal, limitando a precisão temporal com os quais processos dinâmicos podem ser sondados. Um método que fornece alta precisão espacial e resolução temporal é RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,,27,28,29. Aqui, podemos estabelecer uma distinção entre 3D-SPT tradicional30 e RT-3D-TSC tradicional 3D-SPT requer simplesmente uma séries de dados de imagem tridimensional (que podem ser adquiridos ou usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência dada a configuração certa). 3D-SPT tradicional, as coordenadas da partícula são determinadas após a coleta de dados localizando a partícula em cada pilha de imagem e concatenando os locais em sucessivos volumes para criar uma trajetória. Para esses métodos, a resolução temporal final é determinada pela taxa de imagem volumétrica. Para microscópios confocal, isto é facilmente a escala de segundos para dezenas de segundos. Para métodos de epifluorescência, onde o caminho óptico é manipulado para que as informações de localização axial podem ser extraídas, a resolução temporal é limitada pelo tempo de exposição ou leitura a câmera. Esses métodos de epifluorescente são limitados no intervalo durante o qual axiais informações podem ser coletadas, embora recentes progressos na fase de avião de Fourier máscaras design e óptica adaptativa está ampliando esses intervalos de 10 µm ou mais31,32 , 33 , 34.
Em contraste, RT-3D-SPT não se baseia na aquisição de uma pilha de imagem 3D e encontrar partículas após o fato. Em vez disso, informações de localização em tempo real são extraídas através de detectores de ponto único e gabarito é aplicado para efetivamente "bloquear" a partícula no volume focal da lente objetiva, através do uso de um palco piezoelétrico de alta velocidade. Isto permite a medição contínua da posição da partícula limitada somente por quantos fótons podem ser coletados. Além disso, esse método permite interrogatório espectral da partícula, enquanto se move ao longo de intervalos de tempo. RT-3D-SPT em vigor as forças funciona semelhante a uma armadilha óptica força-livre para objetos de nanoescala, no qual a partícula é continuamente analisada e medida em tempo real sem a necessidade de poderes grandes do laser ou óptico. Dado que o RT-3D-SPT fornece um meio para interrogatório contínuo de objetos rápido difusiva (até 20 µm2/s)25,29 em três dimensões no fóton baixa contagem taxas20,29, 35, ele deve fornecer uma janela em processos biológicos rápidos ou transitórios como transporte intracelular, ligação ao ligante-receptor e a dinâmica extracelular dos virions único. No entanto, a este ponto, a aplicação do RT-3D-SPT tem sido limitada a um punhado de grupos de trabalho para o avanço desta tecnologia.
Uma barreira é a complexidade do layout óptico exigido por métodos de RT-3D-SPT, que são variados. Para a maioria dos métodos, o gabarito ótico é fornecido por um estágio piezoelétrico. Como os partícula faz pequenos movimentos em X, Y, ou Z, leituras de ponto único detectores são convertidos para funções de erro e alimentados em alta velocidade para um nanopositioner piezoeléctrica, que em sua vez move a amostra para neutralizar o movimento da partícula, efetivamente bloqueando-a no lugar em relação a lente objetiva. Para medir pequenos movimentos posicionais em X, Y e Z, vários pontos de excitação ou de múltiplos detectores (4 ou 5 dependendo da implementação)15,18,21 (2-4, o mais baixo do que pode ser aplicado se um bloqueio-em amplificador é usado para extrair o X e Y posição usando um giro laser ponto)25,28 são aplicadas. A sobreposição desses múltiplos pontos de deteção e emissão de dificultar os sistemas alinhar e manter.
Neste documento, apresentamos um método 3D-SPT-mira de alta velocidade com um design óptico simplificado chamado 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT usa um 2D-EOD e um TAG lente36,37,38 para mover dinamicamente um ponto laser focalizado através do volume focal objectivo em uma taxa elevada (50 kHz XY, 70 kHz Z). Combinando a posição do foco do laser e o tempo de chegada do fóton permite que a posição da partícula 3D rapidamente obtidos até no taxas de contagem de fótons de baixa. A 2D-EOD dirige o foco do laser em turnê padrão39 com um tamanho quadrado de 1 x 1 µm no plano X-Y de um cavaleiro e a lente de TAG move o foco do laser no sentido axial, com um intervalo de 2-4 µm. A posição da partícula 3D é obtida com uma estimativa de posição otimizado algoritmo29,40 em 3D. O controle do 3D dinamicamente movente do laser ponto, fotão contando do fotodiodo avalanche (APD), cálculo de posição de partículas em tempo real, gabarito estágio piezoelétrico e gravação de dados são executadas em uma disposição de porta programável do campo (FPGA).Neste protocolo, descrevemos como construir um microscópio 3D-DyPLoT passo a passo, incluindo alinhamento óptico, calibração com partículas fixas e finalmente livre de rastreamento de partículas. Como demonstração, grânulos de fluorescente 110 nm foram rastreados continuamente na água por minutos a uma hora.
O método descrito aqui é uma escolha ideal para qualquer aplicação onde se deseja monitorar continuamente uma sonda fluorescente velozes em níveis baixos de luz, incluindo vírus, nanopartículas e vesículas como endossomos. Em contraste com os métodos anteriores, há apenas uma única excitação e caminho único deteção, fazendo o alinhamento e manutenção simples. Além disso, a área grande de detecção permite que este microscópio facilmente buscar difundir rapidamente partículas, enquanto a capacidade de controlar o nível de sinal baixo (até 10KHz) faz com que este método ideal para aplicações de baixa luminosidade,29.

<table><tbody><tr><td>2D Electro-optic Deflector&amp;nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 required</td></tr><tr><td>Power supply for EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td></tr><tr><td>TAG&amp;nbsp; Lens</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Used to deflect laser along axial direction</td></tr><tr><td>XY piezoelectric nanopositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelectric nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td></tr><tr><td>Micropositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Used to coarsely position sample and evaluate</td></tr><tr><td>Objective Lens</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Used to monitor the particle&#039;s position</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Lower dark counts beneficial</td></tr><tr><td>Field programmable gate array</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking excitation laser</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizer</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Half-wave plate</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dichroic Mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Fluorescence Emission Filter</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Partícula de única tridimensional em tempo real (RT-3D-SPT) de rastreamento tem o potencial de lançar luz sobre os processos rápidos, 3D em sistemas celulares. Apesar de vários métodos de RT-3D-SPT têm sido apresentados nos últimos anos, alta velocidade de rastreamento 3D difusão de partículas em taxas de contagem de fótons de baixa continua a ser um desafio. Além disso, as configurações de RT-3D-SPT são geralmente complexos e difíceis de implementar, limitando sua aplicação generalizada de problemas biológicos. Este protocolo apresenta um sistema de RT-3D-SPT chamado 3D dinâmica fóton localização de rastreamento (3D-DyPLoT), que pode acompanhar a partículas com alta velocidade difusiva (até 20 µm2/s) em taxas de contagem de fótons de baixa (abaixo de 10 kHz). 3D-DyPLoT emprega um defletor de electro-óptica 2D (2D-EOD) e uma lente gradiente acústico sintonizável (TAG) para conduzir um único foco laser ponto dinamicamente em 3D. Combinada com um algoritmo de estimativa de posição otimizada, 3D-DyPLoT pode travar em partículas única com acompanhamento de alta velocidade e localização de alta precisão. Devido à sua excitação única e layout de caminho único deteção, 3D-DyPLoT é robusto e fácil de configurar. Este protocolo discute como construir 3D-DyPLoT passo a passo. Primeiro, o layout óptico é descrito. Em seguida, o sistema é calibrado e otimizado por raster um grânulo de fluorescente 190 nm com o nanopositioner piezoeléctrica de digitalização. Finalmente, para demonstrar o 3D em tempo real, capacidade de rastreamento, grânulos de fluorescente 110 nm são controlados em água.

Partícula fixa digitalização (Figura 4) e difunde livremente 110 nm fluorescente partícula de controle (Figura 5) foram realizados seguindo o protocolo acima. A digitalização de partícula foi realizada movendo os fótons nanopositioner e bin piezoelétricos enquanto simultaneamente cálculo da partícula calcula a posição em cada ponto no scan. A imagem de varredura mostra um quadrado de intensidade mesmo (figura 4a) e as posições estimadas mostram uma relação linear com a posição da partícula real sobre uma 1 × 1 × 2 µm escala em x, y e z direção (figura 4b–f).
Para demonstrar o acompanhamento em tempo real, as partículas fluorescentes de 110 nm foram rastreadas na água por 3D-DyPLoT (Figura 5a, b). A análise de deslocamento (MSD) quadrada mostra um típico comportamento linear característico do movimento browniano (Figura 5C). Análise MSD de 30 trajetórias mostrou um diâmetro médio de hidrodinâmico de 110 nm, bom de acordo com a especificação de fabricantes para o tamanho das nanopartículas fluorescentes sendo controladas (Figura 5D). Além disso, 1 filme mostra as leituras em tempo real nanopositioner piezoelétrico e sincronizado sCMOS imagens para uma 2 min longa trajetória de uma partícula fluorescente livremente difusores de 110 nm.
Além de ser capaz de rastrear com alta velocidade, as partículas em movimento lentas podem ser localizadas com alta precisão. Figura 6a - d mostra a aplicação do sistema 3D-DyPLoT às partículas fixas usando os mesmos parâmetros do gabarito utilizado para a alta velocidade de rastreamento, mostrando uma precisão de 17,6 e 26,4 53,4 nm em X, Y e Z, respectivamente, com taxa de contagem de fótons de 105. Figura 6e - h mostra a precisão sob controle de gabarito reduzido por um fator de 10, efetivamente trocar de velocidade para precisão e exibindo uma precisão de 6.5 e 8.3 10.5 nm em X, Y e Z, respectivamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig1.jpg"> 
Figura 1. Esquemático do sistema de rastreamento de 3D. A 2D-EOD (EOD1 &#38; EOD2) e a lente de TAG (TAG) desviar o laser junto as direções XY e Z, respectivamente. A APD (APD) é usado para coletar fótons de fluorescência, que são enviados para o FPGA (FPGA). FPGA é usado para o algoritmo de cálculo de posição, contagem de fótons, controle da 2D-EOD, bem como controle e leitura de nanopositioner piezoelétrico (NSxy e NZz). Outros componentes rotulados na figura: espelhos (M); lentes (L #); pinhole (PH); Polarizador de Glan-Thompson (GP); placa de meia onda (W1); filtro dicroico (DC); lente objetiva (OL, 100 X at = 1,49); filtro de emissão de fluorescência (F); divisor de feixe (BS); Fase de micropositioner XY (MSxy); Fase de micropositioner Z (MSz). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig2.jpg"> 
Figura 2. As coordenadas para a visita do cavaleiro implementada em 3D-DyPLoT. Eixo 1 e eixo 2 devem ser alinhadas ao longo do eixo X ou Y por alinhamento adequado da 2D-EOD. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig3.jpg"> 
Figura 3. Configurações de software TAG lente. Consulte a seção 4.2 TAG lente definições para obter mais informações. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig4.jpg"> 
Figura 4. Estimativa de varredura e posição das partículas. (a) imagem de digitalização de 190 fluorescente nm grânulos com 2D-EOD dirigindo o laser em um 1 × 1 µm quadrado padrão de turnê do cavaleiro. Intensidade da fluorescência é denotada pela cor. Unidade: kHz. (b) estimativa de xk, a posição da partícula em relação ao centro da 2D-EOD scan em micrômetros. A cor em b, ce d denota a posição estimada. Unidade: µm. (c) estimativa de yk em micrômetros. (d) estimativa de zk, a posição da partícula em relação ao centro axial da lente TAG scan em micrômetros. (e) estimado partícula posição yk em função da fase de posição média ao longo de toda a grade de (c). Observe que a posição da partícula estimado adquirida a partir do algoritmo de estimativa de posição (yk) concorda com a posição real. (f) estimado partícula posição zk em função da fase de posição média ao longo de toda a grade de (d). A posição estimada mostra uma relação linear com a posição real da partícula sobre 1 × 1 × 2 µm escala na direção X, Y e Z. Observe que a posição da partícula estimado adquirida a partir do algoritmo de estimativa de posição (zk) concorda com a posição real. A posição estimada mostra uma relação linear com a posição real da partícula sobre uma 1 × 1 × 2 µm escala em X, Y e Z de direção. A escala branco bares em (um–c) representam 500 nm e a barra de escala preta em (d) representa 2 µm. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig5.jpg"> 
Figura 5.Rastreamento de 110 nm fluorescente as partículas na água com 3D-DyPLOT. (um) 3D trajetória de uma difusão livremente 110 nm fluorescente nanopartículas na água. (b) intensidade fluorescente em função do tempo para a trajetória em (um). (c) MSD da trajetória em (um). A linha azul é o MSD medido enquanto a linha vermelha pontilhada é a melhor linha de ajuste de regressão linear. (d), MSD análise de 30 trajetórias, mostrando um diâmetro médio de hidrodinâmico de 110 nm, bom de acordo com o tamanho das nanopartículas fluorescentes sendo controladas. O diâmetro das partículas foi calculado usando a relação de Stokes-Einstein. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig6.jpg"> 
Figura 6. Precisão da partícula fixa rastreamento. (um) A partícula fixa é controlada por 3D-DyPLoT a taxas diferentes de contagem. A precisão é nm (b) 17,6 em X e (c) 26,4 nm em Y (d) 53,4 nm em Z a uma taxa de emissão de 100 kHz. (e) quando a sondagem de processos mais lentos, o controle de gabarito constante (Keu) pode ser reduzido por um fator de 10 para aumentar a precisão. Sob esse controle de gabarito reduzido, a precisão é (f) 6.5 nm em X (g) 8.3 nm em Y e (h), 10.5 nm em Z a uma taxa de emissão de 100 kHz. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura S1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_S1_position_estimation-01.pdf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura S2. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_s2_TAG_operation.pdf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura S3. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_s3_software.pdf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Informações complementares. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/170802_software_description.pdf">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Este detalhes de protocolo a construção e operação de um microscópio de rastreamento em tempo real 3D única partícula capaz de rastreamento nanoescala fluorescente sondas em alta velocidade difusiva e taxas de contagem de fótons de baixa.

Um protocolo para rastreamento em tempo real 3D única partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K visualizações.  Duke University. Este detalhes de protocolo a construção e operação de um microscópio de rastreamento em tempo real 3D única partícula capaz de rastreamento nanoescala fluorescente sondas em alta velocidade difusiva e taxas de contagem de fótons de baixa.

Vídeo: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Image-based Lagrangian Particle Tracking in Bed-load Experiments

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a relatively low cost. This manuscript describes an application of particle tracking velocimetry (PTV) to a bed-load experiment with lightweight sediment. The key characteristics of the investigated sediment transport conditions were the presence of a covered flow and of a fixed rough bed above which particles were released in limited number at the flume inlet. Under the applied flow conditions, the motion of the individual bed-load particles was intermittent, with alternating movement and stillness terms. The flow pattern was preliminarily characterized by acoustic measurements of vertical profiles of the stream-wise velocity. During process visualization, a large field of view was obtained using two action-cameras placed at different locations along the flume. The experimental protocol is described in terms of channel calibration, experiment realization, image pre-processing, automatic particle tracking, and post-processing of particle track data from the two cameras. The presented proof-of-concept results include probability distributions of the particle hop length and duration. The achievements of this work are compared to those of existing literature to demonstrate the validity of the protocol.

The manuscript presents a protocol for the conduction of bed-load sediment transport experiments where the moving particles are tracked by image analysis. The experimental facility, the procedures for run realization and data processing, and finally some proof-of-concept results are presented here.

Rastreamento de partículas Lagrangian baseado em imagem em experiências de carga de cama

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a ...

Ambiente

Three-dimensional Particle Tracking Velocimetry for Turbulence Applications: Case of a Jet Flow

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic recording of image sequences. The basic components, features, constraints and optimization tips of a 3D-PTV topology consisting of a high-speed camera with a four-view splitter are described and discussed in this article. The technique is applied to the intermediate flow field (5 &#60;x/d &#60;25) of a circular jet at Re &#8776; 7,000. Lagrangian flow features and turbulence quantities in an Eulerian frame are estimated around ten diameters downstream of the jet origin and at various radial distances from the jet core. Lagrangian properties include trajectory, velocity and acceleration of selected particles as well as curvature of the flow path, which are obtained from the Frenet-Serret equation. Estimation of the 3D velocity and turbulence fields around the jet core axis at a cross-plane located at ten diameters downstream of the jet is compared with literature, and the power spectrum of the large-scale streamwise velocity motions is obtained at various radial distances from the jet core.

A three-dimensional particle tracking velocimetry (3D-PTV) system based on a high-speed camera with a four-view splitter is described here. The technique is applied to a jet flow from a circular pipe in the vicinity of ten diameters downstream at Reynolds number Re &#8776; 7,000.

Tridimensional Velocímetro de Partículas de Rastreamento for Applications Turbulência: Case de um fluxo de Jet

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic ...

Engenharia

Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

Preparação e 3D Rastreamento de Catalytic Natação Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Bioquímica

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Bioengenharia

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Neurociência

Protocol for Analysis and Consolidation of TrackMate Outputs for Measuring Two-Dimensional Cell Motility using Nuclear Tracking

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To understand the regulation of cell motility, we must be able to measure it easily and consistently under different conditions. Here we describe a method for measuring and quantifying single-cell and bulk motility of HaCaT keratinocytes using a nuclear stain. This method includes a MATLAB script for analyzing TrackMate output files to calculate displacements, motility rates, and trajectory angles in single cells and in bulk for an imaging site. This motility analysis script allows for quick, straightforward, and scalable analysis of cell motility rates from TrackMate data and could be broadly used to identify and study the regulation of motility in epithelial cells. We also provide a MATLAB script for reorganizing microscopy videos collected on a microscope and converting them to TIF stacks, which can be analyzed using the ImageJ TrackMate plugin in bulk. Using this methodology to explore the roles of adherens junctions and actin cytoskeletal dynamics in regulating cell motility in HaCaT keratinocytes, we demonstrate evidence that Arp2/3 activity is required for the elevated motility seen after &#945;-catenin depletion in HaCaT keratinocytes.

This protocol for high-throughput measurement of cell motility in HaCaT keratinocytes describes methods for collecting and processing images of cell nuclei and performing particle tracking using the ImageJ plugin TrackMate.

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To ...