Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud con el número de concesión R35GM124868 y por la Universidad de Duke.

1. configuración del diseño y alineación
<ol>
	<li>Instalación y colimación de la excitación de seguimiento láser<ol>
		<li>Coloque el láser para la tabla óptica usando un montaje casa construida. El soporte es una placa de aluminio simple con agujeros para la cabeza del láser y la óptica mesa de montaje. El láser debe sujetarse firmemente a un soporte metálico para la estabilidad y la disipación de calor. Para este trabajo, utilizar un 488 nm láser de estado sólido para la iluminación (figura 1), aunque la longitud de onda se puede seleccionar para adaptarse a un fluoróforo particular o experimento. Un factor crítico es que la longitud de onda de láser ajuste la gama de trabajo 2D-EOD, que está determinada principalmente por la placa de la onda entre los dos deflectores (figura 1: W2). El láser de 488 nm efectivamente puede excitar la verde o amarilla proteína fluorescente (GFP/YFP), que son etiquetas fluorescentes comunes en los experimentos de células vivas.</li>
		<li>Ajustar la altura del rayo láser y la dirección con un par de espejos dieléctricos (figura 1: M). Asegúrese de que el rayo láser es paralelo a la tabla óptica y ajustarlo a una altura adecuada. Nota: La altura debe elegirse en base a la plataforma de microscopio. Esta altura debería mantenerse para todos los espejos posteriores en este protocolo, aunque esto estará no explícitamente indicado.</li>
		<li>Colimar el rayo con un par de lentes (figura 1: L1 y L2). Las distancias focales de lentes debe ser elegidas cuidadosamente para evitar que el foco del láser ser recortado por la abertura de la 2D-EOD. Recorte es evidente por un cambio en la forma de haz láser pasando a través de la 2D-EOD. La calidad de colimación aquí es muy importante porque se amplificarán las aberraciones de lentes posteriores y cualquier divergencia deteriorará el rendimiento de la desviación de 2D-EOD. Idealmente, colimar el rayo concentrándose la viga a un punto por lo menos 20 metros.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coloque un pequeño agujero (figura 1: PH) de tamaño adecuado en el foco de la primera lente de colimación (figura 1: L1).<ol>
		<li>Elegir un tamaño adecuado del agujero de alfiler. El tamaño del agujero de alfiler puede ser elegido según el siguiente cálculo: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Donde λ es la longitud de onda del laser, f es la distancia focal de la primera lente, y D es el diámetro de la viga de entrada.</li>
		<li>Montaje del agujero de alfiler en una etapa de traducción en 3D por lo que puede ser colocado precisamente en el foco de la primera lente de colimación.</li>
		<li>Ajuste la posición del agujero de alfiler. Coloque un medidor de potencia láser después del agujero de alfiler y ajustar la posición del agujero de alfiler en XYZ para aprovechar al máximo la lectura del medidor de energía. Si se observa un anillo de difracción, bloquear con un diafragma colocado antes de la 2D-EOD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de polarizador de Glan-Thompson<ol>
		<li>Poner el polarizador de Glan-Thompson (figura 1: GP) después de la segunda lente de colimación (figura 1: L2) para limpiar la polarización del haz láser. Girar el polarizador para encontrar la máxima de la transmisión con el medidor de energía.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de EODs<ol>
		<li>Utilizar 2 EODs (figura 1: EOD1 &#38; EOD2) para desviar el láser en las direcciones X e Y. Maximizar la transmisión de láser mediante el ajuste de la orientación, la echada y la altura de cada EOD.</li>
		<li>Alinee los dos EODs respecto unos a otros con el alineación marcador proporcionado por el fabricante en el costado de cada deflector.</li>
		<li>Aplicar un patrón de prueba con el controlador 2D-EOD para inspeccionar la salida de la EOD. Esto puede ser recorrido de caballero (figura 2) mediante el FPGA se describe a continuación o una simple onda senoidal proporcionada por un generador de funciones. Para el mejor desempeño, la desviación de cada deflector debe ser paralela a X o Y dirección de la nanopositioner piezoeléctrico. Esta dirección es dictada por la dirección angular de los deflectores sobre el eje de transmisión. Para girar la dirección de desviación sin mover el 2D-EOD, colocar un prisma de dove después del 2D-EOD para alinear los ejes de flexión a los ejes de nanopositioner piezo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de placa de media onda<ol>
		<li>Coloque una placa de media onda (figura 1: W1) entre el polarizador de Glan-Thompson (figura 1: GP) y el 2D-EOD para alinear el láser entrante haz de polarización con los ejes de la desviación de la 2D-EOD. Colocar una lente focal larga (300 mm) después de la EOD de 2D y una cámara sCMOS en el foco del láser. A continuación, encienda el 2D-EOD para generar tour del caballero que se describe a continuación (figura 2). Gire la placa de media onda hasta que una distribución de láser uniformemente cuadrado se observa en la cámara.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de una viga gastando lente par y par de lente de relé<ol>
		<li>Coloque un par de lentes (figura 1: L3 y L4) después de la 2D-EOD para expandir el haz para rellenar la abertura posterior de la lente del objetivo (figura 1: OL) y otro par de lentes (figura 1: L5 y L6) a relé del plano focal del objetivo del microscopio. Asegúrese de dejar suficiente espacio entre estos dos pares de lentes como el objetivo de la etiqueta se instalará entre ellos en un paso posterior.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instale el filtro dicroico divisor de viga de 10/90, de enfoque objetivo, APD, objetivo, filtro de emisión de fluorescencia para completar la vía de detección.<ol>
		<li>Instale el filtro dicroico (figura 1: DC) para reflejar el láser hacia el objetivo. Alinear el láser para ir directamente a través del centro de la lente del objetivo con dos iris en la parte superior e inferior de un tubo largo.</li>
		<li>Instalar un divisor de viga de 10/90 (figura 1: BS) por que el 10% de la luz se refleja para la proyección de imagen por una cámara de sCMOS (descrito a continuación) y 90% de pasa a través del APD para el seguimiento.</li>
		<li>Alinee el APD. Enfocar el láser en un cubreobjetos por la lente del objetivo. Utilice la reflexión de lo cubreobjetos para alinear elementos todo abajo por poner un cubreobjetos en el foco objetivo y comprobar la intensidad de la lectura de la APD. Después del divisor de viga, instalar el APD enfoque objetivo (figura 1: L7) seguido por el APD en una etapa de traducción en 3D. Coloque la lente que el reflejo del láser el objetivo pasa por el centro de la lente.</li></ol></li></ol>La posición de APD se puede optimizar ajustando la posición 3D para maximizar la intensidad de la reflexión del láser sobre el cubreobjetos. La posición de la APD está en la posición óptima cuando una medida de la posición del detector en cualquier dirección disminuye la intensidad.
		<li>Instalar un filtro longpass de emisión de fluorescencia (figura 1: F) antes del divisor de viga para eliminar la luz reflejada y dispersada.</li>
	
	
	<li>Instalación de la lente etiqueta<ol>
		<li>Coloque la lente de la etiqueta entre los dos pares de lentes (entre figura 1: L4 y L5) mencionado antes como se muestra en la figura 1. Ajustar el desvío, paso, altura y posición lateral tal que el rayo perpendicular pasa por la lente del centro de la etiqueta.</li>
	</ol>
	</li>

2. muestra preparación.
<ol>
	<li>Preparación de partícula fija<ol>
		<li>Diluir los granos fluorescentes de 190 nm a ~ 5 × 108 granos/mL en PBS. Añadir 400 μL granos solución sobre un cubreobjetos y Monte en el soporte de la muestra de la etapa piezoeléctrico (el volumen de granos dependerá el portamuestras; el diámetro de la cámara de soporte de muestra utilizada aquí es 18 m m). Para los granos aquí, PBS hace que las partículas en el cubreobjetos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparación de partículas móviles gratis<ol>
		<li>Diluir los granos fluorescentes de 110 nm a ~ 5 × 108 granos/mL con agua desionizada. Añadir 400 μL solución de granos en un cubreobjetos y montar sobre el soporte de la muestra de la etapa piezoeléctrico.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. optimizar los parámetros de seguimiento
<ol>
	<li>Exploración de trama fijada las partículas<ol>
		<li>Poner una muestra de partículas fijas en el microscopio.</li>
		<li>Activar el láser, controlador micropositioner, piezo nanopositioner controlador, controlador de la lente de etiqueta y EOD controlador. Tenga en cuenta que el orden no es crítico. Ejecute el nanopositioner piezoeléctrico en lazo cerrado.</li>
		<li>Raster scan muestra en XYZ con un personalizado análisis programa de software (Figura S3, software disponible a petición de los autores), que impulsa el 2D-EOD en visita de un caballero (figura 2), recoge las cuentas del APD, conduce el piezo nanopositioner y realiza el cálculo de posición (Figura S2). El tamaño de paso es de 40 nm y la gama de la exploración es 2 μm.<ol>
			<li>Para colocar el cubreobjetos en el foco del objetivo, extraer el filtro de emisión de fluorescencia y utilizar la reflexión del láser de cubreobjetos para maximizar la intensidad de señal en función de la posición Z de la micropositioner. Después de colocar la muestra en el plano focal, coloque nuevamente el filtro de emisión de fluorescencia.</li>
			<li>Abrir el programa de exploración. Fijar la gama de la exploración y el tamaño de paso escribiendo el número en la 'start', 'Finalizar' y 'al paso'. En primer lugar establecer una amplia gama de la exploración y el tamaño de paso para localizar una partícula (por ejemplo, 10 x 10 μm rango con tamaño de paso de 200 nm). Después de encontrar la partícula, la gama de la exploración del encogimiento y disminuir el tamaño de paso (por ejemplo, 2 x 2 μm rango con tamaño de paso de 100 nm). Haga clic en el botón 'scan' para realizar un análisis de trama 3D para encontrar el foco fluorescente.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuración de la lente de etiqueta (vea la figura 3)<ol>
		<li>Haga clic en el software de control de lente de etiqueta. Haga clic en 'connect', 'encender' secuencialmente.</li>
		<li>Para cambiar la fase de salida de las señales de disparo, es necesario cambiar el modo de disparo de salida. Primero cambiar el modo de 'RGB' a 'Multiplane' y luego cambiar nuevamente. Ahora la fase puede ser cambiado (figura 3b).</li>
		<li>Establecer la fase de salida a 0 °, 90 ° y 270 °. Si bien pueden utilizarse cualquier tres fases que cubren el espacio de fase, estos tres se encuentran trabajando bien empíricamente (Figura 3C).</li>
		<li>Seleccione el ajuste de frecuencia Hz 68.500.</li>
		<li>Para encontrar la frecuencia óptima a menudo es necesario cambiar las frecuencias de búsqueda. Haga clic en 'avanzado', 'ajuste'. Cambio el ' Max. FREQ(Hz)' de la columna 0 de 70.000 Hz a Hz 71.500. Esto se puede ajustar a cualquier rango de frecuencia es apropiado. Haga clic en "Guardar calibración', 'salir de la calibración" (Figura 3d).</li>
		<li>Para hacer la nueva calibración efectiva, cambiar la resonancia a otra frecuencia (por ejemplo, 189.150 Hz) y luego cambiar a la configuración de frecuencia de 68.500 Hz (figura 3e).</li>
		<li>Cambiar gradualmente la amplitud al 35%. Haga clic en 'Bloquear la resonancia'. La frecuencia está bloqueada, haga clic en 'Desbloquear resonancia' (figura 3e). El objetivo de la etiqueta está listo para usar ahora.</li>
		<li>Para calibrar, cambiar los parámetros que se utilizan en la estimación para hacer la posición estimada igual a la posición real, como se muestra en la Figura 4e, f. entrada a la gama de la exploración de x, y y z y haga clic en 'scan' botón para analizar la muestra en XYZ para mover el partícula a través del foco del láser móvil. La posición de la partícula como se analiza a través del foco del laser debe de acuerdo con la posición de la partícula aproximadamente determinada por el lazo de la estimación de posición (Figura S1). La relación entre la posición estimada y la posición real (figura 4 d) se puede extraer de las imágenes de posición estimada (figura 4f). Si no acepta las posiciones, ajuste los valores de la posición del láser (ck) utilizado en el circuito de estimación de posición (Figura S1).</li>
		<li>Alinear la lente etiqueta<ol>
			<li>Cuando el controlador de la lente de etiquetas está desactivada, la trama analiza imágenes de partículas (descritos abajo) tomadas antes de instalar el lente de la etiqueta y después instalación etiqueta debería mirar idéntica. A continuación, realizar pila de partículas fluorescentes Z escaneo moviendo el objetivo con el nanopositioner de z para afinar la posición y el ángulo de la lente de la etiqueta (figura 4). Ajustar la posición de la lente de la etiqueta hasta que no hay deriva en las imágenes de partícula en el plano XY en la dirección Z, que se consigue cuando hay ningún cambio en la posición XY de la partícula en función de la posición de Z (figura 4 d). El sistema de seguimiento está listo para usar después de la alineación de la lente de la etiqueta.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Instalación de cámara sCMOS para monitoreo de partículas<ol>
		<li>Instalar una cámara sCMOS para visualizar las partículas mientras que están siendo rastreados. Instale el sCMOS sólo después de que todos los componentes del sistema de seguimiento instalados y optimizados.</li></ol></li></ol>Cargar una muestra fija de partículas fluorescentes en el microscopio y ejecutar el programa de seguimiento para una partícula en el volumen focal objetivo. A continuación, instale la lente de longitud focal de 100 mm (figura 1: L8) y sCMOS. Ajuste la posición del sCMOS por lo que la imagen de la partícula se centra en el punto más pequeño y más brillante.
	
	

4. en tiempo real seguimiento 3D de nanopartículas que difunde libremente
<ol>
	<li>Poner el 110 nm libre movimiento muestra de partículas en el microscopio.</li>
	<li>Encienda láser, regulador micro-posicionador, piezo nanopositioner controlador, controlador de la lente de etiqueta y controlador EOD. Ejecute el nanopositioner piezoeléctrico en lazo abierto. Configure el software de la lente de la etiqueta según el paso 3.2.</li>
	<li>Abra y ejecute el software de seguimiento (disponible a petición de los autores). Establecer la posición de parámetros de estimación los valores optimizados, que fueron encontrados en la sección 3.</li>
	<li>Para colocar el cubreobjetos en el foco del objetivo, extraer el filtro de emisión de fluorescencia y utilizar la reflexión del láser de cubreobjetos para maximizar la intensidad de señal en función de la posición Z de la micropositioner. Después de encontrar el cubreobjetos, aumentar el foco posición 15 μm para centrar el láser del cubreobjetos y en la solución. Coloque nuevamente el filtro de emisión de fluorescencia.</li>
	<li>Establecer las constantes de control integral. Las constantes de control integral pueden establecerse a partir de un valor bajo y aumentando lentamente hasta que las oscilaciones pueden verse en lecturas de posición de la partícula. Una vez que se observan oscilaciones, ajustar las constantes de control integral hasta el 80% del valor que causan las oscilaciones. Valores típicos será alrededor de 0.012 fines el XY' integral' y de 0.004 para el Z 'ganancia integral'.</li>
	<li>Establecer los umbrales de seguimiento en el 'Umbral de la pista' y 'Pista mínimo' y comienza el experimento de seguimiento haciendo clic en 'Buscar' y 'Auto Track'. El umbral para el rastreo de terminación es ligeramente más alto que el nivel de fondo y el umbral para la activación de seguimiento es aproximadamente dos veces mayor que el fondo. Aquí, el umbral para la activación de seguimiento es de 3 kHz y el umbral para poner fin a la trayectoria es 1,5 kHz.</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Aunque muchas variedades de 3D sola partícula seguimiento métodos han surgido en los últimos años, robusto rastreo en tiempo real de la difusión de 3D de alta velocidad en tasas de conteo de fotones bajo con una configuración simple es todavía un reto, que limita su aplicación a la biológica importante problemas. El método 3D-DyPLoT había descrito en esta dirección estos retos en varios sentidos. En primer lugar, las vías de excitación y detección se simplifican considerablemente en comparación con otras implementaciones de hacer alineación sencilla y robusta. En segundo lugar, el punto móvil láser y algoritmo de estimación de posición proporcionan estimaciones de la posición exacta para el bucle de retroalimentación, haciendo la retroalimentación más estable. En tercer lugar, el rango de detección con eficacia grandes (1 x 1 x 4 μm) del punto láser dinámicamente móviles permite seguimiento de partículas de movimiento rápidas. Para ver por qué esta área de detección grande es fundamental, es importante considerar el tiempo de respuesta intrínseco de la nanopositioner piezoeléctrico. Etapas piezoeléctrico de alta velocidad tienen resonancias del orden de 1 kHz, limitando el tiempo de respuesta a ser del orden de 1 ms. en 1 ms, una nanopartícula 100 de nm con un coeficiente de difusión de 4 μm2/s, se difundirán en promedio 90 nm desde el centro de la difracción-li volumen de la Mited de la detección. Esto es sólo el desplazamiento promedio y movimiento verdaderamente al azar exhibirá pasos mucho más grandes que esto, conduce a la partícula dejando el volumen focal y acabar con la trayectoria actual. La situación es aún peor para las partículas más pequeñas, donde cada vez más pasos difusivas térmicas conducen a la pérdida de seguimiento. El área de detección con eficacia grande permite el sistema de seguimiento superar retraso intrínseco etapa piezoeléctrico y recuperarse de grandes saltos difusivos en la posición de la partícula, aumentando la robustez general del mecanismo de seguimiento. Finalmente, el área de exploración grande permite que el sistema recoger fácilmente nuevas partículas, permitiendo trayectorias consecutivas a adquirirse rápidamente grandes conjuntos de datos recopilados.
El usuario debe tener en cuenta que hay algunos pasos críticos. En primer lugar, la alineación de la EOD de 2D y el objetivo de la etiqueta son críticos. Ambos deben estar bien alineados para obtener la precisión óptima. En segundo lugar, los parámetros que se utilizan en la estimación de la posición de la partícula fija paso la exploración deben ser bien calibrados (ver figura 4). La posición de la partícula estimada debe coincidir con la posición de la partícula correspondiente al centro de la gama de escaneo láser. Finalmente, las constantes de retroalimentación integral (K) deben ajustarse cuidadosamente, a partir de un valor pequeño y rampas hasta que las oscilaciones se observan a continuación, respaldo aproximadamente el 80% de ese valor.
Hay algunas advertencias acerca de 3D-DyPLoT a tener en cuenta dependiendo de la aplicación deseada. Mientras que la estimación de posición optimizada está diseñada para su uso con movimiento browniano, está también bien adaptado para el movimiento direccional. El algoritmo puede aplicarse directamente a cualquier tipo de movimiento ya que es sólo la incertidumbre de la posición que se asume para ser Gaussian, no la posición de la partícula real. Para casos donde se espera que la persistente movimiento lineal, se puede Agregar un término adicional al término de la predicción en el algoritmo de estimación de posición (ver ecuación 3 en la Información complementaria).
La selección de los parámetros para el 2D-EOD y la etiqueta debe considerarse cuidadosamente cuando se configura el 3D-DyPLoT. De particular importancia es el uso de bin para recorrido de caballero por 2D-EOD. En un escenario ideal, tour del caballero estar sincronizado para el período de la lente de la etiqueta para asegurar la eficiente toma de muestras. Sin embargo, es fundamental considerar el tiempo de respuesta de la 2D-EOD a cambios en el voltaje. Para la unidad de aquí, hay un tiempo de respuesta 2-3 μs después de que la tensión se aplica antes de alcanza el punto deseado. Al tiempo de bin de 20 μs, se trata de unos 10-15% del tiempo de colección. Reducir el tiempo para que coincida con el período de la lente de etiqueta de ~ 14 μs aumenta la fracción de tiempo bin, que es el tiempo de la 2D-EOD. Esto conduce a valores incorrectos de la posición del láser y la posición incorrecta las estimaciones.
Otro factor para el experimentador a tener en cuenta es la resolución temporal. Mientras que los datos mostrados aquí son recogidos en una tarifa de datos de 100 kHz, la máxima resolución temporal se define en última instancia, por que los datos son utilizados para la medición de la posición. Si la lectura de la nanopositioner se utiliza como la posición de la partícula (figura 6), la resolución temporal depende del valor de la constante de control integral. Por ejemplo, para el control integral se muestra en la Figura 6a–d, la respuesta de la etapa es del orden de 1 ms, mientras que para la figura 6e–h, es del orden de 10 de la Sra. Si se desea mayor rapidez resolución temporal, entonces el fotones por fotón resultado del algoritmo de estimación de posición se correlaciona con la tasa de conteo de fotones. Por ejemplo, una tasa de emisión de 10 kHz produce 100 μs resolución temporal y una tasa de emisión de 100 kHz produce una resolución temporal de 10 μs. Además, desde la precisión sigue una <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq2.jpg"> relación41, se juntan la precisión espacial y temporal. Como resultado, el brillo de la punta de prueba determina la precisión espacial y temporal.
En este protocolo describen la configuración, diseño y alineación de una alta velocidad en tiempo real 3D sola partícula método que utiliza un 2D-EOD y la lente de la etiqueta a mover dinámicamente un punto láser enfocada a lograr la estimación de partículas rápido posición de seguimiento. Luego nos describe métodos de muestra preparación y parámetro de optimización. 3D-DyPLoT ofrece un método relativamente simple y robusto para bloqueo de movimiento rápido y humildes emitiendo partículas difusas. El diseño óptico simple le permite agregar fácilmente en el puerto lateral de cualquier soporte existente de microscopio que puede combinarse con módulos de imágenes. Con este protocolo, esperamos que los RT-3D-SPT puede ser que más ampliamente implementado por investigadores más rápido, abordar tres dimensiones procesos biológicos.

La aparición de técnicas de imagen avanzadas ha abierto una ventana para ver la estructura cada vez más detallada de los fenómenos celulares, hasta el nivel molecular. Métodos tales como la reconstrucción óptica estocástica (tormenta) la microscopia1,2,3, Foto-activado localización microscopia (Palma)4,5,6,7 , estructurado iluminación microscopia (SIM)8,9,10,11y estimuló la emisión (STED) la microscopia de agotamiento de12,13, 14 han ido mucho más allá del límite de difracción para entregar de detalle sin precedentes en la estructura y función de células vivas. Sin embargo, el completo entendimiento de cómo estos sistemas se comportan requiere información dinámica así como la información estructural. Los métodos de resolución súper mencionados implican una relación inversa entre la resolución espacial y resolución temporal, limitando la precisión temporal con la que pueden ser explorados procesos dinámicos. Un método que proporciona alta precisión espacial y resolución temporal es RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Aquí, dibujamos una distinción entre tradicionales 3D-SPT30 y RT-3D-designado tradicional SPT 3D simplemente requiere de una serie temporal de datos de imagen tridimensional (que se pueden adquirir ya sea mediante un microscopio confocal o un microscopio de epifluorescencia Dada la configuración correcta). En tradicional 3D-SPT, las coordenadas de la partícula se determinan después de la recolección de datos de localización de la partícula en cada pila imagen y concatenación de las ubicaciones en sucesivos volúmenes para crear una trayectoria. Estos métodos, la máxima resolución temporal está determinada por la tasa de proyección de imagen volumétrica. Para microscopios confocales, es fácilmente en la escala de segundos a decenas de segundos. Métodos de epifluorescencia, en donde el camino óptico es manipulado para que la información de localización axial puede ser extraída, la resolución temporal está limitada por el tiempo de exposición o lectura de cámara. Estos métodos epifluorescente están limitados en la gama que puede recopilarse información axial, aunque recientes avances en la fase del plano de Fourier máscaras diseño y óptica adaptativa está ampliando estas gamas a 10 μm o más31,32 , 33 , 34.
Por el contrario, RT-3D-SPT no se basa en adquirir una pila de imágenes 3D y la búsqueda de las partículas después del hecho. Por el contrario, se extrae información de ubicación en tiempo real a través de detectores de punto único y regeneración se aplica a efectivamente "bloquear" la partícula en el volumen focal de la lente del objetivo mediante el uso de una etapa piezoeléctrico de alta velocidad. Esto permite la medición continua de la posición de la partícula limitada sólo por cuántos fotones se pueden recoger. Además, este método permite interrogatorio espectral de la partícula que se mueve en gamas largas. RT-3D-SPT en efecto funciona similar a una trampa óptica fuerza-libre para objetos de escala nanométrica, donde la partícula continuamente es explorada y medida en tiempo real sin necesidad de poderes grandes láser u óptica de las fuerzas. Dado que RT-3D-SPT constituye una forma de interrogatorio continuo de objetos rápida difusión (hasta 20 μm2/s)25,29 en tres dimensiones en el fotón bajo cuenta tarifas20,29, 35, debe proporcionar una ventana en procesos biológicos rápidos o transitorios como transporte de carga intracelular, Unión ligando-receptor y la dinámica extracelular de viriones individuales. Sin embargo, a este punto, la aplicación de la RT-3D-SPT se ha limitado a ese puñado de grupos de trabajo para avanzar en esta tecnología.
Una barrera es la complejidad del diseño óptico requerida métodos de RT-3D-SPT, que son muy variados. Para la mayoría de los métodos, la retroalimentación óptica proporciona una etapa piezoeléctrica. Como los partícula hace pequeños movimientos en X, Y, o Z, lecturas de punto único detectores están convertidos a funciones de error y en alta velocidad a un nanopositioner piezoeléctrico, que en su vez mueve la muestra para contrarrestar el movimiento de la partícula, con eficacia bloqueo en su lugar con respecto a la lente del objetivo. Para medir pequeños movimientos posicionales en X, Y y Z, múltiples detectores (4 o 5 dependiendo de la implementación)15,18,21 o múltiples puntos de excitación (2-4, el menor de los cuales se puede aplicar si una amplificador de bloqueo se utiliza para extraer X y posición Y mediante una rotación láser spot) se aplican25,28 . La superposición de estas múltiples puntos de detección y emisión de hacer los sistemas difíciles de alinear y mantener.
Adjunto, presentamos un método de alta velocidad 3D objetivo bloqueado-SPT con un diseño óptico simplificado llamado 3D-DyPLoT29. 3D-DyPLoT utiliza una EOD 2D y una etiqueta lente36,37,38 para mover dinámicamente un punto láser enfocado a través del volumen focal objetivo a una velocidad alta (50 kHz XY, Z de 70 kHz). Combinando la posición de foco del láser y el tiempo de llegada de fotones permite posición 3D del objeto a obtenerse rápidamente incluso en tasas de conteo de fotones baja. 2D-EOD conduce el enfoque láser en visita patrón39 con un tamaño de cuadrado de 1 x 1 μm en el plano X-Y de un caballero y el objetivo de la etiqueta mueve el enfoque láser en dirección axial con una gama de 2-4 μm. La posición de la partícula 3D se obtiene con una posición optimizada estimación algoritmo29,40 en 3D. El control del 3D dinámicamente móviles laser punto, fotón contando desde el fotodiodo de avalancha (APD), cálculo de posición de partículas en tiempo real, piezoeléctrico etapa retroalimentación y registro de datos se realizan en un arreglo de compuertas programables en campo (FPGA).En este protocolo, se describe cómo construir un microscopio 3D-DyPLoT paso a paso, incluyendo alineación óptica, calibración con partículas fijas y finalmente libre seguimiento de partículas. Como demostración, perlas fluorescentes de 110 nm fueron seguidos continuamente en el agua durante minutos a la vez.
El método descrito en este documento es una opción ideal para cualquier aplicación donde se desea monitorear continuamente una sonda fluorescente rápidos en niveles de luz bajos, incluyendo virus, nanopartículas y vesículas de endosomas. En contraste con los métodos anteriores, existe sólo una única excitación y detección solo camino, hacer alineación y mantenimiento sencillo. Además, el área de detección grande permite este microscopio fácilmente recoger rápidamente difundiendo partículas, mientras que la capacidad de seguimiento de nivel de señal baja (hasta 10 kHz) hace este método ideal para aplicaciones de baja luz29.

<table><tbody><tr><td>2D Electro-optic Deflector&amp;nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 required</td></tr><tr><td>Power supply for EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td></tr><tr><td>TAG&amp;nbsp; Lens</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Used to deflect laser along axial direction</td></tr><tr><td>XY piezoelectric nanopositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelectric nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td></tr><tr><td>Micropositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Used to coarsely position sample and evaluate</td></tr><tr><td>Objective Lens</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Used to monitor the particle&#039;s position</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Lower dark counts beneficial</td></tr><tr><td>Field programmable gate array</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking excitation laser</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizer</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Half-wave plate</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dichroic Mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Fluorescence Emission Filter</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Sola partícula tridimensional en tiempo real (RT-3D-SPT) de seguimiento tiene el potencial de arrojar luz sobre procesos rápidos y 3D en sistemas celulares. Aunque varios métodos de RT-3D-SPT han presentado en los últimos años, seguimiento de alta velocidad 3D difundiendo partículas en tasas de conteo de fotones baja sigue siendo un desafío. Por otra parte, configuraciones RT-3D-SPT son generalmente complejas y difíciles de implementar, limitar su aplicación generalizada a problemas biológicos. Este protocolo presenta un sistema RT-3D-SPT llamado 3D dinámica del fotón localización seguimiento (3D-DyPLoT), que puede rastrear partículas con difusores de alta velocidad (hasta 20 μm/s2) en tasas de conteo de fotones bajas (hasta 10 kHz). 3D-DyPLoT emplea un deflector de electro-óptico 2D (2D-EOD) y una lente de gradiente acústico armonioso (etiqueta) para conducir un único centrado láser punto dinámicamente en 3D. Combinado con un algoritmo de estimación de posición optimizada, 3D-DyPLoT puede trabar sobre partículas individuales con seguimiento de alta velocidad y precisión de localización alta. Debido a la excitación individual y diseño de ruta solo detección, 3D-DyPLoT es robusto y fácil de configurar. Este protocolo describe cómo construir paso a paso de 3D-DyPLoT. En primer lugar, se describe el diseño óptico. A continuación, el sistema es calibrado y optimizado por trama exploración una tira fluorescente de 190 nm con el nanopositioner piezoeléctrico. Finalmente, para demostrar la capacidad de seguimiento de tiempo real 3D, perlas fluorescentes de 110 nm se realiza un seguimiento en el agua.

Partículas fijas (figura 4) la exploración y difusión libremente 110 nm fluorescente rastreo de partículas (figura 5) fueron realizadas siguiendo el protocolo anterior. El análisis de partículas se realizó moviendo los fotones nanopositioner y bin piezoeléctricos mientras que simultáneamente, calcular la partícula había estimado posición en cada punto en la exploración. La exploración muestra un cuadrado de la intensidad uniforme (figura 4a) y las posiciones estimadas muestran una relación lineal con la posición real de la partícula sobre un 1 × 1 × 2 μm rango en x, y y z dirección (Figura 4b–f).
Para demostrar el seguimiento en tiempo real, las partículas fluorescentes de 110 nm fueron seguidas en el agua por 3D-DyPLoT (figura 5a, b). El análisis de desplazamiento (MSD) cuadrado medio muestra un comportamiento lineal típico característico de movimiento browniano (figura 5C). Análisis MSD de 30 trayectorias mostraron un diámetro hidrodinámico medio de 110 nm, de acuerdo con las especificaciones del fabricante para el tamaño de las nanopartículas fluorescentes rastreadas (Figura 5D). Además, 1 de película muestra las lecturas en tiempo real nanopositioner piezoeléctrico y sincronizados sCMOS imágenes para una 2 minutos larga trayectoria de una partícula fluorescente libremente difundiendo de 110 nm.
Además de pista de alta velocidad, las partículas de movimiento lento pueden localizarse con alta precisión. Figura 6a - d muestra la aplicación del sistema 3D-DyPLoT a las partículas fijas utilizando los mismos parámetros de retroalimentación utilizado para la alta velocidad de seguimiento, mostrando una precisión de 17.6, 26.4 y 53,4 nm en X, Y y Z, respectivamente, con tasa de conteo de fotones de 105. Figura 6e - h muestra la precisión bajo control de retroalimentación reducida por un factor de 10, efectivamente cambiar velocidad por precisión y exhibe una precisión de 6.5 y 8.3 10.5 nm en X, Y y Z, respectivamente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig1.jpg"> 
Figura 1. Esquema de sistema de seguimiento 3D. 2D-EOD (EOD1 &#38; EOD2) y la lente de la etiqueta (TAG) desviar el láser a lo largo de las direcciones XY y Z, respectivamente. El APD (APD) se utiliza para recoger fotones fluorescencia, que son enviados a la FPGA (FPGA). FPGA se utiliza para el algoritmo de cálculo de posición, conteo de fotones, control 2D-EOD así como control y lectura de nanopositioner piezoeléctrico (NSxy y NZz). Otros componentes en la figura: espejos (M); lentes (L #); agujero de alfiler (PH); Polarizador de Glan-Thompson (GP); placa de media-onda (W1); filtro dicroico (DC); objetivo (OL, NA X 100 = 1.49); filtro de emisión de fluorescencia (F); divisor de viga (BS); XY micropositioner fase (MSxy); Etapa de micropositioner Z (MSz). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig2.jpg"> 
Figura 2. Coordina para recorrido de caballero en 3D-DyPLoT. Eje 1 y eje 2 deben estar alineados a lo largo del eje X o Y por la alineación apropiada de la 2D-EOD. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig3.jpg"> 
Figura 3. Configuración de software de lente etiqueta. Ver configuración de lente de etiqueta de sección 4.2 para obtener más información. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig4.jpg"> 
Figura 4. Estimación de análisis y posición partícula. (a) exploración de imagen de fluorescentes nm 190 granos con 2D-EOD conduce el láser en un 1 μm × 1 plaza patrón de recorrido del caballero. Intensidad de fluorescencia es denotado por el color. Unidad: kHz. (b) estimación de xk, posición de la partícula en relación con el centro de la 2D-EOD escanee en micrómetros. El color en b, cy d denota la posición estimada. Unidad: μm. (c) estimación de yk en micrómetros. (d) la estimación de zk, posición de la partícula en relación con el centro axial de la lente etiqueta exploración en micrómetros. sobre la red entera de (c) un promedio de posición (e) Estimado partícula posición yk como una función de la etapa. Tenga en cuenta que la posición de la partícula estimada adquirida en el algoritmo de estimación de posición (yk) está de acuerdo con la posición real. (f) estimado de posición partícula zk en función de la etapa en la posición media sobre la red entera de (d). La posición estimada muestra una relación lineal con la posición real de partículas en 1 × 1 × 2 μm rango en dirección X, Y y Z. Tenga en cuenta que la posición de la partícula estimada adquirida en el algoritmo de estimación de posición (zk) está de acuerdo con la posición real. La posición estimada muestra una relación lineal con la posición real de la partícula en un 1 × 1 × 2 μm rango en X, Y y Z dirección. De la escala blanca bares (un–c) representan 500 nm y la barra de escala negra en (d) representa 2 μm. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig5.jpg"> 
Figura 5.Seguimiento de partículas fluorescentes de 110 nm en el agua con 3D-DyPLOT. (a) trayectoria 3D de una libre difusión nanopartícula fluorescente 110 nm en el agua. (b) intensidad fluorescente en función del tiempo de la trayectoria en (un). (c) MSD de la trayectoria en (un). La línea azul es el MSD medida mientras que la línea roja punteada es la mejor línea de ajuste de regresión lineal. (d) MSD análisis de trayectorias de 30, que muestran un diámetro hidrodinámico medio de 110 nm, en acuerdo con el tamaño de las nanopartículas fluorescentes rastreadas. El diámetro de las partículas se calculó mediante la relación de Stokes-Einstein. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig6.jpg"> 
Figura 6. Precisión de rastreo de partículas fijo. (a) A partícula fija es rastreada por 3D-DyPLoT en tasas de conteo diferente. La precisión es nm (b) 17.6 x y (c) 26.4 nm Y nm (d) 53.4 en Z a una tasa de emisión de 100 kHz. (e) cuando sondeo procesos más lentos, el control de la retroalimentación constante (K) puede reducirse por un factor de 10 para aumentar la precisión. Bajo este control retroalimentación reducido, la precisión es nm (f) 6.5 x y (g) 8.3 nm Y nm (h) 10.5 en Z a una tasa de emisión de 100 kHz. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura S1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_S1_position_estimation-01.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura S2. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_s2_TAG_operation.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura S3. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_s3_software.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Información complementaria. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/170802_software_description.pdf">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.

Un protocolo para el seguimiento en tiempo real 3D sola partícula

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K vistas.  Duke University. Datos de este protocolo la construcción y operación de un microscopio de seguimiento en tiempo real 3D sola partícula capaz de seguimiento nanoescala fluorescente puntas de prueba a altas velocidades difusivos y tasas de conteo de fotones baja.

Video: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Image-based Lagrangian Particle Tracking in Bed-load Experiments

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a relatively low cost. This manuscript describes an application of particle tracking velocimetry (PTV) to a bed-load experiment with lightweight sediment. The key characteristics of the investigated sediment transport conditions were the presence of a covered flow and of a fixed rough bed above which particles were released in limited number at the flume inlet. Under the applied flow conditions, the motion of the individual bed-load particles was intermittent, with alternating movement and stillness terms. The flow pattern was preliminarily characterized by acoustic measurements of vertical profiles of the stream-wise velocity. During process visualization, a large field of view was obtained using two action-cameras placed at different locations along the flume. The experimental protocol is described in terms of channel calibration, experiment realization, image pre-processing, automatic particle tracking, and post-processing of particle track data from the two cameras. The presented proof-of-concept results include probability distributions of the particle hop length and duration. The achievements of this work are compared to those of existing literature to demonstrate the validity of the protocol.

The manuscript presents a protocol for the conduction of bed-load sediment transport experiments where the moving particles are tracked by image analysis. The experimental facility, the procedures for run realization and data processing, and finally some proof-of-concept results are presented here.

Seguimiento de partículas lagrangianas basadas en imágenes en experimentos de carga de la cama

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a ...

Investigación

Medio ambiente

Three-dimensional Particle Tracking Velocimetry for Turbulence Applications: Case of a Jet Flow

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic recording of image sequences. The basic components, features, constraints and optimization tips of a 3D-PTV topology consisting of a high-speed camera with a four-view splitter are described and discussed in this article. The technique is applied to the intermediate flow field (5 &#60;x/d &#60;25) of a circular jet at Re &#8776; 7,000. Lagrangian flow features and turbulence quantities in an Eulerian frame are estimated around ten diameters downstream of the jet origin and at various radial distances from the jet core. Lagrangian properties include trajectory, velocity and acceleration of selected particles as well as curvature of the flow path, which are obtained from the Frenet-Serret equation. Estimation of the 3D velocity and turbulence fields around the jet core axis at a cross-plane located at ten diameters downstream of the jet is compared with literature, and the power spectrum of the large-scale streamwise velocity motions is obtained at various radial distances from the jet core.

A three-dimensional particle tracking velocimetry (3D-PTV) system based on a high-speed camera with a four-view splitter is described here. The technique is applied to a jet flow from a circular pipe in the vicinity of ten diameters downstream at Reynolds number Re &#8776; 7,000.

Tridimensional de velocimetría de seguimiento de partículas para aplicaciones de turbulencia: Caso de un Flujo Jet

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic ...

Ingeniería

Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

Seguimiento de preparación y 3D de dispositivos catalíticos de natación

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Microscopía de seguimiento de una sola molécula - Una herramienta para determinar los estados difusos de las moléculas citosólicas

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Bioquímica

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Bioingeniería

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

Control de las velocidades de flujo de fluidos activos 3D basados en microtúbulos mediante la temperatura

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Seguimiento de partículas sensibles a la masa para caracterizar la dinámica de macromoléculas asociada a la membrana

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Neurociencias

Protocol for Analysis and Consolidation of TrackMate Outputs for Measuring Two-Dimensional Cell Motility using Nuclear Tracking

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To understand the regulation of cell motility, we must be able to measure it easily and consistently under different conditions. Here we describe a method for measuring and quantifying single-cell and bulk motility of HaCaT keratinocytes using a nuclear stain. This method includes a MATLAB script for analyzing TrackMate output files to calculate displacements, motility rates, and trajectory angles in single cells and in bulk for an imaging site. This motility analysis script allows for quick, straightforward, and scalable analysis of cell motility rates from TrackMate data and could be broadly used to identify and study the regulation of motility in epithelial cells. We also provide a MATLAB script for reorganizing microscopy videos collected on a microscope and converting them to TIF stacks, which can be analyzed using the ImageJ TrackMate plugin in bulk. Using this methodology to explore the roles of adherens junctions and actin cytoskeletal dynamics in regulating cell motility in HaCaT keratinocytes, we demonstrate evidence that Arp2/3 activity is required for the elevated motility seen after &#945;-catenin depletion in HaCaT keratinocytes.

This protocol for high-throughput measurement of cell motility in HaCaT keratinocytes describes methods for collecting and processing images of cell nuclei and performing particle tracking using the ImageJ plugin TrackMate.

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To ...