Com o rastreamento de partículas sensíveis à massa, podemos observar biomoléculas individuais difundidas em membranas lipídicas e quantificar sua dinâmica em tempo real, todas completamente livres de rótulos. Como não são necessários rótulos, não há perigo de perturbar o comportamento dinâmico das biomoléculas. Outra vantagem deste método é sua sensibilidade em massa, o que nos permite determinar estados oligoméricos ligados à membrana.
Devido à sua versatilidade, podemos aplicar este método a qualquer sistema associado à membrana. Em particular, pode ser usado para estudar a formação de complexos receptores induzidos por ligante. Comece distribuindo um número igual de slides de microscópio em titulares de PTFE.
Transfira os titulares do PTFE para os béquers. Adicione água ultrauso e sonicá-las por 15 minutos em temperatura ambiente. Use pinças para transferir os suportes para limpar béquers e adicionar isopropanol ultrapure.
Sonicate novamente por 15 minutos, em seguida, novamente substituir o isopropanol por água ultrapura, e sonicar o béquer contendo os suportes por 15 minutos. Remova os suportes dos béquers e seque os slides do microscópio no suporte sob um fluxo constante de gás nitrogênio ou ar comprimido. Coloque o suporte seco contendo os grandes slides do microscópio no limpador de plasma e ligue-o.
Enrole o papelão plano com papel alumínio. Espalhe os slides de microscópio de 24 milímetros limpos por 24 milímetros na folha de alumínio com distância suficiente entre si. Em seguida, conecte tiras de fita de dois lados nas bordas superior e inferior dos slides.
Extirpar cada slide de microscópio com um bisturi de tal forma que possa ser removido da folha de alumínio. Cada slide deve ter listras de fita dupla face anexadas às bordas superior e inferior do slide. Em seguida, conecte o slide com as duas tiras de fita dupla face ao slide hidrofilizado.
Isso formará um caminho de fluxo entre os slides do microscópio menor e maior. Diluir as vesículas unilamellar recém-extrudadas, ou SUVs, para uma concentração final de 0,4 miligramas por mililitro no buffer de reação necessário. Opcionalmente, para promover a ruptura vesícula, adicione dois cloreto de cálcio milimila à suspensão da vesícula.
Monte uma câmara de fluxo no estágio do fotômetro de massa. Lave 25 microlitres da suspensão da vesícula na câmara de fluxo e incuba a câmara por dois minutos, em seguida, remova as vesículas não afusadas através da lavagem repetida da câmara de fluxo com 200 microliters do tampão de reação cada vez. Uma vez que a membrana lipídica esteja livre de vesículas não fundidas, adicione 50 microliters da proteína de interesse à câmara amostral.
Em seguida, defina as condições de imagem, como o tamanho do campo de visão, tempo de exposição, taxa de quadros e tempo de aquisição no software de aquisição. Ajuste o foco automaticamente. Se necessário, use o controle lateral para mover o campo de visão para uma posição com uma membrana homogênea.
Crie uma pasta de projeto e comece a gravar o filme. Após a conclusão da gravação, especifique um nome de arquivo no diálogo solicitado pelo software de aquisição. O filme será salvo automaticamente na pasta do projeto como um arquivo MP para análise posterior.
Para analisar os vídeos gravados, inicie o aplicativo de notebook Jupyter. Na lista de pastas que aparecem, navegue até o local onde a análise do MSPT. ipy notebook arquivo é armazenado e clique no arquivo.
Nos cadernos jupyter, o código é organizado em celas e pode ser executado passo a passo. Clique no pequeno botão Reproduzir ao lado da célula ou selecione uma célula e pressione Shift Enter para executar a célula. Comece importando todas as embalagens necessárias para a análise.
Execute a próxima célula para iniciar um prompt de arquivo. Escolha uma pasta contendo um ou vários arquivos de vídeo MP a serem analisados e pressione Selecionar pasta. Uma lista dos arquivos escolhidos está impressa abaixo da célula.
Para remover a dispersão estática dominante da luz com o algoritmo de estimativa de fundo em termos de pixel, escolha a opção mediana contínua para o modo parâmetro e defina um comprimento apropriado para a janela mediana deslizante. Opcionalmente, salve os filmes após a remoção de fundo definindo save_processed_movies True para usá-los para detecção de partículas e conexão de trajetória. Certifique-se de definir o paralelo True e GPU False para processamento na CPU ou vice-versa para processamento em uma GPU.
Partículas e sua respectiva posição são identificadas e localizadas ao longo do filme. Sintonize a sensibilidade da detecção de partículas com um parâmetro limiar que é usado para destacar os pontos do candidato por binarização de imagem. Examine o efeito de diferentes parâmetros de limiar na sensibilidade de detecção de manchas em um notebook separado chamado visualização de filme.
notebook ipy. Depois de carregar o filme no visualizador de quadros use o controle deslizante de limiar para ajustar o limiar de detecção de partículas e encontrar uma configuração apropriada. De volta ao outro notebook, escolha três parâmetros para vincular partículas em quadros consecutivos em trajetórias usando o trackpy do pacote Python.
Defina o deslocamento máximo das partículas de um quadro para o outro de acordo com a velocidade máxima de difusão esperada. Selecione o número máximo de quadros que uma partícula pode desaparecer e reaparecer, mas ainda assim ser considerada a mesma partícula. Trajetórias com poucos pontos podem ser removidas usando o parâmetro minimum_trajectory_length para uma determinação mais robusta dos coeficientes de difusão.
Corrija todos os parâmetros na célula executando-o. Execute a próxima célula para analisar todos os vídeos selecionados com os parâmetros escolhidos. Barras de progresso para cada etapa de processamento aparecerão abaixo da célula.
Isso pode demorar um pouco, dependendo do comprimento do vídeo, configurações do parâmetro e hardware. Na etapa seguinte, o software determina os coeficientes de difusão para as trajetórias encontradas na seção anterior, com base tanto na distribuição da distância de salto quanto na análise média de deslocamento quadrado. Comece especificando o filme frame_rate e pixel_size.
Corrija-os executando a célula e execute a célula seguinte e selecione o diretório pai contendo todos os arquivos CSV gerados pelo trackpy. Uma lista dos arquivos CSV encontrados está impressa abaixo da célula. Na próxima célula escolha um nome para o recipiente HDF5 onde os resultados são armazenados e executá-lo.
Finalmente execute a célula C.4 para realizar a análise de difusão. Na célula C.5 entram o contraste com os parâmetros da linha de calibração em massa, o que significa a inclinação e deslocamento determinados usando amostras de massa conhecida e executá-la para converter todos os contrastes de partículas na massa molecular. Avalie a densidade de partículas aparente na membrana executando a célula C.6, que retorna o valor médio de densidade em termos de partículas detectadas e apresenta trajetórias durante cada quadro como colunas adicionais no quadro de dados.
Para gerar o gráfico final para a correlação do coeficiente de massa e difusão, execute o D.1 da célula para carregar um prompt de arquivo e especifique o arquivo HDF5 contendo os resultados do MSPT, selecione o conjunto de dados de um único vídeo para plotar na célula D.2 ou combine os dados de vários vídeos em um único quadro de dados executando a célula D.3. Neste exemplo, uma vez que todos os vídeos são replicados de amostras idênticas, o conjunto de dados é agrupado. Finalmente plote a densidade do kernel 2D executando a célula D.4.
Se estiver satisfeito, especifique um local para salvar o plot em um arquivo PDF na célula D.5 e execute-o. Imagens representativas da rugosidade superficial de uma lâmina de tampa de vidro durante a formação de um bicamadorídeo lipídico suportado, com uma bicamada lipídica intacta apoiada, e de proteínas exemplares reconstituídas em um SLB são mostradas aqui. Todos os quatro exemplos são exibidos no modo nativo, que pode ser acessado durante a medição em si, e como imagens racionadas processadas após a remoção de fundo baseada na mediana.
Uma calibração que traduz o contraste em massa molecular pode ser alcançada anexando biomoléculas de massa conhecida a um SLB através de um complexo biotina-streptavidin-biotina. Como estratégia exemplar, pode-se usar variantes biotinilatas de albumina de soro bovino, proteína A, fosfatase alcalina e fibronectina que se ligam ao streptavidina que por si só está ligado a lipídios contendo biotina na membrana. O contraste cada vez mais pronunciado dessas macromoléculas exemplares reflete o aumento do peso molecular dos respectivos padrões biotinilados.
Ao atribuir cada pico dos histogramas de contraste à massa correspondente do estado oligômero da proteína padrão, uma relação linear entre contraste e massa é revelada e pode ser posteriormente usada para a análise de sistemas macromoléculas desconhecidos. Estimativas de densidade de kernel 2D de massa e coeficiente de difusão da tetravalent streptavidin em complexo com aldolase biotiningada ou com um anticorpo anti-Rabbit IgG de cabra modificado por biotina são mostrados aqui. As imagens representativas mostram uma comparação de massas oligômeras determinadas para o complexo de tetravalente streptavidin com aldolase ou IgG modificados por biotina e pesos moleculares esperados.
Com o MSPT, podemos rastrear biomoléculas diretamente em membranas lipídicas, determinar qual massa eles têm, como se movem e como interagem. Estou confiante de que essa técnica transformará nossa compreensão dos processos biológicos on e com membranas.
