Bu eser tarafından Ulusal Genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri Ödülü numarası R35GM124868 altında ve Duke Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

1. Kur düzeni ve uyum
<ol>
	<li>Lazer yükleme ve kolimasyon izleme uyarma<ol>
		<li>Lazer optik tabloda bir ev inşa bağlama yoluyla yapıştırmayın. Montaj delikleri lazer baş ve optik tablo için montaj ile basit alüminyum plakadır. Lazer sıkıca istikrar ve ısı dağıtımı için metal bir takma iliştirilmesi gerekir. Dalga boyu belirli bir fluorophore uygun veya deneme için seçilmiş olsa bu iş için 488 nm katı hal lazer aydınlatma (şekil 1) için kullanın. Lazer dalga boyu öncelikle iki yansıtıcılar arasında dalga plaka belirlenir 2D-EOD çalışma aralığı uygun önemli bir faktördür (şekil 1: W2). 488 nm lazer etkili ortak Floresan Etiketler canlı hücre deneylerde olan yeşil veya sarı floresan protein (GFP/YFP), heyecanlandırmak.</li>
		<li>Lazer ışını yükseklik ve Dielektrik aynalar bir çift kullanarak yönünü ayarlamak (şekil 1: M). lazer ışını optik tabloya paralel olduğundan emin olun ve uygun yüksekliğe ayarlayın. Not: Yüksekliği mikroskop platformu dayalı seçilmelidir. Açıkça değil belirtilecektir rağmen bu yükseklik bu protokol için kullanılan tüm sonraki aynalar için sağlanmalıdır.</li>
		<li>Bir çift lens ile ışın collimate (şekil 1: L1 ve L2). Lensler odak uzunlukları 2D EOD diyafram tarafından kırpılan lazer nokta önlemek için dikkatle seçilmelidir. Kırpma 2D EOD geçtikten sonra değişiklik lazer ışını şekli ile belirgindir. Burada kolimasyon kalitesi çok önemli çünkü anomalileri tarafından sonraki lensler AMPLİFİKATÖRLÜ olacaktır ve herhangi bir sapma 2D-EOD saptırma performansı bozulacaktır. İdeal olarak, ışın demeti bir noktaya en az 20 m odaklanarak collimate.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Bir iğne deliği yerleştirin (şekil 1: PH) ilk kolimasyon lens odak, uygun büyüklükte (şekil 1: L1).<ol>
		<li>Uygun ölçekli bir iğne deliği seçin. İğne deliği boyutu aşağıdaki hesaplama göre seçilebilir: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq1.jpg"> Lazer, dalga boyu λ nerede f ilk lens odak uzaklığı ise D giriş ışın çapı.</li>
		<li>İğne deliği ve sondaj ilk kolimasyon lens odak tam olarak yerleştirilebilir bir 3B Çevirme sahnede bağlarsınız.</li>
		<li>İğne deliği ve sondaj konumunu ayarlamak. Lazer güç metre sonra iğne deliği yerleştirin ve XYZ güç metre okuma en üst düzeye çıkarmak için iğne deliği konumu ayarlayın. Kırınım halkası gözlem yapılırsa, 2D-EOD önce yerleştirilen bir iris ile engelleyiniz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montajı Glan-Thompson polarize<ol>
		<li>Glan-Thompson polarize koymak (şekil 1: GP) sonra ikinci kolimasyon lens (şekil 1: L2) lazer ışını kutuplaşma temizlemek için. En fazla iletim ile yeti ölçme aygıtı bulmak için polarize döndürün.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EODs kurulumu<ol>
		<li>2 EODs kullanın (şekil 1: EOD1 &#38; EOD2) X ve Y yönde lazer saptırmak için. Lazer iletim yaw, zift ve her EOD yüksekliğini ayarlayarak en üst düzeye çıkarmak.</li>
		<li>İki EODs saygı ile her yansıtıcı kenarında üretici tarafından sağlanan hizalama işaretçisi kullanarak hizalayın.</li>
		<li>Bir sınama deseni EOD çıktısını denetlemek için 2D EOD denetleyicisine uygulamak. Bu da aşağıda açıklanan FPGA veya basit bir sinüs dalga bir işlev üreteci tarafından sağlanan üzerinden şövalyenin tur (Şekil 2) olabilir. En iyi performans için her yansıtıcı tarafından saptırma piezo nanopositioner X ya da Y yönünü paralel olmalıdır. Bu yönde iletim eksen yansıtıcılar açısal yönünü tarafından dikte edilir. 2D EOD hareket ettirmeden saptırma yönde döndürmek için piezo nanopositioner eksenleri saptırma eksenleri hizalamak için 2D EOD sonra bir güvercin prizma yerleştirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yarım dalga plaka yükleme<ol>
		<li>Bir yarı-dalga tabak yerleştirin (şekil 1: W1) Glan-Thompson polarize arasında (şekil 1: GP) ve gelen lazer hizalamak için 2D EOD 2D EOD saptırma eksen ile polarizasyon ışınlayın. Uzun odak lens (300 mm) 2D-EOD sonra yerleştirin ve sCMOS fotoğraf makinesini de lazer odak yerleştirin. Daha sonra (Şekil 2) açıklanan şövalyenin Tur oluşturmak için 2D EOD açın. Bir eşit kare lazer dağıtım fotoğraf makinesinde gözlenen kadar yarım dalga plaka döndür.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Objektif çift ve geçiş objektif çift sokmaksızın bir kiriş montajı<ol>
		<li>Lensler bir çift koyun (şekil 1: L3 ve L4) sonra objektif lens arka diyafram doldurmak için ışın genişletmek için 2D EOD (şekil 1: OL) ve başka bir çift lens (şekil 1: L5 ve L6) için geçiş için mikroskop objektif odak düzlemi. ETİKET objektif bir sonraki adımda aralarında yüklü olarak lensler bu iki çift arasında yeterli yer bıraktığınızdan emin olun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dikroik filtre, 10/90 ışın bölücü, objektif, APD, objektif lens ve floresan emisyon filtre algılama yolu tamamlamak için odaklanarak yükleyin.<ol>
		<li>Dikroik filtre kurun (şekil 1: DC) lazer objektif lens doğru yansıtacak. Düz bir uzun lens tüp alt ve üst iki süsen kullanarak objektif lens Merkezi aracılığıyla gitmek için lazer hizalayın.</li>
		<li>10/90 ışın splitter kurun (şekil 1: BS) tarafından hangi % 10'u ışık görüntüleme için bir sCMOS kamera (aşağıda açıklanmıştır) ve takibi için APD için üzerinden geçer yüzde 90'ını yansıtır.</li>
		<li>APD hizalayın. Bir coverslip üzerine lazer tarafından objektif lens odak. Coverslip gelen yansıma tüm alt öğeleri de objektif odak bir coverslip koyarak ve APD okuma yoğunluğunu kontrol hizalamak için kullanın. Işın splitter sonra objektif odak APD kurun (şekil 1: L7) APD tarafından bir 3B Çevirme Sahne Alanı'nda izledi. Öyle ki amaç lazer yansımayı lens merkezinden gider objektif getirin.</li></ol></li></ol>APD pozisyon coverslip lazer yansıması dan yoğunluğu en üst düzeye çıkarmak için 3B konumlandırma ayarlayarak optimize edilebilir. Ne zaman bir hareket dedektörü konumu herhangi bir yönde yoğunluğu azalır en uygun konumda APD konumdur.
		<li>Longpass floresan emisyon filtre kurun (şekil 1: F) yansıyan ve dağınık ışık kaldırmak için ışın ayırıcı önce.</li>
	
	
	<li>Yükleme etiketi lens<ol>
		<li>ETİKET objektif lensler iki çift arasında yer ( şekil 1arasında: L4 ve L5) olarak daha önce bahsedilen ve gösterilen şekil 1. Öyle ki ışın dik merkezi etiketi lens aracılığıyla geçer yaw, pitch, yükseklik ve yatay pozisyon ayarlayın.</li>
	</ol>
	</li>

2. numune hazırlama.
<ol>
	<li>Sabit parçacık hazırlık<ol>
		<li>190 nm floresan boncuk için seyreltik ~ 5 × 108 boncuk/mL PBS içinde. Piezoelektrik sahne örnek sahibinin 400 µL boncuk çözüm coverslip ve bağlama üzerine ekleyin (Boncuk hacmi örnek tutucu üzerinde bağlıdır; burada kullanılan örnek sahibi odası çapı 18 mm olduğunu). Burada kullanılan boncuklar için PBS üzerinde coverslip yatırmak parçacıklar neden olur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ücretsiz hareketli parçacık hazırlık<ol>
		<li>110 nm floresan boncuk için seyreltik ~ 5 × 108 boncuk/mL DI su ile. 400 µL boncuk çözüm bir coverslip üzerine ekleyin ve piezoelektrik sahne örnek tutucu monte.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. izleme parametrelerini optimize edin
<ol>
	<li>Raster tarama sabit parçacıklar<ol>
		<li>Sabit parçacık örnek mikroskobunun koymak.</li>
		<li>Lazer, micropositioner denetleyicisi, piezo nanopositioner denetleyicisi, etiket objektif denetleyicisi ve EOD denetleyicisi üzerinde açın. Not sırası önemli değildir. Piezo nanopositioner kapalı döngüde çalışacak.</li>
		<li>Raster tarama 2D-bomba imha bir şövalyenin tur (Şekil 2) sürücüler, APD sayıları toplar, piezo sürücüler bir özel tarama yazılım programı (Şekil S3, yazılım yazarlar gelen istek üzerine mevcuttur), kullanarak XYZ örnek nanopositioner ve pozisyon hesaplama (Şekil S2) gerçekleştirir. Adım boyutudur 40 nm ve tarama aralığı olduğunu 2 µm.<ol>
			<li>Coverslip de objektif odak yerleştirmek için Floresans emisyon filtreyi kaldırmak ve lazer coverslip gelen yansıma micropositioner Z konumunu bir fonksiyonu olarak sinyal şiddeti en üst düzeye çıkarmak için kullanın. Odak düzlemi, örnek yerleştirdikten sonra Floresans emisyon filtre geri yerleştirin.</li>
			<li>Tarama programını açın. Tarama aralığı ve adım boyu 'Başlat', 'son' ve 'adım' sayıyı yazarak ayarlayın. Önce bir büyük tarama aralığı ve bir parçacık (örneğin, 10 x 10 µm Aralık 200 nm adım boyu ile) bulmak için adım boyu ayarlayın. Parçacık bulma sonra tarama aralığı daraltmak ve adım boyu (örneğin, 2 x 2 µm Aralık 100 nm adım boyu ile) azaltın. Floresan odak bulmak için 3D raster tarama gerçekleştirmek için 'Tarama' düğmesini tıklatın.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Ayrıca bkz: şekil 3) etiket objektif ayarları<ol>
		<li>ETİKET objektif kontrol yazılımı üzerinde'yi tıklatın. ', 'Güç' Bağlan' sırayla tıklatın.</li>
		<li>Tetikleyici sinyalleri çıktı aşaması değiştirmek için çıkış tetik modunu değiştirmek gereklidir. Önce 'Multiplane' dan 'RGB' moduna değiştirin ve sonra tekrar değiştir. Şimdi aşama olabilir (şekil 3b) değişti.</li>
		<li>Çıkış Faz 0 °, 90 ° ve 270 ° olarak ayarlayın. Faz uzayı kapsayan herhangi bir üç aşamada kullanılabilir ise, bu üç de ampirik çalışmaya bulunur (şekil 3 c).</li>
		<li>68,500 Hz frekans ayarı seçin.</li>
		<li>Uygun frekans bulmak için genellikle frekans arama aralığı değiştirmek gereklidir. ', 'Ayarı' İleri' seçeneğini tıklatın. Değişim ' Max. Freq(Hz)' sütun 0 70.000 Hz 71,500 Hz. Bu-ebilmek var olmak ayarlamak ne olursa olsun frekans aralığı uygundur. Tıklayın 'Kalibrasyon Kaydet', 'Exit kalibrasyon' (şekil 3d).</li>
		<li>Yeni bir ayar etkin kılmak için başka bir frekans (örneğin, 189,150 Hz) rezonans geçin ve sonra 68,500 Hz frekans ayarları geri (şekil 3e) değiştirdim.</li>
		<li>Genlik yavaş yavaş % 35'e değiştirin. 'Rezonans kilitle' tıklatın. Frekans kilitlendikten sonra 'Rezonans' (şekil 3e) kilidini aç'ı tıklatın. ETİKET objektif artık kullanıma hazırdır.</li>
		<li>F. tarama aralığını x, y giriş kalibre, tahmininde tahmini konumu şekil 4eiçinde gösterildiği gibi gerçek konumuna eşit hale getirmekte kullanılan parametrelerini değiştirmek için ve z ve o zaman tıkırtı 'Tarama' düğme taşımak için XYZ örnekte taramak için parçacık hareketli lazer nokta üzerinden. Lazer odak taranmış parçacık konumunu konum tahmini döngü (Şekil S1) tarafından belirlenen tahmini parçacık pozisyonla anlaşmalıdırlar. Tahmini konumu ve gerçek konumu (şekil 4 d) arasındaki ilişki (şekil 4f) tahmini konumu görüntülerden elde edilebilir. Pozisyonlar kabul etmiyorsanız, konum tahmini döngü (Şekil S1) kullanılan lazer pozisyon (ck) değerlerini ayarlamak.</li>
		<li>ETİKET objektif Hizala<ol>
			<li>ETİKET objektif denetleyicisi kapalıyken, raster (aşağıda açıklanmıştır) parçacık görüntüleri etiketi lens takmadan önce ve sonra yükleme etiketi objektif aynı görünmelidir alınan inceden inceye gözden geçirmek. Ardından, floresan parçacık Z yığın amacı konumu ve etiket lens (şekil 4) açısını ayarlamak için z nanopositioner ile hareket ettirerek tarama gerçekleştirin. Kalmayıncaya kadar hiçbir drift parçacık Albümdeki parçacık XY pozisyonu Z konumunu (şekil 4 d) bir fonksiyonu olarak herhangi bir değişiklik olduğunda elde Z yönünde boyunca XY düzlemde etiketi objektif konumunu ayarlamak. İzleme sistemi etiketi objektif hizalamasını sonra kullanıma hazırdır.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Parçacık izlemek için sCMOS kamera kurulumu<ol>
		<li>Onlar izleniyorsa iken parçacıklar görselleştirmek için bir sCMOS kamera yükleyin. Sonra sadece tüm bileşenleri izleme sisteminin optimize ile yüklenip sCMOS yükleyin.</li></ol></li></ol>Sabit floresan parçacık örnek mikroskop üzerine yük ve objektif odak hacminde bir parçacık kilitlemek için izleme programını çalıştırın. Daha sonra 100 mm odak uzaklığı objektif yükleyin (şekil 1: L8) ve sCMOS. Böylece görüntü parçacık en küçük ve en parlak noktanın üzerine odaklanmıştır sCMOS pozisyonunu ayarlayýn.
	
	

4. serbestçe nano tanecikleri Difüzyon gerçek zamanlı 3D izleme
<ol>
	<li>Yerine 110 nm ücretsiz parçacık örnek üzerinde mikroskop hareket.</li>
	<li>Lazer, mikro-Pozisyoner denetleyicisi, piezo nanopositioner denetleyicisi, etiket objektif denetleyicisi ve EOD denetleyicisi açın. Piezo nanopositioner açık döngüde çalışacak. ETİKET lens yazılım adım 3.2 göre ayarlayın.</li>
	<li>Açın ve izleme yazılımı (yazarlar gelen istek üzerine mevcuttur) çalıştırın. Konumu, Bölüm 3'te bulunan en iyi duruma getirilmiş değerlerine tahmini parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>Coverslip de objektif odak yerleştirmek için Floresans emisyon filtreyi kaldırmak ve lazer coverslip gelen yansıma micropositioner Z konumunu bir fonksiyonu olarak sinyal şiddeti en üst düzeye çıkarmak için kullanın. Coverslip bulduktan sonra lazer coverslip uzak ve çözüm içine odaklanmak için odak pozisyon 15 µm artırın. Floresans emisyon filtre geri yer.</li>
	<li>Dahili kontrol sabitler ayarlayın. Dahili kontrol sabitler düşük bir değer başlangıç ve salınım parçacığın konum dökümanları içinde görülebilir kadar yavaş yavaş artan ayarlayabilirsiniz. Salınımlarını gözlenen sonra dahili kontrol sabitler titreşimler neden değeri % 80'i için ayarlayın. Tipik değerleri 0.012 XY 'ayrılmaz kazanç' ve 'ayrılmaz kazanç' Z için 0,004 civarında olacak.</li>
	<li>İzleme eşikleri 'Parça eşik' ve 'Parça en az' ve 'Ara' ve 'Auto Track' tıklayarak izleme deneme başlayın. Eşik Sonlandırıcı takibi için biraz arka plan düzeyi daha yüksek ayarlanır ve izleme tetikleme için eşik yaklaşık iki kat arka plan daha yüksektir. Burada, izleme tetikleme için eşik 3 kHz ve yörünge sona erdirmek için eşik 1.5 kHz.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells.">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+(STED).">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li><li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell.">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles.">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems:+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy.">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).</li><li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+sizing+of+nanoparticles+using+three-dimensional+single-particle+tracking.">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li><li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles.">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li><li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+three+dimensional+tracking+of+a+single+nanoparticle+with+concurrent+spectroscopic+readouts.">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).</li><li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved,+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions.">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li><li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells.">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li><li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots.">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope.">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Characterization+of+the+Conformation+Fluctuations+of+Freely+Diffusing+DNA:+Beyond+Rouse+and+Zimm.">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li><li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

3D tek parçacık yöntemleri izleme birçok çeşidi son yıllarda ortaya çıkan, yüksek hızlı 3D Difüzyon düşük foton sayısı hesaplı basit bir kurulum ile sağlam gerçek zamanlı izleme hala önemli biyolojik onun uygulamaya sınırlayan bir meydan okuma olsa da sorunları. 3D-DyPLoT yöntemi bu iletişim kuralı adreslerini bu sorunlar çeşitli yollarla nitelendirdi. İlk olarak, uyarma ve algılama yolları büyük ölçüde basit ve sağlam hizalama yapma diğer uygulamaları ile karşılaştırıldığında basitleştirilmiştir. İkinci olarak, hareketli lazer nokta ve konum tahmin algoritması kesin konum tahminleri için geribesleme geribildirim daha istikrarlı hale sağlamak. Üçüncü olarak, dinamik olarak hareketli lazer nokta etkili büyük algılama aralığı (1 x 1 x 4 µm) için hızlı hareket eden parçacıkların izlenmesini sağlar. Neden bu büyük Saptama alanında kritik olduğunu görmek için Piezoelektrik nanopositioner içsel tepki süresi dikkate almak önemlidir. Yüksek hızlı piezoelektrik aşamaları 1 kHz, 1 Bayan 1 ms, 4 µm2/s Difüzyon katsayısı ile 100 nm nanopartikül sırasına olmak yanıt zaman sınırlandırılması sırasına rezonanslar var, ortalama 90 nm kırınım-li ortasından diffüz mited algılama birimi. Bu sadece ortalama deplasman ve gerçekten rastgele hareket adımları çok bu odak cilt bırakarak ve geçerli yörünge bitiş parçacık önde gelen daha büyük sergileyecek. Durum, giderek daha büyük termal diffusive adımları takip kaybına yol nereye daha küçük parçacıklar için bile kötüdür. İçsel piezoelektrik sahne gecikme üstesinden gelmek ve genel sağlamlık izleme mekanizması artan büyük diffusive atlar parçacık pozisyonda kurtarmak izleme sistemi için etkili bir şekilde büyük algılama alanı sağlar. Son olarak, büyük tarama alanı kolayca yeni parçacıklar, hızlı bir şekilde elde edilebilir için ardışık yörüngeler ve derlenmiş büyük veri kümeleri için izin almak sistem sağlar.
Kullanıcı bazı önemli adımlar vardır tutmalı. İlk olarak, 2D-EOD ve etiket lens hizalamasını kritiktir. Her ikisi de en iyi hassasiyet elde etmek için hizalı gerekir. İkinci olarak, adım tarama sabit parçacık pozisyon tahmininde kullanılan parametreleri de ayarlanması gerekir (bkz. şekil 4). Tahmini parçacık pozisyon lazer tarama aralığı merkezine karşılık gelen parçacık konumuna uygun. Son olarak, geri bildirim integral sabitleri (Kben) dikkatle, küçük bir değerle başlayan ve salınım gözlenen kadar ramping sonra bu değeri yaklaşık % 80 kapalı destek şekilde ayarlanmış.
İstenen uygulamaya bağlı olarak akılda tutmak için 3D-DyPLoT hakkında bir kaç uyarılar vardır. En iyi duruma getirilmiş konum tahmini Albert ile kullanılmak üzere tasarlanmış olsa da, bu da doğru yönlü hareket uygundur. Ondan beri onun'sadece Gauss, gerçek parçacık pozisyon olarak kabul edilir pozisyonu belirsizlik algoritma doğrudan herhangi bir hareket türü için uygulanabilir. Nerede kalıcı lineer hareket bekleniyor durumlar için ek bir terim konum tahmin algoritması tahmin vadede eklenebilir ( Denklem 3 Tamamlayıcı bilgilerbakın).
2D-EOD ve etiket için parametreleri yelpazesi dikkatle 3D-DyPLoT ayarlarken dikkate alınmalıdır. Belirli 2D-EOD tarafından taranan şövalyenin tur için kullanılan depo gözü zaman önemlidir. İdeal bir senaryoda, şövalyenin tur etkili örnekleme sağlamak için etiket objektif dönemine senkronize edilebilir. Ancak, bu değişiklikleri gerilim içinde adım için 2D EOD tepki süresi dikkate almak önemlidir. Burada kullanılan birim için istenen noktaya ulaşamadan gerilim uygulandıktan sonra 2-3 µs tepki süresi vardır. 20 µs bin anda koleksiyon zaman yaklaşık % 10-15 bu. ETİKET objektif döneminde eşleşmesi azaltmak belgili tanımlık zaman ~ 14 µs 2D EOD gecikme zamanı bin zaman kısmını artırır. Bu tahminleri lazer konumu ve yanlış konumu yanlış değerleri için yol açar.
Başka bir dikkat edilmesi gereken deneyci için zamansal çözünürlük faktördür. Burada gösterilen veri 100 kHz veri hızı toplanan iken, son zamansal çözünürlük sonuçta hangi pozisyon ölçüm için veri kullanılır tanımlanır. Nanopositioner okuma parçacık pozisyon (şekil 6) kullanılırsa, zamansal çözünürlük dahili kontrol sabit değeri temel bağlıdır. Örneğin, şekil 6aiçinde-d, gösterilen dahili kontrol için Sahne 1 sırasına yanıttır şekil 6eiken-h, daha hızlı zamansal çözünürlük isterseniz sırasını 10 Bayan öyle için ms sonra konum tahmin algoritması sonucu foton foton foton sayısı oranı ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Örneğin, bir 10 kHz emisyon oranı 100 µs zamansal çözünürlük verir ve 100 kHz emisyon oranı 10 µs zamansal çözünürlük verir. Ayrıca, hassas takip beri bir <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq2.jpg"> ilişki41, kayma ve temporal hassas birleştiğinde. Sonuç olarak, sonda parlaklığını kayma ve temporal duyarlığı belirler.
Bu protokol için kurulum, düzen ve izleme yöntemini bir 2D-EOD ve dinamik olarak hızlı parçacık konum tahmini elde etmek için bir odaklı lazer nokta taşımak için etiket lens kullanan bir yüksek hızlı gerçek zamanlı 3D tek parçacık hizalamasını nitelendirdi. Sonra örnek hazırlama ve parametre optimizasyon yöntemleri tarif. 3D-DyPLoT hızlı hareket eden ve mütevazı diffusive parçacıklar yayan kilit için sağlam ve nispeten basit bir yöntem sağlar. Böylece görüntüleme modüller ile kombine kolayca herhangi bir varolan mikroskop stand yan-port eklenmesi için basit optik düzeni sağlar. Bu iletişim kuralıyla, RT-3D-SPT daha yaygın olarak üç boyutlu biyolojik süreçlerin daha fazla müfettişler tarafından hızlı, yönelik olarak uygulanan olabilir umuyoruz.

Gelişmiş görüntüleme teknikleri ortaya çıkması tüm yol aşağı moleküler seviyede hücresel olayların her zamankinden daha detaylı yapısını görmek için bir pencere açtı. Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)1,2,3, fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM)4,5,6,7 gibi yöntemleri , yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)8,9,10,11ve uyarılmış emisyonu tükenmesi mikroskobu (STED)12,13, 14 kadar yapısı ve fonksiyonu canlı hücre benzersiz detay sunmak için kırınım sınırını aşan gitti. Ancak, nasıl bu sistemlerinden davranır tam anlayış dinamik bilgi hem de yapısal bilgi gerektirir. Yukarıda listelenen süper çözünürlük yöntemleri Uzaysal çözünürlük ve zamansal çözünürlük, hangi ile dinamik süreçler probed zamansal hassas sınırlama arasında bir denge içerir. Sağlar yüksek uzaysal duyarlık ve zamansal çözünürlük RT-3D-SPT15,16,17,18,19,20bir yöntem 21,22,23,24,25,26,27,28,29. Burada, bir ayrım çizmek arasında geleneksel 3D-SPT30 ve RT-3D-SPT. geleneksel 3D-SPT sadece (ve ya kullanarak confocal mikroskop ya da bir epifluorescence mikroskobu alınan üç boyutlu görüntü verilerini bir saat serisi gerektirir «««verilir) doğru yapılandırma. Geleneksel 3D SPT içinde parçacık koordinatlarını veri toplama sonra parçacık her görüntü yığınında bulma ve art arda gelen birimler yerlerde birleştirerek oluşan bir yörünge oluşturmak için belirler. Bu yöntemler için nihai zamansal çözünürlük hacimsel görüntüleme hızı tarafından belirlenir. Kolayca saniye saniye onlarca ölçekte bu confocal mikroskoplar için. Neyin Aksiyel konum bilgileri elde edilebilir böylece optik yol manipüle, epifluorescence yöntemleri için zamansal çözünürlük fotoğraf makinesi Pozlama veya okuma zaman sınırlıdır. Bu epifluorescent yöntemler üzerinde eksenel bilgiler toplanabilir aralığında sınırlıdır, Fourier uçak aşamasında son ilerleme maskeleri rağmen tasarım ve adaptif optik uzanan bu aralıklar 10 µm veya daha fazla31,32 , 33 , 34.
Buna ek olarak, RT-3D-SPT bir 3D görüntü yığını edinme ve parçacıklar aslında sonra bulma dayanmaz. Bunun yerine, gerçek zamanlı konum bilgileri tek nokta dedektörleri ile elde edilir ve geri bildirim için etkili bir şekilde "kullanımı ile bir yüksek hızlı piezoelektrik sahne objektif lens odak hacmine parçacık kilit" uygulanır. Bu parçacığın konum sınırlı sürekli ölçümü sadece kaç fotonlar toplanabilir tarafından sağlar. Ayrıca, uzun aralıklarında hareket ederken bu yöntem parçacık spektral sorgulama sağlar. RT-3D-SPT etkin inşaat benzer-e doğru neyin parçacık sürekli probed ve büyük lazer gücü gerek kalmadan gerçek zamanlı veya optik ölçülen Nano nesneleri, kuvvet-Alerjik optik tuzak zorlar. Verilen bu RT-3D-SPT hızlı diffusive nesneleri (ilâ 20 µm2/s)25,29 düşük foton sayısı oranları20,29üç boyutlu olarak sürekli sorgulama için bir araç sağlar, 35, bunu sağlamak bir pencere içine hızlı veya geçici biyolojik süreçlerin hücre içi kargo taşımacılığı, ligand-reseptör bağlama ve tek virions ekstrasellüler dinamikleri gibi. Ancak, şu ana kadar RT-3D-SPT uygulanması bu teknoloji ilerlemek için çalışma grupları avuç sınırlı olmuştur.
Çeşitlidir RT-3D-SPT yöntemler tarafından gerekli optik düzen karmaşıklığı bir engeldir. En yöntemleri için optik görüş piezoelektrik bir sahne ile sağlanır. İçinde X, Y veya Z, dökümanları tek nokta dedektörleri üzerinden hata işlevleri için dönüştürülür ve de beslenen parçacık yapar küçük hareketleri olarak piezoelektrik nanopositioner için yüksek hızlı içinde açmak parçacığın hareketi, etkili bir şekilde karşı koymak için örnek taşır yerde objektif lens göreli kilitleme. X, küçük pozisyonel hareketleri ölçmek için Y ve Z, birden çok Dedektörler (4 veya 5 uygulama bağlı olarak)15,18,21 ya da birden çok uyarma noktalar (2-4, hangi daha düşük eğer uygulanabilir bir amplifikatör kilit-in X ayıklamak için kullanılır ve bir döner kullanarak Y konumunu lazer nokta)25,28 uygulanır. Bu birden fazla algılama ve emisyon noktalarından örtüşme sistemleri hizalayın ve korumak zor yapmak.
Burada, biz 3D-DyPLoT29denen bir basitleştirilmiş optik tasarımı ile yüksek hızlı hedefe kitlendik 3D-SPT yöntemi mevcut. 3D-DyPLoT dinamik olarak odaklı lazer nokta yüksek bir oranı (50 kHz XY, 70 kHz Z) objektif odak seste aracılığıyla taşımak için bir 2D EOD ve etiket objektif36,37,38 kullanır. Lazer odak konumu ve foton varış saati birleştiren parçacığın 3B konumlandırma hızla bile düşük foton sayısı oranları elde edilecek sağlar. 1 x 1 µm X-Y düzlemde bir kare boyutu ile bir şövalyenin Tur Model39 ' lazer odak 2D EOD sürücüler ve etiket objektif lazer odak aralığı 2-4 µm ile eksenel yönde hareket eder. 3D parçacık pozisyon bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması29,40 3D ile elde edilir. Çığ fotodiyot (APD), gerçek zamanlı parçacık pozisyonu hesaplama, piezoelektrik sahne geri bildirim ve veri kayıt sayma 3D dinamik olarak hareketli lazer nokta, foton kontrolünü bir alan programmable gate array (FPGA) yapılmaktadır.Bu iletişim kuralı, biz 3D-DyPLoT mikroskop optik uyum, kalibrasyon ile sabit parçacıklar, dahil olmak üzere adım adım inşa etmek nasıl açıklar ve nihayet parçacık izleme ücretsiz. Bir gösteri 110 nm floresan boncuk sürekli suda dakika bir anda için takip.
Burada açıklanan yöntemi nerede sürekli virüsler, nano tanecikleri ve veziküller gibi endosomes gibi düşük seviyelerde hafif, hızlı hareket eden floresan sonda izlemek için istenen herhangi bir uygulama için ideal bir seçim var. Önceki yöntemler aksine, yalnızca bir tek uyarma ve tek algılama yolu, hizalama ve bakım basit yapma işte. Ayrıca, kolayca düşük sinyal seviyeleri (aşağı 10 kHz), izleme özelliği bu yöntem düşük ışık uygulamaları29için ideal yapar iken hızlı parçacıklar, difüzyon kadar almak bu mikroskop büyük algılama alanı sağlar.

<table><tbody><tr><td>2D Electro-optic Deflector&amp;nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 required</td></tr><tr><td>Power supply for EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td></tr><tr><td>TAG&amp;nbsp; Lens</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Used to deflect laser along axial direction</td></tr><tr><td>XY piezoelectric nanopositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelectric nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td></tr><tr><td>Micropositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Used to coarsely position sample and evaluate</td></tr><tr><td>Objective Lens</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Used to monitor the particle&#039;s position</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Lower dark counts beneficial</td></tr><tr><td>Field programmable gate array</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking excitation laser</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizer</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Half-wave plate</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dichroic Mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Fluorescence Emission Filter</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

Gerçek zamanlı üç boyutlu tek parçacık (RT-3D-SPT) izleme hücresel sistemlerinde hızlı, 3D işlemler ışık potansiyeline sahiptir. Her ne kadar son yıllarda çeşitli RT-3D-SPT yöntemler ileri koymak, yüksek hızlı izleme düşük foton sayısı oranları parçacıklar Difüzyon 3D bir meydan kalır. Ayrıca, RT-3D-SPT kurulumları genellikle biyolojik ilgili sorunların yaygın uygulama sınırlama uygulamak, zor ve karmaşık. Bu iletişim kuralı düşük foton sayısı hesaplı (aşağı 10 kHz) 3D dinamik foton yerelleştirme hangi parçacıklar (en fazla 20 µm2/s) yüksek diffusive hız ile izleyebilirsiniz izleme (3D-DyPLoT), adlı bir RT-3D-SPT sistemi sunar. Akort akustik degrade (TAG) objektif bir tek odaklı sürücü lazer nokta dinamik olarak 3D ve 3D-DyPLoT bir 2D elektro-optik saptırıcı (2D-EOD) istihdam. Bir en iyi duruma getirilmiş konum tahmin algoritması ile birlikte, 3D-DyPLoT yüksek izleme hız ve yüksek yerelleştirme hassasiyet ile tek parçacıklar üzerine kilitleyebilirsiniz. Tek uyarma ve tek algılama yol yerleşim nedeniyle, 3D-DyPLoT sağlam ve kurulumu kolay. Bu iletişim kuralı, 3D-DyPLoT adım adım inşa anlatılmaktadır. İlk olarak, optik düzen açıklanmıştır. Ardından, sistemi kalibre edilmiş ve 190 nm floresan boncuk piezoelektrik nanopositioner ile tarama raster tarafından optimize edilmiştir. Son olarak, gerçek zamanlı 3D yetenek izleme göstermek için 110 nm floresan boncuk suda izlenir.

Sabit parçacık (şekil 4) tarama ve izleme serbestçe akışkanın 110 nm floresan parçacık (şekil 5) Yukarıdaki protokol sonrası yapıldı. Parçacık tarama tarama, her bir noktada pozisyon aynı anda parçacığın hesaplama tahmini piezoelektrik nanopositioner ve depo gözü fotonlar hareket tarafından gerçekleştirildi. Bir kare bile yoğunluk (şekil 4a) tarama görüntü gösterir ve tahmini konumları parçacığın gerçek konumu x, 1 × 1 × 2 µm aralığında doğrusal bir ilişki göstermek y ve z yön (şekil 4b-f).
Gerçek zamanlı izleme göstermek için 110 nm floresan parçacıklar suda 3D-DyPLoT tarafından (şekil 5a, b) takip. Ortalama kare deplasman (MSD) analiz tipik bir doğrusal davranışı karakteristik Albert hareket (şekil 5 c) gösterir. 30 yörüngeleri MSD analizi gösterdi demek hidrodinamik çapı 110 nm, iyi anlaşma ile izlenen floresan nano tanecikleri (şekil 5 d) boyutu için üreticileri tayini. Ayrıca, film 1 gerçek zamanlı piezoelektrik nanopositioner sonuçlar gösterir ve sCMOS görüntüler bir serbestçe akışkanın 110 nm floresan parçacık 2 dk uzun yörüngesini için senkronize.
Yüksek hız ile izlemek mümkün olmanın yanı sıra, yavaş hareket eden parçacıkları ile yüksek hassasiyetli yerelleştirilebilir. Şekil 6a - d gösterir sabit parçacıkların aynı geri bildirim parametreleri olarak kullanılacak izleme, 17,6, 26,4 ve 53.4 duyarlığını gösterilen yüksek hız için kullanma 3D-DyPLoT sistemi uygulamaya nm x, Y ve Z, sırasıyla 10 foton sayısı oranı ile5. Şekil 6e - h geribildirim kontrolünde etkili hız hassasiyet için takas ve 6.5, 8.3 ve 10,5 duyarlığını sergilenmesi 10 katına azaltılmış duyarlık gösterir nm x, Y ve Z, anılan sıraya göre.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig1.jpg"> 
Şekil 1. 3D takip sistemi şematik. 2D EOD (EOD1 &#38; EOD2) ve etiket lens (TAG) saptırmak lazer XY ve Z yön boyunca sırasıyla. (APD) APD FPGA (FPGA) gönderilen Floresans fotonlar toplamak için kullanılır. FPGA pozisyonu hesaplama algoritması, foton sayma, 2D-EOD kontrolünü yanı sıra denetim ve okuma piezoelektrik nanopositioner (NSxy ve NZz) için kullanılır. Bu şekilde etiketli diğer bileşenleri: aynalar (M); lensler (L #); iğne deliği (PH); Glan-Thompson polarize (GP); yarım dalga plaka (W1); dikroik filtre (DC); objektif lens (OL, 100 X NA 1.49 =); Floresans emisyon filtre (F); ışın ayırıcı (BS); XY micropositioner sahne (MSxy); Z micropositioner sahne (MSZ'den). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig2.jpg"> 
Şekil 2. Koordinatları 3B-DyPLoT içinde uygulanan şövalyenin tur için. Eksen 1 ve eksen 2 X veya Y ekseni boyunca 2D EOD doğru hizalaması tarafından uyumlaştırılması gerekmektedir. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig3.jpg"> 
Şekil 3. ETİKET objektif yazılım ayarları. Daha fazla bilgi için Bölüm 4.2 etiketi objektif ayarlarına bakın. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig4.jpg"> 
Şekil 4. Parçacık tarama ve konum tahmini. (a) 190 nm floresan tarama görüntü boncuk 2D-EOD lazer bir 1 × 1 µm sürüş ile knight's tur desen kare. Floresan yoğunluğu renkle gösterilir. Birim: kHz. (b) x tahminik, 2D-bomba imha merkezine göre parçacığın konum mikrometre içinde inceden inceye gözden geçirmek. B, cve d renk tahmini konumu gösterir. Birim: µm. (c) tahmini yk mikrometre. (d) zk, etiket objektif Aksiyel Merkezi göre parçacığın konum tahmini mikrometre içinde tarama. (e) tahmini parçacık konum yk sahne bir fonksiyonu olarak pozisyon (c) tüm ızgara üzerinde ortalama. Not konum tahmin algoritması (yk) alınan tahmini parçacık pozisyon gerçek konumu ile kabul eder. (f) tahmini parçacık pozisyon zk sahne bir fonksiyonu olarak pozisyon (d) tüm ızgara üzerinde ortalama. 1 × 1 × 2 µm Aralık üzerinde parçacığın gerçek pozisyon doğrusal bir ilişki tahmini konumu gösteren X, Y ve Z yönünde. Not konum tahmin algoritması (zk) alınan tahmini parçacık pozisyon gerçek konumu ile kabul eder. X, Y, 1 × 1 × 2 µm Aralık üzerinde parçacığın gerçek pozisyon doğrusal bir ilişki tahmini konumu gösterir ve Z yönünde. Beyaz ölçek barlar (bir-c) temsil 500 nm ve siyah ölçek çubuğu (d) 2 µm. temsil eden <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig5.jpg"> 
Şekil 5.110 nm floresan parçacıklar suda ıslatın ve 3D-DyPLOT izleme. bir serbestçe akışkanın 110 nm floresan nanopartikül su (bir) 3D yörünge. (b) (bir) içinde yörünge için zamanın bir fonksiyonu olarak floresan yoğunluğu. (c) (bir) içinde yörünge MSD. Mavi çizgili ölçülen MSD ise noktalı kırmızı çizgi en uygun doğrusal regresyon üzerinden çizgidir. ortalama bir hidrodinamik çap 110 gösterilen 30 yörüngeleri analizini (d) MSD nm, izlenen floresan nano tanecikleri iyi anlaşma boyutu ile. Parçacıklar çapını Stokes-Einstein ilişkisine kullanılarak hesaplanır. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig6.jpg"> 
Şekil 6. Hassas izleme sabit parçacığın. (bir) A sabit parçacık 3D-DyPLoT farklı sayısı hesaplı tarafından takip edilir. Hassas x (b) 17,6 nm, (c) 26,4 nm içinde Y ve z (d) 53.4 nm'de 100 kHz bir emisyon oranı var. (ne zaman yavaş işlemlerin, geribildirim kontrol sondalamae) sabiti (Kben) hassas artırın-10 katına azaltılabilir. Bu azaltılmış geribildirim kontrol altında duyarlık (f) 6.5 nm x, (g) 8.3 nm içinde Y ve z (h) 10,5 nm'de 100 kHz bir emisyon oranı var. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Rakam S1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_S1_position_estimation-01.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Rakam S2. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_s2_TAG_operation.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Rakam S3. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_s3_software.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tamamlayıcı bilgiler. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/170802_software_description.pdf">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Görüntüleme.  Duke University. İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Video: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Image-based Lagrangian Particle Tracking in Bed-load Experiments

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a relatively low cost. This manuscript describes an application of particle tracking velocimetry (PTV) to a bed-load experiment with lightweight sediment. The key characteristics of the investigated sediment transport conditions were the presence of a covered flow and of a fixed rough bed above which particles were released in limited number at the flume inlet. Under the applied flow conditions, the motion of the individual bed-load particles was intermittent, with alternating movement and stillness terms. The flow pattern was preliminarily characterized by acoustic measurements of vertical profiles of the stream-wise velocity. During process visualization, a large field of view was obtained using two action-cameras placed at different locations along the flume. The experimental protocol is described in terms of channel calibration, experiment realization, image pre-processing, automatic particle tracking, and post-processing of particle track data from the two cameras. The presented proof-of-concept results include probability distributions of the particle hop length and duration. The achievements of this work are compared to those of existing literature to demonstrate the validity of the protocol.

The manuscript presents a protocol for the conduction of bed-load sediment transport experiments where the moving particles are tracked by image analysis. The experimental facility, the procedures for run realization and data processing, and finally some proof-of-concept results are presented here.

Yatak Yüklü Deneylerde Görüntü Tabanlı Lagrangian Parçacık İzleme

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a ...

Çevre

Three-dimensional Particle Tracking Velocimetry for Turbulence Applications: Case of a Jet Flow

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic recording of image sequences. The basic components, features, constraints and optimization tips of a 3D-PTV topology consisting of a high-speed camera with a four-view splitter are described and discussed in this article. The technique is applied to the intermediate flow field (5 &#60;x/d &#60;25) of a circular jet at Re &#8776; 7,000. Lagrangian flow features and turbulence quantities in an Eulerian frame are estimated around ten diameters downstream of the jet origin and at various radial distances from the jet core. Lagrangian properties include trajectory, velocity and acceleration of selected particles as well as curvature of the flow path, which are obtained from the Frenet-Serret equation. Estimation of the 3D velocity and turbulence fields around the jet core axis at a cross-plane located at ten diameters downstream of the jet is compared with literature, and the power spectrum of the large-scale streamwise velocity motions is obtained at various radial distances from the jet core.

A three-dimensional particle tracking velocimetry (3D-PTV) system based on a high-speed camera with a four-view splitter is described here. The technique is applied to a jet flow from a circular pipe in the vicinity of ten diameters downstream at Reynolds number Re &#8776; 7,000.

Türbülans Uygulamaları için üç boyutlu Parçacık Takip Akımları: Jet Akış Örneği

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic ...

Mühendislik

Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

Katalitik Yüzme Cihazların Hazırlanması ve 3D İzleme

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Biyokimya

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Biyomühendislik

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

Sıcaklık Kullanarak Mikrotübül Bazlı 3D Aktif Sıvıların Akış Hızlarını Kontrol Etme

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Nörobilim

Protocol for Analysis and Consolidation of TrackMate Outputs for Measuring Two-Dimensional Cell Motility using Nuclear Tracking

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To understand the regulation of cell motility, we must be able to measure it easily and consistently under different conditions. Here we describe a method for measuring and quantifying single-cell and bulk motility of HaCaT keratinocytes using a nuclear stain. This method includes a MATLAB script for analyzing TrackMate output files to calculate displacements, motility rates, and trajectory angles in single cells and in bulk for an imaging site. This motility analysis script allows for quick, straightforward, and scalable analysis of cell motility rates from TrackMate data and could be broadly used to identify and study the regulation of motility in epithelial cells. We also provide a MATLAB script for reorganizing microscopy videos collected on a microscope and converting them to TIF stacks, which can be analyzed using the ImageJ TrackMate plugin in bulk. Using this methodology to explore the roles of adherens junctions and actin cytoskeletal dynamics in regulating cell motility in HaCaT keratinocytes, we demonstrate evidence that Arp2/3 activity is required for the elevated motility seen after &#945;-catenin depletion in HaCaT keratinocytes.

This protocol for high-throughput measurement of cell motility in HaCaT keratinocytes describes methods for collecting and processing images of cell nuclei and performing particle tracking using the ImageJ plugin TrackMate.

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To ...