وأيد هذا العمل بالمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة R35GM124868 وجامعة ديوك.

<ol>
	<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Jones, S. A., Shim, S. H., He, J., Fast Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+three-dimensional+super-resolution+imaging+of+live+cells.">Fast, three-dimensional super-resolution imaging of live cells.</a> Nat. Methods. 8 (6), 499-505 (2011).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Shtengel, G., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., Lippincott-Schwartz, J., Gillette, J. M., Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferometric+fluorescent+super-resolution+microscopy+resolves+3D+cellular+ultrastructure.">Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 3125-3130 (2009).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+photoactivated+localization+microscopy+of+nanoscale+adhesion+dynamics.">Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics.</a> Nat. Methods. 5 (5), 417 (2008).</li><li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination.">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044 (2011).</li><li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination.">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Carlton, P. M., Haase, S., Shao, L., Winoto, L., Kner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).</li><li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Persson, F., Bingen, P., Staudt, T., Engelhardt, J., Tegenfeldt, J. O., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Nanoscopy+of+Single+DNA+Molecules+by+Using+Stimulated+Emission+Depletion+(STED).">Fluorescence Nanoscopy of Single DNA Molecules by Using Stimulated Emission Depletion (STED).</a> Angew. Chem. 50 (24), 5581-5583 (2011).</li><li>Hein, B., Willig, K. I., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulated+emission+depletion+(STED)+nanoscopy+of+a+fluorescent+protein-labeled+organelle+inside+a+living+cell.">Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14271-14276 (2008).</li><li>Klar, T. A., Jakobs, S., Dyba, M., Egner, A., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy+with+diffraction+resolution+barrier+broken+by+stimulated+emission.">Fluorescence microscopy with diffraction resolution barrier broken by stimulated emission.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (15), 8206-8210 (2000).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-resolution+3D+visualization+of+the+early+stages+of+cellular+uptake+of+peptide-coated+nanoparticles.">Multi-resolution 3D visualization of the early stages of cellular uptake of peptide-coated nanoparticles.</a> Nat. Nano. 9 (3), 198-203 (2014).</li><li>Welsher, K., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+behavior+of+molecules+in+biological+systems:+breaking+the+3D+speed+barrier+with+3D+multi-resolution+microscopy.">Imaging the behavior of molecules in biological systems: breaking the 3D speed barrier with 3D multi-resolution microscopy.</a> Faraday Discuss. 184, 359-379 (2015).</li><li>Xu, C. S., Cang, H., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+quantitative+sizing+of+nanoparticles+using+three-dimensional+single-particle+tracking.">Rapid and quantitative sizing of nanoparticles using three-dimensional single-particle tracking.</a> J. Phys. Chem. C. 111 (1), 32-35 (2007).</li><li>Cang, H., Xu, C. S., Montiel, D., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guiding+a+confocal+microscope+by+single+fluorescent+nanoparticles.">Guiding a confocal microscope by single fluorescent nanoparticles.</a> Opt. Lett. 32 (18), 2729-2731 (2007).</li><li>Cang, H., Wong, C. M., Xu, C. S., Rizvi, A. H., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+three+dimensional+tracking+of+a+single+nanoparticle+with+concurrent+spectroscopic+readouts.">Confocal three dimensional tracking of a single nanoparticle with concurrent spectroscopic readouts.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (22), 223901 (2006).</li><li>Han, J. J., Kiss, C., Bradbury, A. R. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved,+Confocal+Single-Molecule+Tracking+of+Individual+Organic+Dyes+and+Fluorescent+Proteins+in+Three+Dimensions.">Time-Resolved, Confocal Single-Molecule Tracking of Individual Organic Dyes and Fluorescent Proteins in Three Dimensions.</a> ACS Nano. 6 (10), 8922-8932 (2012).</li><li>Wells, N. P., Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Phipps, M. E., Cutler, P. J., Lidke, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Three-Dimensional+Molecular+Tracking+in+Live+Cells.">Time-Resolved Three-Dimensional Molecular Tracking in Live Cells.</a> Nano Lett. 10 (11), 4732-4737 (2010).</li><li>Lessard, G. A., Goodwin, P. M., Werner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tracking+of+individual+quantum+dots.">Three-dimensional tracking of individual quantum dots.</a> Appl. Phys. Lett. 91 (22), (2007).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramolecular+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+in+a+Feedback+Tracking+Microscope.">Intramolecular Fluorescence Correlation Spectroscopy in a Feedback Tracking Microscope.</a> Biophys. J. 99 (1), 313-322 (2010).</li><li>McHale, K., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Characterization+of+the+Conformation+Fluctuations+of+Freely+Diffusing+DNA:+Beyond+Rouse+and+Zimm.">Precise Characterization of the Conformation Fluctuations of Freely Diffusing DNA: Beyond Rouse and Zimm.</a> J. Am. Chem. Soc. 131 (49), 17901-17907 (2009).</li><li>McHale, K., Berglund, A. J., Mabuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+Dot+Photon+Statistics+Measured+by+Three-Dimensional+Particle+Tracking.">Quantum Dot Photon Statistics Measured by Three-Dimensional Particle Tracking.</a> Nano Lett. 7 (11), 3535-3539 (2007).</li><li>Juette, M. F., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Tracking+of+Single+Fluorescent+Particles+with+Submillisecond+Temporal+Resolution.">Three-Dimensional Tracking of Single Fluorescent Particles with Submillisecond Temporal Resolution.</a> Nano Lett. 10 (11), 4657-4663 (2010).</li><li>Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Br&#228;uchle, C., Gratton, E., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Nanomicroscopy+via+Three-Dimensional+Single-Particle+Tracking.">Real-Time Nanomicroscopy via Three-Dimensional Single-Particle Tracking.</a> ChemPhysChem. 10 (14), 2458-2464 (2009).</li><li>Perillo, E. P., Liu, Y. -. L., Huynh, K., Liu, C., Chou, C. -. K., Hung, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+high-resolution+three-dimensional+tracking+of+single+particles+using+nonlinear+and+multiplexed+illumination.">Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination.</a> Nat Commun. 6, (2015).</li><li>Hou, S., Lang, X., Welsher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+real-time+3D+single-particle+tracking+using+a+dynamically+moving+laser+spot.">Robust real-time 3D single-particle tracking using a dynamically moving laser spot.</a> Opt. Lett. 42 (12), 2390-2393 (2017).</li><li>Chenouard, N., Smal, I., de Chaumont, F., Maska, M., Sbalzarini, I. F., Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+comparison+of+particle+tracking+methods.">Objective comparison of particle tracking methods.</a> Nat Meth. 11 (3), 281-289 (2014).</li><li>Shechtman, Y., Weiss, L. E., Backer, A. S., Sahl, S. J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+3D+scan-free+multiple-particle+tracking+over+large+axial+ranges+with+Tetrapod+point+spread+functions.">Precise 3D scan-free multiple-particle tracking over large axial ranges with Tetrapod point spread functions.</a> Nano Lett. 15 (6), 4194-4199 (2015).</li><li>Lee, H. -. l. D., Sahl, S. J., Lew, M. D., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double-helix+microscope+super-resolves+extended+biological+structures+by+localizing+single+blinking+molecules+in+three+dimensions+with+nanoscale+precision.">The double-helix microscope super-resolves extended biological structures by localizing single blinking molecules in three dimensions with nanoscale precision.</a> Appl. Phys. Lett. 100 (15), 153701 (2012).</li><li>Pavani, S. R. P., Thompson, M. A., Biteen, J. S., Lord, S. J., Liu, N., Twieg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional,+single-molecule+fluorescence+imaging+beyond+the+diffraction+limit+by+using+a+double-helix+point+spread+function.">Three-dimensional, single-molecule fluorescence imaging beyond the diffraction limit by using a double-helix point spread function.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (9), 2995-2999 (2009).</li><li>Sancataldo, G., Scipioni, L., Ravasenga, T., Lanzan&#242;, L., Diaspro, A., Barberis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+multiple-particle+tracking+with+nanometric+precision+over+tunable+axial+ranges.">Three-dimensional multiple-particle tracking with nanometric precision over tunable axial ranges.</a> Optica. 4 (3), 367-373 (2017).</li><li>Balzarotti, F., Eilers, Y., Gwosch, K. C., Gynn&#229;, A. H., Westphal, V., Stefani, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer+resolution+imaging+and+tracking+of+fluorescent+molecules+with+minimal+photon+fluxes.">Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes.</a> Science. 355 (6325), 606 (2017).</li><li>Duocastella, M., Theriault, C., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+particle+tracking+via+tunable+color-encoded+multiplexing.">Three-dimensional particle tracking via tunable color-encoded multiplexing.</a> Opt. Lett. 41 (5), 863-866 (2016).</li><li>Duocastella, M., Sun, B., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+multiple+focal+planes+for+three-dimensional+microscopy+using+ultra-high-speed+adaptive+optics.">Simultaneous imaging of multiple focal planes for three-dimensional microscopy using ultra-high-speed adaptive optics.</a> BIOMEDO. 17 (5), (2012).</li><li>Mermillod-Blondin, A., McLeod, E., Arnold, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+varifocal+imaging+with+a+tunable+acoustic+gradient+index+of+refraction+lens.">High-speed varifocal imaging with a tunable acoustic gradient index of refraction lens.</a> Opt. Lett. 33 (18), 2146-2148 (2008).</li><li>Wang, Q., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+strategy+for+trapping+single+fluorescent+molecules+in+solution+using+the+ABEL+trap.">Optimal strategy for trapping single fluorescent molecules in solution using the ABEL trap.</a> Appl. Phys. B. 99 (1), 23-30 (2010).</li><li>Fields, A. P., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+tracking+of+a+Brownian+particle.">Optimal tracking of a Brownian particle.</a> Opt. Express. 20 (20), 22585-22601 (2012).</li><li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophys. J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li></ol>

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

على الرغم من أن العديد من أصناف الجسيمات واحدة 3D تتبع أساليب ظهرت في السنوات الأخيرة، تتبع في الوقت الحقيقي قوية لنشر عالية السرعة 3D أسعار العد فوتون منخفضة مع إعداد بسيطة لا تزال تشكل تحديا، مما يحد من تطبيقه على الأهمية البيولوجية مشاكل. وصف الأسلوب 3D-ديبلوت في هذه عناوين بروتوكول هذه التحديات طرق عدة. أولاً، يتم تبسيط مسارات الإثارة وكشف إلى حد كبير بالمقارنة مع تطبيقات أخرى جعل المحاذاة بسيطة وقوية. وثانيا، الليزر تتحرك بقعة وموضع تقدير خوارزمية تقديم تقديرات موقف دقيق لدائرة التغذية الاسترجاعية، مما يجعل ردود الفعل أكثر استقرارا. ثالثا، يتيح الكشف عن فعالية كبيرة النطاق (1 × 1 × 4 ميكرومتر) من بقعة الليزر تتحرك بشكل حيوي لتتبع جسيمات تتحرك بسرعة. لمعرفة لماذا هذا المجال كشف كبير الحرجة، من المهم النظر في وقت استجابة جوهرية نانوبوسيتيونير كهرضغطية. مراحل عالية السرعة كهرضغطية الأصداء يقارب 1 كيلو هرتز، قصر زمن الاستجابة ليكون بناء على أمر من السيدة 1 في 1 مللي ثانية، 100 نانومتر نانوحبيبات مع معامل نشر 4/ق2ميكرومتر، وسيتم نشرها في المتوسط 90 نيوتن متر من مركز الحيود-لي الكشف عن ميتيد وحدة التخزين. هذا هو تشريد متوسط فقط وسوف يحمل الحركة عشوائية حقاً خطوات أكبر بكثير من ذلك، مما يؤدي إلى الجسيمات ترك حجم التنسيق وإنهاء المسار الحالي. الحالة أسوأ لجسيمات أصغر، حيث الخطوات انتشارية حرارية متزايدة تؤدي إلى فقدان التعقب. مجال الكشف عن فعالية كبيرة تسمح لنظام التتبع للتغلب على تأخر المرحلة كهرضغطية الجوهرية والتعافي من القفزات انتشارية كبيرة في موقف الجسيمات، زيادة متانة الشاملة لآلية تتبع. وأخيراً، منطقة المسح كبيرة يسمح للنظام بسهولة التقاط جزيئات جديدة، مما يتيح لمسارات متتالية الحصول على سرعة وتجميع مجموعات البيانات الكبيرة.
المستخدم يجب أن نضع في اعتبارنا أن هناك بعض الخطوات الحاسمة. أولاً، أن المحاذاة في 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة وعدسة العلامة الحاسمة. على حد سواء يجب أن تكون محاذاة جيدا للحصول على الدقة المثلى. ثانيا، يجب أن تكون المعلمات التي يتم استخدامها في تقدير الموقف في الجسيمات الثابتة مسح خطوة مدروسة جيدا (انظر الشكل 4). يجب أن تطابق موقف الجسيمات تقدر موقف الجسيمات المقابلة لمركز نطاق المسح الليزر. أخيرا، ينبغي ضبطها الثوابت لا يتجزأ ردود الفعل (كأنا) بعناية، بدءاً بقيمة صغيرة ثم التعلية حتى يلاحظ ذبذبات، ثم تراجع إلى حوالي 80 في المائة من تلك القيمة.
وهناك بعض المحاذير حول 3D-ديبلوت أن نأخذ في الاعتبار استناداً إلى التطبيق المطلوب. بينما تم تصميم تقدير الموقف الأمثل للاستخدام مع البراونية، وأيضا مناسب تماما نحو الاتجاه الحركة. يمكن تطبيق الخوارزمية مباشرة إلى أي نوع من الحركة نظراً لأنها فقط الغموض الموقف الذي يفترض أن يكون الضبابي، ليس موضع الجسيمات الحقيقية. في الحالات حيث من المتوقع استمرار الحركة الخطية، مدة إضافية يمكن أن تضاف إلى فترة التنبؤ في خوارزمية تقدير الموقف (انظر 3 المعادلة في المعلومات التكميلية).
اختيار المعلمات 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة والعلامة ينبغي النظر بعناية عند إعداد 3D-ديبلوت. أهمية خاصة هو بن الوقت المستخدم لجولة فارس تفحص بواسطة 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. في سيناريو مثالي, سوف مزامنة الجولة فارس إلى فترة للعدسة العلامة لضمان كفاءة أخذ العينات. بيد أنها حاسمة بالنسبة للنظر في وقت الاستجابة 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة الخطوة التغيرات في الجهد. للوحدة المستخدمة هنا، هناك وقت استجابة المايكروثانيه 2-3 بعد تطبيق التيار الكهربائي قبل الوصول إلى المكان المطلوب. وهذا الوقت بن المايكروثانيه 20، حوالي 10-15% الوقت جمع. تقليل الوقت ذلك مطابقاً لفترة عدسة العلامة ~ المايكروثانيه 14 يزيد الجزء من الوقت بن، وهو وقت التأخر 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. وهذا يؤدي إلى قيم غير صحيحة موقف الليزر وموقف غير صحيح التقديرات.
وثمة عامل آخر المجرب أن نأخذ في الاعتبار هو الأزمنة. بينما يتم جمع البيانات المعروضة هنا بمعدل بيانات 100 كيلو هرتز، يتم تعريف الأزمنة في نهاية المطاف في نهاية المطاف التي تستخدم البيانات لقياس الموقف. إذا استخدمت قراءات نانوبوسيتيونير كموقف الجسيمات (الشكل 6)، سيتوقف الأزمنة على قيمة ثابت لا يتجزأ من عنصر التحكم. على سبيل المثال، مرحلة الاستجابة لعنصر التحكم لا يتجزأ هو موضح في الشكل 6 أ–د، بناء على أمر من 1 مللي ثانية، بينما بالنسبة الشكل 6e–ح، أمر السيدة 10 إذا كان المطلوب أسرع من الأزمنة، ثم سيتم ربط نتيجة فوتون فوتون خوارزمية تقدير الموقف مع معدل العد فوتون. على سبيل المثال، بمعدل انبعاثات 10 كيلوهرتز غلة المايكروثانيه 100 الأزمنة ومعدل انبعاثات 100 كيلوهرتز غلة المايكروثانيه 10 الأزمنة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ يتبع الدقة <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56711/56711eq2.jpg"> 41من العلاقة، تقترن الدقة المكانية والزمانية. نتيجة لذلك يحدد سطوع التحقيق كلا من الدقة المكانية والزمانية.
في هذا البروتوكول وصفناها الإعداد والتخطيط والمحاذاة من سرعة عالية في الوقت الحقيقي 3D واحد الجسيمات تتبع الأسلوب الذي يستخدم 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة وعدسة العلامة للانتقال بشكل حيوي بقعة ليزر مركزة لتحقيق تقدير الموقف الجسيمات السريعة. ثم وصفت لنا طرق تحسين إعداد والمعلمة عينة. 3D-ديبلوت يوفر وسيلة قوية وبسيطة نسبيا لقفل على التحرك السريع وانبعاث الجسيمات انتشارية الرخيصة. تخطيط بصرية بسيطة تتيح لها بسهولة إضافة إلى الجانب المنفذ لأي موقف مجهر موجود بحيث أنها قد تكون جنبا إلى جنب مع وحدات التصوير. مع أحكام هذا البروتوكول، ونأمل أن RT-3D-SPT يمكن أن تكون أكثر على نطاق واسع تنفذه المحققون أكثر معالجة سريعة والعمليات البيولوجية الأبعاد الثلاثة.

ظهور تقنيات التصوير المتقدمة قد فتحت نافذة لمعرفة هيكل من أي وقت مضى أكثر تفصيلاً من الظواهر الخلوية، على طول الطريق وصولاً إلى المستوى الجزيئي. أساليب مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)1،2،3، تنشيط صور التعريب مجهرية (النخيل)4،،من56،7 ومنظم الإضاءة مجهرية (SIM)8،،من910،11، وحفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED)12،13، 14 قد تجاوزت الآن الحد حيود لتقديم التفاصيل لم يسبق لها مثيل في هيكل ووظيفة الخلايا الحية. ومع ذلك، كامل فهم كيف أن هذه النظم تتصرف يتطلب المعلومات الحيوية، فضلا عن المعلومات الهيكلية. القرار فائقة الأساليب المذكورة أعلاه تشمل مفاضلة بين القرار المكانية والأزمنة، يحد من الدقة الزمنية التي يمكن بحث العمليات الحيوية. أسلوب الذي يوفر عالية الدقة المكانية والزمانية القرار هو RT-3D-SPT15،،من1617،،من1819،20، 21،23،22،،من2426،25،27،،من2829. هنا، يمكننا التمييز بين SPT 3D التقليدية30 و RT-3D-SPT. التقليدية يتطلب 3D SPT ببساطة سلسلة زمنية من بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد (والتي يمكن الحصول عليها أما باستخدام مجهر [كنفوكل] أو مجهر ابيفلوريسسينسي ونظرا للتكوين الصحيح). في 3D التقليدية-SPT، تتحدد إحداثيات الجسيمات بعد جمع البيانات بتحديد الجسيمات في كل مكدس الصورة وسلسلة المواقع الموجودة في وحدات التخزين المتعاقبة لإنشاء مسار. لهذه الأساليب، يتحدد القرار الزمانية في نهاية المطاف بمعدل التصوير الحجمي. لمجاهر [كنفوكل]، وهذا بسهولة بمقياس ثانية لعشرات ثواني. لأساليب ابيفلوريسسينسي، حيث يتم معالجته المسار البصري حيث أنه يمكن استخراج معلومات الموقع المحوري، يقتصر القرار الزماني وقت التعرض أو قراءات الكاميرا. تقتصر هذه الأساليب ابيفلوريسسينت في النطاق الذي يمكن جمع المعلومات المحوري، وعلى الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في مرحلة الطائرة فورييه أقنعة التصميم والبصريات التكيفية وتوسع هذه النطاقات إلى 10 ميكرون أو أكثر31،32 , 33 , 34.
وفي المقابل، RT-3D-SPT لا تعتمد على الحصول عليها كومة صور الثلاثية الأبعاد والجسيمات بعد وقوعها. بدلاً من ذلك، يتم استخراج معلومات الموقع في الوقت الحقيقي عن طريق الكشف عن نقطة واحدة وردود الفعل يطبق على فعالية "قفل" الجسيمات في تنسيق حجم العدسة الهدف عن طريق استخدام مرحلة كهرضغطية العالية السرعة. يسمح هذا القياس المستمر للموقف الجسيمات محدودة فقط التي يمكن جمعها كم عدد الفوتونات. وعلاوة على ذلك، تتيح هذه الطريقة الاستجواب الطيفية للجسيمات وهي تنتقل عبر مسافات بعيدة. RT-3D-SPT سارية المفعول قوي يعمل أقرب إلى فخ خالية من القوة ضوئية لكائنات النانو، حيث الجسيمات باستمرار سبر ويقاس في الوقت الحقيقي دون الحاجة إلى صلاحيات كبيرة الليزر أو البصرية. نظراً لأن RT-3D-SPT يوفر وسيلة للاستجواب مستمر من كائنات سريعة انتشارية (تصل إلى 20 ميكرون2/ق)25،29 في الأبعاد الثلاثة في فوتون المنخفضة عد أسعار20،29، 35، ينبغي أن يوفر نافذة في العمليات البيولوجية سريعة أو عابرة مثل نقل البضائع داخل الخلايا ويجند مستقبلات ملزم وديناميات فيريونس واحد خارج الخلية. ومع ذلك، إلى هذه النقطة، تطبيق RT-3D-SPT اقتصر على حفنة الجماعات التي تعمل على النهوض بهذه التكنولوجيا.
جدار واحد من تعقيد التخطيط البصرية المطلوبة بأساليب RT-3D-SPT، التي تتنوع. لمعظم طرق التغذية المرتدة البصرية يتم توفيرها من قبل مرحلة كهرضغطية. كالجسيمات يجعل الحركات الصغيرة في X، Y، أو Z، قراءات من نقطة واحدة للكشف عن تحويلها إلى وظائف خطأ وتغذية في عالي السرعة إلى نانوبوسيتيونير كهرضغطية، الذي بدوره ينتقل العينة للتصدي للحركة للجسيمات، وفعالية قفل عليه في مكان بالنسبة للعدسة الهدف. لقياس الحركات الموضعية الصغيرة في X، Y، و Z، أما متعددة (4 أو 5 اعتماداً على التنفيذ) للكشف عن15،،من1821 أو متعددة الإثارة البقع (2-4، الأقل من التي يمكن تطبيقها إذا يتم استخدام قفل في مكبر للصوت لاستخراج X وموقف Y باستخدام التناوب ليزر بقعة) تطبق25،28 . التداخل بين هذه البقع الكشف والانبعاث متعددة تجعل النظم صعوبة في محاذاة والحفاظ على.
هنا، نحن نقدم أسلوب عالي السرعة المستهدفة غير الساحلية و 3D-SPT مع تصميم بصرية مبسط يسمى 3D-ديبلوت29. يستخدم 3D-ديبلوت 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة وعلامة عدسة36،،من3738 للتحرك بشكل حيوي بقعة ليزر مركزة من خلال حجم التنسيق الموضوعي بمعدل مرتفع (50 كيلوهرتز XY، 70 كيلو هرتز Z). الجمع بين موضع تركيز الليزر ووقت وصول فوتون تمكن موقف 3D للجسيمات سرعة الحصول عليها حتى في معدلات العد فوتون منخفضة. 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة محركات تركيز الليزر في فارس جولة نمط39 مع حجم مربع من 1 x 1 ميكرومتر في الطائرة X-Y وعدسة العلامة ينتقل تركيز الليزر في اتجاه محوري مع مجموعة من 2-4 ميكرون. يتم الحصول على موقف 3D الجسيمات مع موضع أمثل تقدير خوارزمية29،40 في 3D. وتجري السيطرة 3D تتحرك بشكل حيوي ليزر بقعة، فوتون عد من الانهيار الضوئي (APD) وحساب موضع الجسيمات في الوقت الحقيقي، والمرحلة كهرضغطية التغذية المرتدة، وتسجيل البيانات في صفيف حقل بوابة القابلة لبرمجة (FPGA).في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية بناء مجهر 3D-ديبلوت خطوة بخطوة، بما في ذلك محاذاة البصري، المعايرة مع جزيئات ثابتة، وأخيراً مجانية تتبع الجسيمات. كدليل، تم تعقبها الخرز الفلورسنت 110 في شمال البحر الأبيض المتوسط بشكل مستمر في الماء لمدة دقيقة في كل مرة.
الأسلوب الموصوفة هنا اختيار مثالي لأي تطبيق حيث أنه المطلوب لترصد باستمرار تحقيق فلورسنت تتحرك بسرعة في ضوء المستويات المنخفضة، بما في ذلك الفيروسات والجسيمات النانوية وحويصلات مثل اندوسوميس. وعلى النقيض من الأساليب السابقة، هناك فقط الإثارة واحد ومسار كشف واحد، جعل المحاذاة والصيانة مباشرة. وعلاوة على ذلك، يتيح مجال كبير في الكشف عن هذا المجهر لالتقاط بسهولة بسرعة نزع فتيل الجسيمات، بينما القدرة على تتبع المستويات إشارة منخفضة (وصولاً إلى 10 كيلوهرتز) يجعل هذا الأسلوب المثالي لتطبيقات الإضاءة المنخفضة29.

<table><tbody><tr><td>2D Electro-optic Deflector&amp;nbsp;</td><td>ConOptics</td><td>M310A</td><td>2 required</td></tr><tr><td>Power supply for EOD</td><td>ConOptics</td><td>412</td><td>Converts FPGA ouput to high voltage for EOD</td></tr><tr><td>TAG&amp;nbsp; Lens</td><td>TAG Optics</td><td>TAG 2.0</td><td>Used to deflect laser along axial direction</td></tr><tr><td>XY piezoelectric nanopositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-PDQ275HS</td><td>Used for moving the sample to lock the particle in the objective focal volume in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Z piezoelectric nanoposiitoner</td><td>MadCity Labs</td><td>Nano-OP65HS</td><td>Used to move the objective lens to follow the diffusing particle</td></tr><tr><td>Micropositioner</td><td>MadCity Labs</td><td>MicroDrive</td><td>Used to coarsely position sample and evaluate</td></tr><tr><td>Objective Lens</td><td>Zeiss</td><td>PlanApo</td><td>High numerical aperture required for best sensitivity. 100X, 1.49 NA, M27, Zeiss</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>PCO</td><td>pco.edge 4.2</td><td>Used to monitor the particle&#039;s position</td></tr><tr><td>APD</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-ARQH-15</td><td>Lower dark counts beneficial</td></tr><tr><td>Field programmable gate array</td><td>National Instruments</td><td>NI-7852r</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Tracking excitation laser</td><td>JDSU</td><td>FCD488-30</td><td></td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L1</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L2</td></tr><tr><td>Pinhole</td><td>ThorLabs</td><td>P75S</td><td>PH</td></tr><tr><td>Glan-Thompson Polarizer</td><td>ThorLabs</td><td>GTH5-A</td><td>GT</td></tr><tr><td>Half-wave plate</td><td>ThorLabs</td><td>WPH05M-488</td><td>WP</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-75-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-250-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L5</td></tr><tr><td>Lens</td><td>ThorLabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>L6</td></tr><tr><td>Dichroic Mirror</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>DC</td></tr><tr><td>Fluorescence Emission Filter</td><td>Chroma</td><td>D535/40m</td><td>F</td></tr><tr><td>10/90 beamsplitter</td><td>Chroma</td><td>21012</td><td>BS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>190 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/9942</td><td></td></tr><tr><td>110 nm fluorescent nanoparticles</td><td>Bangs laboratories</td><td>FC02F/10617</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545A</td><td></td></tr><tr><td>Powermeter</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>CMOS</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1545M</td><td></td></tr><tr><td>Iris</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Mad City Labs</td><td>RM21</td><td></td></tr></tbody></table>

a protocol for real-time 3d single particle tracking

جسيم واحد ثلاثي الأبعاد في الوقت الحقيقي تتبع (RT-3D-SPT) لديه القدرة على إلقاء الضوء على عمليات سريعة، 3D في أنظمة الهاتف الخلوي. على الرغم من أن أساليب RT-3D-SPT مختلفة قدمت في السنوات الأخيرة، تتبع عالية السرعة 3D نزع فتيل الجسيمات في معدلات العد فوتون منخفضة لا يزال يمثل تحديا. وعلاوة على ذلك، الرايت-3D-SPT الأجهزة عادة ما تكون معقدة وصعبة التنفيذ، تحد من تطبيقها على نطاق واسع للمشاكل البيولوجية. ويعرض هذا البروتوكول نظام RT-3D-SPT المسمى 3D "دينامية فوتون التعريب تتبع" (3D-ديبلوت)، التي يمكن أن تتبع الجسيمات بسرعة انتشارية عالية (تصل إلى 20 ميكرون/ق2) أسعار العد فوتون منخفضة (وصولاً إلى 10 كيلوهرتز). يستخدم 3D-ديبلوت منحرف الكهرضوئية ثنائية الأبعاد (2D--التخلص من الذخائر المتفجرة) وعدسة الانضباطي تدرج صوتي (علامة) إلى محرك أقراص واحد وركزت الليزر المستطيل بشكل حيوي في 3D. 3D-ديبلوت جنبا إلى جنب مع خوارزمية تقدير موقف أمثل، يمكن أن تلتحم جزيئات مفردة مع تعقب عالية السرعة والدقة العالية ومسلم. نظراً للإثارة واحدة وتخطيط مسار كشف واحد، 3D-ديبلوت قوية وسهلة لإقامة. ويناقش هذا البروتوكول كيفية بناء 3D-ديبلوت خطوة بخطوة. أولاً، يتم وصف تخطيط البصرية. المقبل، هو النظام معايرة والأمثل من قبل النقطية المسح حبة فلورسنت 190 نيوتن متر مع نانوبوسيتيونير كهرضغطية. أخيرا، وللتدليل على تتبع قدرة 3D في الوقت الحقيقي، يتم تعقب الخرز الفلورسنت 110 في شمال البحر الأبيض المتوسط في المياه.

الجسيمات الثابتة المسح الضوئي (الشكل 4) ونشرها بحرية 110 نانومتر الفلورسنت الجسيمات تتبع (الشكل 5) أجريت في أعقاب البروتوكول أعلاه. وأجرى المسح الجسيمات بتحريك الفوتونات نانوبوسيتيونير وبن كهرضغطية بينما في نفس الوقت حساب الجسيمات يقدر الموقف عند كل نقطة في المسح الضوئي. مسح الصورة يظهر مربع من كثافة حتى (الشكل 4a) والمواقف المقدرة التي تظهر علاقة خطية مع الموقف الحقيقي للجسيمات أكثر من 1 × 1 × 2 ميكرومتر مجموعة في x، y، و z الاتجاه (الشكل 4 باء–و).
إظهار تتبع في الوقت الحقيقي، تتبعها 3D-ديبلوت (الشكل 5 أ، ب) 110 الجسيمات الفلورية شمال البحر الأبيض المتوسط في المياه. ويبين التحليل التشرد (MSD) متوسط مربع سلوك خطي نموذجية مميزة من البراونية (الشكل 5 ج). أظهر تحليل MSD لمسارات 30 قطره هيدرودينامية يعني 110 شمال البحر الأبيض المتوسط، في اتفاق جيد مع مواصفات الشركات المصنعة للحجم جسيمات نانوية الفلورسنت يجري تعقب (الشكل 5 د). وباﻹضافة إلى ذلك، 1 فيلم يبين قراءات نانوبوسيتيونير كهرضغطية في الوقت الحقيقي ومزامنة الصور سكموس لمسار طويل 2 دقيقة من الجسيمات الفلورية نانومتر 110 نشرها بحرية.
بالإضافة إلى كونه قادراً على تتبع مع سرعة عالية، يمكن أن تكون مترجمة جسيمات تتحرك بطيئة بدقة عالية. الشكل 6a - د يظهر تطبيق نظام 3D-ديبلوت للجسيمات الثابتة استخدام نفس المعلمات الملاحظات المستخدمة للسرعة العالية تتبع، والتي تبين بدقة من 17.6 و 26.4 53.4 نانومتر في X، Y، و Z، بمعدل العد فوتون من 10 على التوالي5. 6e الشكل - ح يبين الدقة تحت مراقبة ردود الفعل انخفض بنسبة 10، فعالية مبادلة السرعة للدقة ونستعرض بدقة 6.5 و 8.3 و 10.5 نيوتن متر في X، Y و Z، على التوالي.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig1.jpg"> 
رقم 1. التخطيطي لتتبع نظام 3D- 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة (EOD1 &#38; EOD2) وعدسة الوسم (العلامة) يصرف الليزر على طول التوجيهات XY و Z، على التوالي. APD (APD) يستخدم لتجميع الفوتونات الفلورية، التي يتم إرسالها إلى FPGA (FPGA). FPGA يستخدم خوارزمية حساب الموقف، عد فوتون، التحكم 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة، فضلا عن مراقبة وقراءات من نانوبوسيتيونير كهرضغطية (نسكسي و NZz). المكونات الأخرى المسماة في الشكل: مرايا (م)؛ عدسات (L #)؛ الثقب (PH)؛ المستقطب Glan-تومسون (GP)؛ لوحة نصف الموجه (W1)؛ فلتر مزدوج اللون (DC)؛ عدسة الهدف (را، نا X 100 = 1.49)؛ الأسفار الانبعاثات تصفية (F)؛ شعاع الخائن (درجة البكالوريوس)؛ س وص ميكروبوسيتيونير المرحلة (مسكسي)؛ Z مرحلة ميكروبوسيتيونير (MSz). <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig2.jpg"> 
رقم 2. وتنسق للجولة فارس في 3D--ديبلوت- ينبغي مواءمة والمحور 1 2 على طول المحور X أو Y بالمحاذاة الصحيحة من 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig3.jpg"> 
الشكل 3. إعدادات البرامج عدسة الوسم. راجع المقطع 4.2 علامة إعدادات العدسة للحصول على مزيد من المعلومات. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig4.jpg"> 
الشكل 4. تقدير المسح الضوئي وموقف الجسيمات. () مسح الصورة من 190 نانومتر الفلورسنت الخرز مع 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة القيادة الليزر في 1 × 1 ميكرومتر ساحة نقش جولة فارس. يتم الرمز إلى كثافة الأسفار حسب اللون. الوحدة: كيلو هرتز. (ب) تقدير سك، موقف للجسيمات بالنسبة للمركز 2D--التخلص من الذخائر المتفجرة المسح الضوئي في ميكرومتر. اللون في ب وج ود يدل على الموضع المقدر. الوحدة:-ميكرومتر (ج) تقدير صك في ميكرومتر. (د) تقدير ضك، الجسيمات موقف بالنسبة لمركز محوري للعدسة العلامة المسح الضوئي في ميكرومتر. موقف (ﻫ) المقدرة الجسيمات موقف صك كدالة للمرحلة المتوسط عبر شبكة كاملة من (ج). علما أن موقف الجسيمات المقدرة المكتسبة من خوارزمية تقدير الموقف (صك) تتفق مع الموقف الحقيقي. موقف (f) المقدرة الجسيمات موقف zk كدالة للمرحلة المتوسط عبر شبكة كاملة من (د). الموضع المقدر يبين وجود علاقة خطية مع الموقف الحقيقي للجسيمات مدى 1 × 1 × 2 ميكرومتر في اتجاه X و Y و Z. علما أن موقف الجسيمات المقدرة المكتسبة من خوارزمية تقدير الموقف (zk) تتفق مع الموقف الحقيقي. الموضع المقدر يبين وجود علاقة خطية مع الموقف الحقيقي للجسيمات أكثر من 1 × 1 × 2 ميكرومتر مجموعة في X، Y، و Z الاتجاه. مقياس اللون الأبيض أشرطة في (–ج) تمثل 500 نانومتر وشريط أسود مقياس (د) يمثل 2 ميكرومتر. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig5.jpg"> 
الشكل 5.تتبع 110 الجسيمات الفلورية شمال البحر الأبيض المتوسط في المياه مع 3D-ديبلوت. () مسار 3D نشرها بحرية 110 نانومتر الفلورسنت نانوحبيبات في المياه. (ب) شدة الفلورسنت كدالة للزمن للمسار في (). (ج) MSD للمسار في (). الخط الأزرق هو MSD يقاس بينما الخط الأحمر المنقط أفضل خط من الانحدار الخطي. (د) MSD تحليل مسارات 30، عرض متوسط قطرها هيدرودينامية 110 شمال البحر الأبيض المتوسط، في اتفاق جيد مع الحجم جسيمات نانوية الفلورسنت التي يتم تعقبها. حسبت قطر الجسيمات باستخدام علاقة ستوكس-اينشتاين. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56711/56711fig6.jpg"> 
الشكل 6. الدقة من الجسيمات الثابتة تتبع- يتم تعقب الجسيمات الثابتة () A بواسطة 3D-ديبلوت بمعدلات مختلفة العد. الدقة هو nm (ب) 17.6 في العاشر، نانومتر (ج) 26.4 في Y ونانومتر (د) 53.4 في ض بمعدل انبعاثات من 100 كيلو هرتز. ويمكن تخفيض ثابت (ه) عند التدقيق أبطأ العمليات، مراقبة التغذية المرتدة (كأنا) بمقدار 10 زيادة الدقة. تحت مراقبة انخفاض ردود الفعل هذه، هو الدقة nm (و) 6.5 في العاشر، nm (ز) 8.3 في Y و nm (ح) 10.5 في ض بمعدل انبعاثات من 100 كيلو هرتز. <a href="//ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/56711fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
الشكل S1. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_S1_position_estimation-01.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الشكل S2. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_s2_TAG_operation.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
الشكل S3. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/fig_s3_software.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>
معلومات تكميلية. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56711/170802_software_description.pdf">اضغط هنا لتحميل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking at JoVE.com

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

تفاصيل البروتوكول هذا ببناء وتشغيل المجهر تتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات واحدة قادرة على تعقب النانو الفلورسنت يسبر سرعة انتشارية عالية ومعدلات العد فوتون منخفضة.

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

a-protocol-for-real-time-3d-single-particle-tracking

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K Views.  Duke University. تفاصيل البروتوكول هذا ببناء وتشغيل المجهر تتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات واحدة قادرة على تعقب النانو الفلورسنت يسبر سرعة انتشارية عالية ومعدلات العد فوتون منخفضة.

Video: A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Image-based Lagrangian Particle Tracking in Bed-load Experiments

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a relatively low cost. This manuscript describes an application of particle tracking velocimetry (PTV) to a bed-load experiment with lightweight sediment. The key characteristics of the investigated sediment transport conditions were the presence of a covered flow and of a fixed rough bed above which particles were released in limited number at the flume inlet. Under the applied flow conditions, the motion of the individual bed-load particles was intermittent, with alternating movement and stillness terms. The flow pattern was preliminarily characterized by acoustic measurements of vertical profiles of the stream-wise velocity. During process visualization, a large field of view was obtained using two action-cameras placed at different locations along the flume. The experimental protocol is described in terms of channel calibration, experiment realization, image pre-processing, automatic particle tracking, and post-processing of particle track data from the two cameras. The presented proof-of-concept results include probability distributions of the particle hop length and duration. The achievements of this work are compared to those of existing literature to demonstrate the validity of the protocol.

The manuscript presents a protocol for the conduction of bed-load sediment transport experiments where the moving particles are tracked by image analysis. The experimental facility, the procedures for run realization and data processing, and finally some proof-of-concept results are presented here.

تتبع الجسيمات لاغرانجي القائم على الصورة في التجارب السرير تحميل

Image analysis has been increasingly used for the measurement of river flows due to its capabilities to furnish detailed quantitative depictions at a ...

Environment

Three-dimensional Particle Tracking Velocimetry for Turbulence Applications: Case of a Jet Flow

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic recording of image sequences. The basic components, features, constraints and optimization tips of a 3D-PTV topology consisting of a high-speed camera with a four-view splitter are described and discussed in this article. The technique is applied to the intermediate flow field (5 &#60;x/d &#60;25) of a circular jet at Re &#8776; 7,000. Lagrangian flow features and turbulence quantities in an Eulerian frame are estimated around ten diameters downstream of the jet origin and at various radial distances from the jet core. Lagrangian properties include trajectory, velocity and acceleration of selected particles as well as curvature of the flow path, which are obtained from the Frenet-Serret equation. Estimation of the 3D velocity and turbulence fields around the jet core axis at a cross-plane located at ten diameters downstream of the jet is compared with literature, and the power spectrum of the large-scale streamwise velocity motions is obtained at various radial distances from the jet core.

A three-dimensional particle tracking velocimetry (3D-PTV) system based on a high-speed camera with a four-view splitter is described here. The technique is applied to a jet flow from a circular pipe in the vicinity of ten diameters downstream at Reynolds number Re &#8776; 7,000.

ثلاثي الأبعاد السرعة بواسطة الجسيمات تتبع للتطبيقات الاضطراب: حالة من تدفق جت

3D-PTV is a quantitative flow measurement technique that aims to track the Lagrangian paths of a set of particles in three dimensions using stereoscopic ...

Engineering

Preparation and 3D Tracking of Catalytic Swimming Devices

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence microscopy. One commonly deployed method for catalytically active colloids to produce enhanced motion is via an asymmetrical distribution of catalyst. Here this is achieved by spin coating a dispersed layer of fluorescent polymeric colloids onto a flat planar substrate, and then using directional platinum vapor deposition to half coat the exposed colloid surface, making a two faced "Janus" structure. The Janus colloids are then re-suspended from the planar substrate into an aqueous solution containing hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide serves as a fuel for the platinum catalyst, which is decomposed into water and oxygen, but only on one side of the colloid. The asymmetry results in gradients that produce enhanced motion, or "swimming". A fluorescence microscope, together with a video camera is used to record the motion of individual colloids. The center of the fluorescent emission is found using image analysis to provide an x and y coordinate for each frame of the video. While keeping the microscope focal position fixed, the fluorescence emission from the colloid produces a characteristic concentric ring pattern which is subject to image analysis to determine the particles relative z position. In this way 3D trajectories for the swimming colloid are obtained, allowing swimming velocity to be accurately measured, and physical phenomena such as gravitaxis, which may bias the colloids motion to be detected.

A method to prepare catalytically active Janus colloids that can "swim" in fluids and determine their 3D trajectories is presented.

تتبع إعداد و3D من التحفيز أجهزة سباحة

We report a method to prepare catalytically active Janus colloids that "swim" in fluids and describe how to determine their 3D motion using fluorescence ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and millisecond temporal resolution. These capabilities make single-molecule localization microscopy ideally suited to study molecular level biological functions in physiologically relevant environments. Here, we demonstrate an integrated protocol for both acquisition and processing/analysis of single-molecule tracking data to extract the different diffusive states a protein of interest may exhibit. This information can be used to quantify molecular complex formation in living cells. We provide a detailed description of a camera-based 3D single-molecule localization experiment, as well as the subsequent data processing steps that yield the trajectories of individual molecules. These trajectories are then analyzed using a numerical analysis framework to extract the prevalent diffusive states of the fluorescently labeled molecules and the relative abundance of these states. The analysis framework is based on stochastic simulations of intracellular Brownian diffusion trajectories that are spatially confined by an arbitrary cell geometry. Based on the simulated trajectories, raw single-molecule images are generated and analyzed in the same way as experimental images. In this way, experimental precision and accuracy limitations, which are difficult to calibrate experimentally, are explicitly incorporated into the analysis workflow. The diffusion coefficient and relative population fractions of the prevalent diffusive states are determined by fitting the distributions of experimental values using linear combinations of simulated distributions. We demonstrate the utility of our protocol by resolving the diffusive states of a protein that exhibits different diffusive states upon forming homo- and hetero-oligomeric complexes in the cytosol of a bacterial pathogen.

3D single-molecule localization microscopy is utilized to probe the spatial positions and motion trajectories of fluorescently labeled proteins in living bacterial cells. The experimental and data analysis protocol described herein determines the prevalent diffusive behaviors of cytosolic proteins based on pooled single-molecule trajectories.

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Biochemistry

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

التحكم في سرعات تدفق السوائل النشطة ثلاثية الابعاد المستندة إلى Microtubule باستخدام درجه الحرارة

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

تتبع الجسيمات الحساسة للكتلة لتوصيف ديناميكيات الجزيئات الكبيرة المرتبطة بالغشاء

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

Neuroscience

Protocol for Analysis and Consolidation of TrackMate Outputs for Measuring Two-Dimensional Cell Motility using Nuclear Tracking

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To understand the regulation of cell motility, we must be able to measure it easily and consistently under different conditions. Here we describe a method for measuring and quantifying single-cell and bulk motility of HaCaT keratinocytes using a nuclear stain. This method includes a MATLAB script for analyzing TrackMate output files to calculate displacements, motility rates, and trajectory angles in single cells and in bulk for an imaging site. This motility analysis script allows for quick, straightforward, and scalable analysis of cell motility rates from TrackMate data and could be broadly used to identify and study the regulation of motility in epithelial cells. We also provide a MATLAB script for reorganizing microscopy videos collected on a microscope and converting them to TIF stacks, which can be analyzed using the ImageJ TrackMate plugin in bulk. Using this methodology to explore the roles of adherens junctions and actin cytoskeletal dynamics in regulating cell motility in HaCaT keratinocytes, we demonstrate evidence that Arp2/3 activity is required for the elevated motility seen after &#945;-catenin depletion in HaCaT keratinocytes.

This protocol for high-throughput measurement of cell motility in HaCaT keratinocytes describes methods for collecting and processing images of cell nuclei and performing particle tracking using the ImageJ plugin TrackMate.

Collective cellular migration plays a key role in many fundamental biological processes including development, wound healing, and cancer metastasis. To ...