Administração orofaríngea de bleomicina no modelo murino de fibrose pulmonar

Este protocolo demonstra a técnica de aspiração orofaríngea para uso no modelo murino de bleomicina de fibrose pulmonar.

A doença pulmonar intersticial (DPI) representa um amplo espectro de distúrbios caracterizados pela cicatrização progressiva e muitas vezes irreversível do parênquima pulmonar, sendo a mais comum a fibrose pulmonar idiopática (FPI). Vários modelos animais de FPI têm sido desenvolvidos, sendo o modelo murino de bleomicina o mais utilizado. A bleomicina é um quimioterápico conhecido por induzir danos ao DNA no epitélio alveolar, resultando em lesão pulmonar aguda e fibrose pulmonar em humanos. Modelos de FPI em roedores usam a administração de bleomicina por vários métodos, sendo o mais comum o intratraqueal (TI). Recentemente, a técnica de aspiração orofaríngea (OA) demonstrou ser tão eficaz quanto a IT para múltiplos agentes fibrosantes, com consideravelmente menos efeitos colaterais e uma via de entrega mais fácil. Este protocolo detalha o método OA de entrega de bleomicina no pulmão murino e destaca exemplos de possíveis aplicações a jusante para quantificação de dados. Essa metodologia oferece uma maneira simples, rápida e segura de utilizar esse modelo animal amplamente utilizado para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à FPI.

A doença pulmonar intersticial (DPI) refere-se a um grupo heterogêneo de distúrbios caracterizados por cicatrização progressiva e irreversível do espaço alvéolo, interstício e vias aéreas distais¹. A fibrose pulmonar idiopática (FPI) é a forma mais comum de DPI e tem uma sobrevida mediana de aproximadamente três anos². A FPI é uma condição terminal, sendo o transplante pulmonar ortotópico uma terapia de resgate para pacientes selecionados. Atualmente, existem duas terapias aprovadas pela FDA para FPI, ambas apenas diminuem a taxa de progressão em vez de estabilizar ou melhorar a função pulmonar dos pacientes ^3,4. Esforços significativos de pesquisa estão em andamento para elucidar os fundamentos da FPI e identificar novos alvos terapêuticos. Existem inúmeros modelos animais para estudar a patogênese da FPI, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens⁵. Embora nenhum modelo seja capaz de recapitular completamente a complexidade da doença humana, essas abordagens oferecem uma visão significativa dos mecanismos moleculares da FPI e podem complementar os estudos translacionais.

O modelo murino de bleomicina continua sendo o modelo in vivo mais amplamente utilizado e bem caracterizado da FPI⁶. A bleomicina é um agente peptídico que induz quebras de DNA de fita simples e dupla. Após sua descoberta em 1962, a bleomicina mostrou-se eficaz no tratamento de vários tipos de câncer, incluindo tumores testiculares e linfoma, no entanto, seu uso foi limitado pela pneumonite dose-dependente e pela fibrose pulmonar resultante ^7,8. Essa toxicidade pulmonar é recapitulada em camundongos. Quando administrada em dose única, após uma fase inflamatória inicial, a fibrose pode ser observada a partir do dia 5, com pico nos dias 14-21 9,10,11 (Figura 1). A resolução espontânea ocorre após cerca de 6 semanas, embora alterações fibróticas permanentes possam ser alcançadas com doses repetitivas¹². Dada a natureza transitória e inflamatória, existem algumas desvantagens inerentes ao modelo de bleomicina¹³, no entanto, ele oferece um sistema rápido, robusto e reprodutível para começar a responder a algumas das principais lacunas na compreensão da DPI em nosso campo e permite que os investigadores comparem os resultados nas últimas cinco décadas. Outras abordagens de instalação incluem os modelos de asbestose e sílica murina, que oferecem cursos de tempo semelhantes (dias 14-28)6,14,15,16. No entanto, esses modelos geram um padrão histológico mais consistente com pneumoconiose do que FPI e requerem o uso de partículas transportadas pelo ar, necessitando de manuseio cuidadoso. Alternativamente, existem modelos animais que utilizam a expressão de transgenes impulsionados por epitelial, como toxina diftérica e TGF-β1. Estes recapitulam a lesão de células epiteliais alveolares tipo 2 não inflamatórias observada na FPI, mas demoram um pouco mais (21-30d) e requerem o uso de animais especializados que devem ser retrocruzados em quaisquer modelos transgênicos existentes de interesse. Por fim, a superexpressão de citocinas mediada por adenovírus, incluindo TGF-β1, IL-β1 e TNF-α, demonstrou induzir fibrose pulmonar em roedores, geralmente no dia 14 17,18,19. Esses modelos de superexpressão de citocinas permitem uma administração intranasal conveniente, embora exijam purificação e manuseio cuidadosos.

Existem múltiplas abordagens para a administração de bleomicina, incluindo vias intratraqueal (IT), intranasal, intraperitoneal, subcutânea e intravenosa⁶. A administração de TI é o método mais comum, tradicionalmente envolvendo intubação endotraqueal ou traqueostomia cirúrgica²⁰, ambas as quais requerem sedação profunda, sutileza técnica e estão associadas à morbidade e mortalidade perioperatórias. Recentemente, a técnica de aspiração orofaríngea (OA) tem se mostrado tão eficaz quanto a TI, com consideravelmente menos efeitos colaterais e uma via de parto mais fácil 14,21,22,23,24,25,26. Aqui, apresentamos um protocolo visual detalhado para o método OA de entrega de bleomicina no pulmão murino e destacamos várias aplicações potenciais a jusante para quantificação de dados.

Os estudos em animais descritos nesses experimentos foram conduzidos sob protocolos (ARC-2021-025, ARC-2010-039) aprovados pelo Comitê de Pesquisa Animal da UCLA (ARC) e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC). A conformidade total com todos os regulamentos e políticas estaduais e federais relativos ao uso de animais de laboratório foi mantida. Os animais foram alojados no Centro de Cuidados com Animais da UCLA e cuidados pela equipe qualificada da Divisão de Laboratório e Medicina Animal da UCLA (DLAM) em condições livres de patógenos. Camundongos C57BL/6 do tipo selvagem foram obtidos comercialmente e aclimatados por pelo menos 14 dias. Camundongos machos com idades entre 8 e 12 semanas foram usados para esses estudos, com peso corporal médio de 20 a 25 g. Camundongos fêmeas também podem ser usados, embora seja importante para animais de correspondência de sexo e idade em grupos e condições experimentais²⁷. Os detalhes comerciais dos animais, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Administração orofaríngea de bleomicina

1. Preparação de bleomicina
   NOTA: Use bleomicina de grau farmacêutico para garantir consistência e reprodutibilidade entre animais e experimentos. Dose a bleomicina em unidades de medicamento por kg de animal (U / kg), não miligramas (mg) por kg.
   1. Dissolva a bleomicina em pó em PBS estéril de grau farmacêutico até uma concentração de estoque de 10 U / mL. A bleomicina deve ser preparada sob um capuz químico usando as devidas precauções quimioterápicas. Conservar as alíquotas a -20 °C durante um período máximo de 6 meses.
   2. Preparar a concentração final de trabalho. A dose é baseada no peso (0,5-3 U/kg) e os ajustes são feitos conforme necessário, dependendo da bleomicina usada e do objetivo do experimento (por exemplo, sobrevivência ou dosagem letal).
   3. Ajuste o volume final de administração conforme necessário. Para esses estudos, dilua a bleomicina a 0,375 U / mL, o que equivale a 50 μL para um camundongo de 25 g, resultando em uma concentração final de trabalho de 0,75 U / kg.

2. Indução da anestesia

1. Prepare o coquetel de anestesia diluindo cetamina e xilazina em PBS para concentrações de trabalho de 10 mg / mL e 1 mg / mL, respectivamente. Execute esta etapa em condições estéreis usando reagentes de grau farmacêutico e de acordo com protocolos aprovados institucionalmente.
2. Administrar 10 μL do coquetel por grama de peso corporal do animal (concentração de trabalho: cetamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg) por injeção intraperitoneal usando uma agulha de 27,5 G e uma seringa de 1 mL.
   1. Certifique-se de que o mouse esteja devidamente anestesiado e não responda a estímulos nocivos, como beliscar o dedo do pé. Os efeitos devem ser observados dentro de 5 min. Se ainda estiver responsivo, administre cetamina/xilazina adicionais em incrementos de 20 μL até que o nível desejado de anestesia seja alcançado. Aplique pomada oftálmica para evitar o ressecamento dos olhos durante a anestesia.
      NOTA: A cetamina é preferida a outros anestésicos e sedativos injetados devido ao seu perfil de efeitos colaterais favorável. Tem efeitos mínimos na hemodinâmica, incluindo frequência cardíaca e respiratória. O isoflurano inalado pode ser usado como agente anestésico alternativo. Nesses estudos, a cetamina/xilazina é preferida porque resulta em sedação prolongada e tosse mínima ou refluxo de bleomicina após a administração.

3. Administração orofaríngea

1. Uma vez devidamente sedado, suspenda o mouse na plataforma processual em um ângulo de 60 ° a 80 °, pendurando-o pelos incisivos frontais para abrir efetivamente a orofaringe ( Figura 2A ).
2. Oclua a passagem nasal com uma pinça microvascular lisa, forçando o camundongo a respirar pela orofaringe.
3. Retraia a língua para fora da orofaringe usando uma pinça.
4. Usando uma pipeta de passo com uma ponta de ponta de leur, coloque suavemente o volume desejado de bleomicina, ou controle salino, na parte de trás da orofaringe. Certifique-se de que uma bolha de líquido esteja grosseiramente visível (Figura 2B).
5. Continue segurando a língua no lugar até que o animal aspire a solução. Isso deve ser visível e muitas vezes audivelmente aparente.
   NOTA: Se o animal aspirar rapidamente a solução, a visualização na parte posterior da orofaringe pode ser transitória, em poucos segundos. Independentemente disso, se for bem-sucedido, o animal demonstrará uma mudança abrupta e transitória em seu padrão respiratório, respirando rapidamente e superficialmente. Pode ocorrer borbulhamento do fluido, indicando ainda que o fluido entrou com sucesso no trato respiratório inferior. Tosse ocasional também pode ocorrer. Este é geralmente um volume insignificante da solução de bleomicina e não deve afetar os resultados experimentais, permitindo que o animal permaneça incluído no estudo. Evite a dosagem repetitiva, pois aumenta o risco de asfixia e altera a dosagem final com base no peso.
6. Após a confirmação da aspiração, remova cuidadosamente o clipe nasal.
7. Observe o animal na posição de suspensão por 15-30 s para garantir que não haja refluxo da solução de bleomicina e, em seguida, devolva-o à gaiola.
   NOTA: Recomenda-se um volume máximo de 50 μL para minimizar o risco de asfixia. Dependendo da dose desejada de bleomicina e do peso do camundongo, ajuste a concentração da solução de bleomicina conforme necessário. Ao praticar essa técnica, use um corante à base de água, como o azul de Evans, para confirmar que a solução é administrada no trato respiratório inferior, e não no estômago¹⁴.

4. Recuperação de animais

1. Após o tratamento, coloque o animal de lado em sua gaiola com uma almofada de aquecimento embaixo para manter a termoneutralidade.
2. Monitore os ratos até que estejam totalmente conscientes. Isso normalmente leva de 1 a 2 horas, dependendo da dose de cetamina usada e do metabolismo do animal. Aperte suavemente os dedos dos pés e mantenha os animais eutérmicos para facilitar o despertar.
3. Monitore clinicamente os camundongos diariamente quanto a mudanças no peso corporal, higiene, nível de atividade e estado respiratório. Semelhante a outros métodos de administração de bleomicina, os animais podem experimentar perda de peso significativa ao longo do curso de 14 a 21 dias, o que é um marcador chave da eficácia do modelo.
4. De acordo com os protocolos ARC e IACUC, sacrificar animais se a perda de peso exceder 20% do peso inicial do animal. A prevalência e a gravidade da perda de peso dependem da dose de bleomicina usada e da demografia dos camundongos (veja acima).

5. Coleta de tecidos, processamento e análise de ponto final

1. Dependendo da questão experimental e do ponto de tempo desejado, eutanasiar os camundongos seguindo os protocolos IACUC e colher seus pulmões²⁸ no momento apropriado. Os efeitos da bleomicina são frequentemente aparentes visualmente em comparação com o controle, indicando administração bem-sucedida. Nesses estudos, os camundongos foram sacrificados nos dias 7, 14 e 21.
2. Para histologia, dissecar os pulmões em bloco e fixá-los em PFA a 4% por 24 h. Prossiga com a inclusão de parafina, seccionamento, hematoxilina e eosina (H & E) e / ou coloração tricrômica de Masson conforme descrito anteriormente 28,29,30.
3. Para a medição do colágeno, homogeneizar o pulmão direito e usar um kit disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) para medir o conteúdo de hidroxiprolina conforme descrito anteriormente³¹.
4. Para citometria de fluxo, digerir o pulmão direito usando o dissociador de tecido e uma solução enzimática para obter uma suspensão de célula única. Realize a coloração e análise por citometria de fluxo conforme descrito anteriormente 32,33,34.

O protocolo aqui descrito resume a via de administração da aspiração orofaríngea no modelo murino de bleomicina. Nesses experimentos, os animais foram tratados com bleomicina (0,75U/kg de peso corporal) ou PBS para controle simulado. Nos dias 7, 14 e 21, os camundongos foram sacrificados, seus pulmões explantados e o tecido fixado, conforme descrito anteriormente³⁵. A fibrose foi avaliada por meio de coloração histológica de hematoxilina e eosina (H&E). No dia 7, a alteração fibrótica dos septos alveolares pode ser observada, juntamente com pequenas alterações inflamatórias/fibróticas, em comparação com o controle da PBS (Figura 3A,B). No dia 14, áreas de fibrose maiores e mais confluentes são observadas, com destruição significativa da arquitetura alveolar normal (Figura 3C). No dia 21, essas alterações fibróticas significativas permanecem (Figura 3D). Essas alterações histopatológicas foram quantificadas usando o sistema de pontuação de Ashcroft modificado²⁹, que demonstrou um grau semelhante de fibrose entre os dias 14 e 21 (Figura 3E).

Embora a histopatologia continue sendo o padrão-ouro, ensaios adicionais podem ser realizados para quantificar objetivamente as alterações fibróticas e inflamatórias induzidas pela bleomicina. Para confirmar os achados de H&E, foram realizados ensaios de hidroxiprolina no dia 14³¹, que demonstraram um aumento na quantidade total de conteúdo de colágeno com bleomicina (Figura 4A). Além disso, o RNA foi isolado de homogeneizados de pulmão inteiro no dia 14, e uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) demonstrou a regulação positiva dos genes profibróticos Col3a1 e Tgfb com bleomicina (Figura 4B). Para caracterizar as alterações imunes induzidas pela bleomicina orofaríngea, foi realizada citometria de fluxo conforme descrito anteriormente 32,33,34 (Figura 4C). Em resposta à bleomicina OA, observa-se uma infiltração robusta de células mieloides no pulmão murino, incluindo macrófagos intersticiais (IM), macrófagos alveolares derivados de monócitos (MoAM) e neutrófilos (Figura 4D). Esses dados demonstram que a técnica de aspiração orofaríngea é uma metodologia segura, conveniente e reprodutível para induzir fibrose pulmonar com bleomicina no modelo animal murino.

Figura 1: Linha do tempo do protocolo experimental. (A) Representação gráfica da administração orofaríngea de bleomicina no pulmão murino. (B) Linha do tempo do curso da doença de bleomicina. A fase inflamatória inicial dura 48-72 h e é seguida por uma fase fibrótica que começa aproximadamente no dia 7, que se resolve após 6 semanas para injeções individuais. As setas representam os tempos potenciais comuns de colheita de tecido (dia 7, 14 ou 21), dependendo da questão do experimento e dos ensaios utilizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Esquema da administração orofaríngea de bleomicina. (A) Uma vez devidamente sedado, o camundongo é amarrado por seus incisivos frontais a 60 ° -80 ° em uma plataforma segura. (B) A passagem nasal é ocluída usando uma pinça microvascular não serrilhada. A língua é retraída da orofaringe e, usando uma pipeta de passo com ponta de ponta de leur, a solução de bleomicina, ou controle PBS, é administrada na parte de trás da orofaringe. Uma bolha visível de fluido deve ser visível até ser aspirada para o trato respiratório inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: A administração de bleomicina por aspiração orofaríngea resulta em alterações histológicas fibróticas robustas. Camundongos C57Bl / 6 do tipo selvagem foram tratados com uma dose única de bleomicina (0,75U / kg) ou PBS no dia 0. (A) Os controles simulados demonstram histologia pulmonar normal. (BD) A bleomicina resulta em fibrose progressiva e distorção arquitetural do pulmão murino. (E) Pontuação de Ashcroft modificada de amostras histológicas. As barras de erro representam o desvio padrão. p < 0,0001 conforme determinado pela ANOVA unidirecional. As imagens são representativas de três experimentos independentes realizados com 4-8 animais por grupo. As imagens 20x (direita, barras de escala: 200 μm) são das inserções designadas nas imagens 1x (esquerda, barras de escala: 3 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Quantificação das alterações pró-fibróticas e pró-inflamatórias induzidas pela bleomicina. (A) Os pulmões foram colhidos no dia 14 de camundongos C57Bl / 6 do tipo selvagem tratados com bleomicina (0,75U / kg) ou PBS. Foram realizados ensaios de hidroxiprolina e medido o conteúdo de colágeno (mg por pulmão direito). (B) O RNA foi isolado do tecido pulmonar homogeneizado de animais tratados com bleomicina ou PBS no dia 14. A PCR quantitativa foi realizada para medir o nível de transcritos Col1a1 e Tgfb . A mudança de dobra relacionada ao grupo controle PBS foi calculada usando o método 2^CP em referência ao gene de limpeza interna. (C) Estratégia de bloqueio de fluxo de populações mieloides no pulmão murino. (D) Quantificação de populações mieloides no pulmão murino no dia 14, em resposta à bleomicina. Os dados são representativos de três experimentos independentes com 4-8 animais por grupo por experimento. As barras de erro representam o desvio padrão. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 conforme determinado pelo teste t de Student não pareado (hidroxiprolina e qPCR) ou ANOVA de duas vias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Um protocolo de vídeo detalhado é fornecido sobre a técnica de aspiração orofaríngea para administração de bleomicina para uso no modelo murino de fibrose pulmonar. Além disso, destacamos potenciais aplicações a jusante para quantificar alterações fibróticas e inflamatórias induzidas pela bleomicina OA.

Embora nenhum animal recapitule totalmente a complexidade da doença humana, o modelo de camundongo com bleomicina tem sido usado nas últimas cinco décadas e continua sendo o mais amplamente implementado para estudar a patogênese da FPI³⁶. Há uma infinidade de maneiras de administrar bleomicina em modelos de roedores, inclusive por injeção intratraqueal (IT), intranasal (IN), intravenosa (IV), intraperitoneal e subcutânea⁶. Embora a administração intravenosa imite mais de perto o mecanismo da pneumonite induzida por bleomicina em humanos, a via IT é mais comumente usada; A fibrose é obtida com uma dose única, sem toxicidades sistêmicas associadas a doses mais altas, e é mais custo-efetiva⁸. A entrega de IT requer intubação endotraqueal ou exploração cirúrgica no pescoço e traqueostomia, ambas exigindo níveis profundos de sedação e um alto grau de habilidade de procedimento, ao mesmo tempo em que acarretam morbidade e mortalidade periprocedimento associadas significativas. A administração de IN é uma alternativa razoável à TI, no entanto, tem se mostrado mais variável A abordagem OA tem visto um uso crescente e representa um substituto aparentemente mais reprodutível para a entrega de bleomicina e outros agentes fibrosantes no pulmão murino 14,21,22,23,24,25,26. Recentemente, as vias de administração de bleomicina para OA e IT foram comparadas diretamente em camundongos, demonstrando igual eficácia e lesão fibrótica homogênea, minimizando a mortalidade periprocedimento²¹. Da mesma forma, neste estudo, nenhum camundongo morreu após a administração de OA (dados não mostrados), ressaltando o perfil técnico e ético favorável desse método.

O grau de fibrose e o momento da lesão induzida pela bleomicina dependem de vários fatores. Após a instilação de bleomicina no pulmão murino, ocorre um período inflamatório inicial de lesão pulmonar aguda, seguido por uma fase fibroproliferativa que se inicia após 5-7 dias¹⁰. Rotineiramente, os desfechos da doença são avaliados entre os dias 14-21, quando a fibrose sustentada é alcançada (Figura 3C). O presente estudo concentrou-se no dia 14, que se mostrou o momento ideal para medir os parâmetros de fibrose pulmonar, pois os animais desenvolveram fibrose extensa, com menor variabilidade e menor mortalidade do que no dia 21¹¹. Após uma dose única, observou-se que a fibrose se resolve espontaneamente após aproximadamente 6 semanas em camundongos. Para capturar a irreversibilidade observada com muitas formas de DPI em humanos, os pesquisadores desenvolveram modelos de dosagem repetitivos para alcançar alterações fibróticas permanentes em modelos murinos ^9,12.

Estudos anteriores demonstraram uma variação de cepa em relação à gravidade da fibrose alcançada com uma dose única de bleomicina, sendo os camundongos C57Bl/6 "respondedores altos", os camundongos DBA/2 e Swiss "respondedores intermediários" e os camundongos BALB/c sendo "respondedores baixos"³⁹. Além disso, a idade e o sexo dos camundongos usados também influenciam o grau de inflamação e fibrose. Camundongos mais velhos (52-54 semanas) demonstraram fibrose aumentada do que camundongos mais jovens (8-12 semanas), e camundongos machos parecem mais suscetíveis à bleomicina, em geral, do que suas contrapartes fêmeas ^9,40. Essas observações sugerem fatores genéticos subjacentes que influenciam a resposta inflamatória e de cicatrização de feridas, e os investigadores devem combinar a idade e o sexo dos camundongos ao testar possíveis vias terapêuticas, conforme sugerido pelas recentes diretrizes oficiais da American Thoracic Society (ATS)²⁵.

A bleomicina representa um modelo inflamatório de fibrose. O dano epitelial inicial induzido pela bleomicina resulta em produção aguda e transitória de citocinas e recrutamento de neutrófilos no pulmão^41,42. A FPI em si não é clinicamente caracterizada por um fenótipo imunológico forte, além de exacerbações agudas, embora outros tipos de DPI, como aqueles associados à doença do tecido conjuntivo (DTC-DPI), sejam mais claramente impulsionados pela desregulação imunológica 43,44,45. Portanto, dependendo da hipótese que está sendo testada, os investigadores podem optar por estudar intervenções que interceptam os eixos da doença em momentos anteriores ou posteriores. Além disso, recomenda-se que um segundo modelo seja considerado para validar os principais achados na triagem de terapias pré-clínicas, como sílica, superexpressão de adenovírus TGF-β1, dano epitelial induzido por difteria ou modelos de camundongos humanizados 5,17,46,47,48.

Em conclusão, a técnica de aspiração orofaríngea representa uma alternativa robusta, reprodutível, traduzível e segura à administração intratraqueal de bleomicina para induzir fibrose no pulmão murino.

Os autores não têm conflitos de interesse.

Este trabalho foi apoiado pelo Prêmio de Serviço Nacional de Pesquisa (NRSA) do NIH Ruth L. Kirchstein Bolsa de Treinamento em Pesquisa Institucional (T32) concedido a RW (2T32HL072752-16). Os autores também gostariam de agradecer o apoio do Centro de Saúde Pulmonar da Fundação Saul e Joyce Brandman.