在肺纤维化小鼠模型中口咽给药博来霉素

该方案展示了用于肺纤维化博来霉素小鼠模型的口咽抽吸技术。

间质性肺病 （ILD） 是一系列广泛的疾病，其特征是肺实质进行性且通常不可逆的瘢痕形成，最常见的是特发性肺纤维化 （IPF）。已经开发了几种 IPF 动物模型，其中博来霉素小鼠模型使用最广泛。博来霉素是一种已知可在肺泡上皮中诱导 DNA 损伤的化疗药物，导致人类急性肺损伤和肺纤维化。IPF 的啮齿动物模型通过各种方法使用博来霉素给药，最常见的是气管内 （IT）。最近，口咽抽吸 （OA） 技术已被证明对多种纤维化药物与 IT 同样有效，副作用要少得多，给药途径更容易。该协议详细介绍了博来霉素递送到小鼠肺的 OA 方法，并强调了数据定量的潜在下游应用示例。这种方法提供了一种简单、快速和安全的方法，可以利用这种广泛使用的动物模型来研究 IPF 的分子机制。

间质性肺病 （ILD） 是指一组异质性疾病，其特征是肺泡间隙、间质和远端气道出现进行性和不可逆的瘢痕形成¹。特发性肺纤维化 （IPF） 是最常见的 ILD 形式，中位生存期约为 3^{年 2}。IPF 最终是一种绝症，原位肺移植是特定患者的挽救疗法。目前有两种 FDA 批准的 IPF 疗法，这两种疗法都只是减缓进展速度，而不是稳定或改善患者的肺功能 ^3,4。正在进行重要的研究工作，以阐明 IPF 的基础并确定新的治疗靶点。存在无数动物模型来研究 IPF 发病机制，每种模型都有自己的优点和缺点⁵.虽然没有一个模型能够完全概括人类疾病的复杂性，但这些方法确实为 IPF 的分子机制提供了重要的见解，并且可以补充转化研究。

博来霉素小鼠模型仍然是 IPF⁶ 使用最广泛和表征最充分的体内模型。博来霉素是一种诱导单链和双链 DNA 断裂的肽剂。自 1962 年被发现以来，博来霉素被发现可有效治疗多种癌症，包括睾丸肿瘤和淋巴瘤，但其使用受到剂量依赖性肺炎和由此产生的肺纤维化的限制 ^7,8。这种肺毒性在小鼠中得到了概括。当以单剂量给药时，在初始炎症期之后，可以在第 5 天附近开始看到纤维化，在第 14-21 天 ^9,10,11 达到峰值（图 1）。大约 6 周后自发消退，但重复给药可以实现永久性纤维化变化¹²。鉴于短暂性和炎症性，博来霉素¹³ 型存在一些固有的缺点，但它提供了一个快速、稳健且可重复的系统，开始回答我们领域对 ILD 的理解中的一些主要差距，并允许研究人员比较过去五十年的结果。其他安装方法包括石棉肺和二氧化硅鼠模型，它们提供相似的时间过程（第 14-28 天）^{6、14、15、16}。然而，这些模型产生的组织学模式比 IPF 更符合尘肺病，并且需要使用空气中的颗粒物，因此需要小心处理。或者，存在利用上皮驱动的转基因表达的动物模型，例如白喉毒素和 TGF-β1。这些概括了 IPF 中观察到的非炎性肺泡 2 型上皮细胞损伤，但需要稍长的时间 （21-30d），并且需要使用必须回交到任何现有的感兴趣转基因模型中的特殊动物。最后，腺病毒介导的细胞因子过表达，包括 TGF-β1、IL-β1 和 TNF-α，已被证明会诱导啮齿动物肺纤维化，通常在第 14 天 17,18,19。这些细胞因子过表达模型可以方便地进行鼻内递送，但需要仔细纯化和处理。

博来霉素的输送有多种方法，包括气管内 （IT）、鼻内、腹膜内、皮下和静脉内途径⁶。IT 输送是最常见的方法，传统上涉及气管插管或外科气管切开^{术 20}，这两种方法都需要深度镇静、技术技巧，并且与围手术期发病率和死亡率相关。最近，口咽抽吸 （OA） 技术已被证明与 IT 同样有效，副作用要少得多，分娩途径更容易 14,21,22,23,24,25,26。在这里，我们提出了博来霉素递送到小鼠肺的 OA 方法的详细视觉方案，并强调了数据定量的各种潜在下游应用。

这些实验中描述的动物研究是根据加州大学洛杉矶分校动物研究委员会 （ARC） 和机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的方案（ARC-2021-025、ARC-2010-039）进行的。完全遵守有关实验动物使用的所有州和联邦法规和政策。动物被安置在加州大学洛杉矶分校的动物护理设施中，并由加州大学洛杉矶分校实验室和动物医学部 （DLAM） 的熟练工作人员在无病原体的条件下照顾。野生型 C57BL/6 小鼠是市售的，并使其适应至少 14 天。这些研究使用 8-12 周龄的雄性小鼠，平均体重为 20-25 g。也可以使用雌性小鼠，尽管在实验组和条件下对动物进行性别和年龄匹配很重要²⁷。本研究中使用的动物、试剂和设备的商业细节列在 材料表中。

1. 博来霉素的口咽给药

1. 博来霉素的制备
   注：使用药用级博来霉素以确保动物和实验之间的一致性和可重复性。博来霉素的剂量以每公斤动物的药物 （U/kg） 为单位，而不是毫克 （mg） 每公斤。
   1. 将博来霉素粉末溶解在无菌药用级 PBS 中，至储备浓度为 10 U/mL。博来霉素应在化学罩下使用适当的化疗预防措施制备。将等分试样在 -20 °C 下储存长达 6 个月。
   2. 准备最终的工作浓度。剂量基于体重 （0.5-3 U/kg），并根据使用的博来霉素和实验目的（例如，存活或致死剂量）根据需要进行调整。
   3. 根据需要调整最终给药量。对于这些研究，将博来霉素稀释至 0.375 U/mL，相当于 25 g 小鼠的 50 μL，最终工作浓度为 0.75 U/kg。

2. 麻醉诱导

1. 通过在 PBS 中将氯胺酮和甲苯噻嗪分别稀释至 10 mg/mL 和 1 mg/mL 的工作浓度来制备麻醉混合物。在无菌条件下使用药用级试剂并按照机构批准的方案执行此步骤。
2. 使用 27.5 G 针头和 1 mL 注射器通过腹膜内注射，每克动物体重施用 10 μL 鸡尾酒（工作浓度：氯胺酮 100 mg/kg，甲苯噻嗪 10 mg/kg）。
   1. 确保鼠标得到适当的麻醉并且对有害刺激（例如脚趾捏）没有反应。效果应在 5 分钟内看到。如果仍然有反应，则以 20 μL 的增量给予额外的氯胺酮/甲苯噻嗪，直到达到所需的麻醉水平。涂抹眼药膏以防止麻醉时眼睛干涩。
      注意：氯胺酮优于其他注射麻醉剂和镇静剂，因为它具有良好的副作用。它对血流动力学的影响最小，包括心率和呼吸频率。吸入异氟醚可用作替代麻醉剂。在这些研究中，氯胺酮/甲苯噻嗪是首选，因为它可在给药后导致长时间的镇静和轻微的博来霉素咳嗽或反流。

3. 口咽给药

1. 适当镇静后，将鼠标以 60°-80° 的角度悬挂在手术平台上，将其悬挂在前门牙上，以有效打开口咽部（图 2A）。
2. 用光滑的微血管夹堵塞鼻道，迫使小鼠通过其口咽部呼吸。
3. 使用镊子将舌头从口咽部缩出。
4. 使用带有 stub leur-stub 尖端的步进移液器，将所需体积的博来霉素或盐水对照轻轻放入口咽后部。确保液体气泡清晰可见（图 2B）。
5. 继续将舌头保持在原位，直到动物吸出溶液。这应该是可见的，并且通常是听得见的。
   注意：如果动物快速吸出溶液，则口咽后部的可视化可能会在几秒钟内出现短暂的。无论如何，如果成功，动物的呼吸模式会突然和短暂地发生变化，进行快速、浅呼吸。可能会出现液体冒泡，进一步表明液体已成功进入下呼吸道。偶尔也可能发生咳嗽。这通常是博来霉素溶液的微小体积，不应影响实验结果，从而允许动物继续参与研究。避免重复给药，因为它会增加窒息的风险并改变最终基于体重的剂量。
6. 确认抽吸后，小心地取下鼻夹。
7. 在悬挂位置观察动物 15-30 秒，以确保博来霉素溶液没有反流，然后将其放回笼子中。
   注：建议最大体积为 50 μL，以最大限度地降低窒息风险。根据博来霉素的所需剂量和小鼠的体重，根据需要调整博来霉素溶液的浓度。在练习这种技术时，使用水基染料（如埃文思蓝）确认溶液是注入下呼吸道，而不是注入胃¹⁴。

4. 动物恢复

1. 处理后，将动物侧卧在笼子里，下面放一个加热垫，以保持热中性。
2. 监测老鼠，直到它们完全清醒。这通常需要 1-2 小时，具体取决于所用氯胺酮的剂量和动物的新陈代谢。轻轻捏住脚趾，让动物保持体温正常，以促进醒来。
3. 每天临床监测小鼠的体重、梳理、活动水平和呼吸状态的变化。与博来霉素的其他递送方法类似，动物在 14-21 天的疗程中可能会出现明显的体重减轻，这是该模型有效性的关键标志。
4. 根据 ARC 和 IACUC 协议，如果体重减轻超过动物起始体重的 20%，则对动物实施安乐死。体重减轻的患病率和严重程度取决于所用博来霉素的剂量和小鼠的人口统计数据（见上文）。

5. 组织收获、处理和终点分析

1. 根据实验问题和所需的时间点，按照 IACUC 方案对小鼠实施安乐死，并在适当的时间收获它们的肺²⁸ 。与对照相比，博来霉素的作用通常在视觉上非常明显，表明给药成功。在这些研究中，小鼠在第 7 天、第 14 天和第 21 天处死。
2. 对于组织学，将肺整块解剖并将它们固定在 4% PFA 中 24 小时。如前所述，进行石蜡包埋、切片、苏木精和伊红 （H&E） 和/或 Masson 三色染色 28,29,30。
3. 对于胶原蛋白测量，将右肺匀浆并使用市售试剂盒（参见 材料表）测量羟脯氨酸含量，如前所述³¹。
4. 对于流式细胞术，使用组织解离剂和酶溶液消化右肺以获得单细胞悬液。如前所述 32,33,34 进行流式细胞术染色和分析。

此处描述的方案总结了博来霉素小鼠模型中的口咽抽吸给药途径。在这些实验中，用博来霉素 （0.75U/kg 体重） 或 PBS 处理动物进行假对照。在第 7 天、第 14 天和第 21 天，对小鼠实施安乐死，取出肺并固定组织，如前所述³⁵。使用苏木精和伊红 （H&E） 组织学染色评估纤维化。到 7 天，与 PBS 对照相比，可以看到肺泡隔膜的纤维化变化，以及微小的炎症/纤维化变化（图 3A、B）。到第 14 天，可以看到更大、更融合的纤维化区域，正常的肺泡结构显着破坏（图 3C）。在第 21 天，这些显着的纤维化变化仍然存在（图 3D）。这些组织病理学变化使用改良的 Ashcroft 评分系统²⁹ 进行量化，该系统显示第 14 天和第 21 天之间的纤维化程度相似（图 3E）。

虽然组织病理学仍然是金标准，但可以进行额外的分析以客观量化博来霉素诱导的纤维化和炎症变化。为了确认 H&E 结果，在第 14 天³¹ 进行了羟脯氨酸测定，结果表明博来霉素的胶原蛋白总含量增加（图 4A）。此外，在第 14 天从全肺匀浆中分离 RNA，定量聚合酶链反应 （qPCR） 显示博来霉素上调促纤维化基因 Col3a1 和 Tgfb（图 4B）。为了表征口咽博来霉素诱导的免疫变化，如前所述进行流式细胞术 32,33,34 （图 4C）。响应 OA 博来霉素，观察到骨髓细胞强烈浸润到小鼠肺中，包括间质巨噬细胞 （IM）、单核细胞衍生的肺泡巨噬细胞 （MoAM） 和中性粒细胞（图 4D）。这些数据表明，口咽抽吸技术是一种安全、方便且可重复的方法，可在小鼠动物模型中使用博来霉素诱导肺纤维化。

图 1：实验方案的时间表。 （A） 将博来霉素注入小鼠肺的口咽部图形表示。（B） 博来霉素病程的时间表。初始炎症期持续 48-72 小时，随后是大约从第 7 天开始的纤维化期，对于单次注射，在 6 周后消退。箭头代表常见的潜在组织收获时间（第 7 天、第 14 天或第 21 天），具体取决于所使用的实验问题和测定方法。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：博来霉素口咽给药示意图。 （A） 适当镇静后，鼠标由其前门牙以 60°-80° 在安全平台上串起。（B） 使用非锯齿状微血管夹封闭鼻道。舌头从口咽部缩回，并使用带有 stub leur-stub 尖端的步进移液器，将博来霉素溶液或 PBS 对照注入口咽部后部。在吸入下呼吸道之前，应可以看到可见的液体气泡。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：通过口咽抽吸施用博来霉素可导致剧烈的纤维化组织学变化。野生型 C57Bl/6 小鼠在第 0 天用一次性剂量的博来霉素 （0.75U/kg） 或 PBS 处理。（A） 假对照显示正常的肺组织学。（B - D）博来霉素导致小鼠肺进行性纤维化和结构扭曲。（E） 组织学样本的改良 Ashcroft 评分。误差线表示标准差。p < 0.0001，由单因素方差分析确定。图像代表了每组 4-8 只动物进行的三个独立实验。20x 图像（右，比例尺：200 μm）来自 1x 图像（左，比例尺：3 mm）上的指定插图。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：博来霉素诱导的促纤维化和促炎变化的定量。 （A） 在第 14 天从用博来霉素 （0.75U/kg） 或 PBS 处理的野生型 C57Bl/6 小鼠中收获肺。进行羟脯氨酸测定，并测量胶原蛋白含量 （mg per right lung）。（B） 在第 14 天从博来霉素或 PBS 处理的动物的匀浆肺组织中分离 RNA。进行定量 PCR 以测量 Col1a1 和 Tgfb 转录本的水平。参考内部管家基因，使用 2^CP 方法计算与 PBS 对照组相关的倍数变化。（C） 小鼠肺中髓系种群的流门控策略。（D） 对博来霉素反应第 14 天小鼠肺中髓系细胞群的定量。数据代表三个独立实验，每个实验每组 4-8 只动物。误差线表示标准差。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，由未配对的学生 t 检验 （羟脯氨酸和 qPCR）或双向方差分析确定。 请单击此处查看此图的较大版本。

提供了有关口咽抽吸技术的详细视频方案，用于施用博来霉素以用于肺纤维化的小鼠模型。此外，我们强调了潜在的下游应用，以量化 OA 博来霉素诱导的纤维化和炎症变化。

虽然没有一种动物可以完全概括人类疾病的复杂性，但博来霉素小鼠模型已经使用了五十年，并且仍然是研究 IPF³⁶ 发病机制的最广泛应用模型。在啮齿动物模型中，有多种方法可以施用博来霉素，包括气管内 （IT）、鼻内 （IN）、静脉内 （IV）、腹膜内和皮下注射⁶。虽然静脉注射更接近于博来霉素诱导人类肺炎的机制，但 IT 途径更常用;纤维化是通过单剂量实现的，没有与较高剂量相关的全身毒性，并且更具成本效益⁸。IT 分娩需要气管插管或颈部手术探查和气管切开术，两者都需要深度镇静和高度的作技能，同时具有显着的相关围手术期发病率和死亡率。IN 给药是 IT 的合理替代方案，但是，它已被证明会导致更多可变的分布模式和肺损伤^37,38。OA 方法的使用越来越多，并且代表了将博来霉素和其他纤维化剂输送到小鼠肺的似乎更具可重复性的替代品 14,21,22,23,24,25,26。最近，在小鼠中直接比较了博来霉素给药的 OA 和 IT 途径，证明疗效相同且纤维化损伤均匀，同时将围手术期死亡率降至最低²¹。同样，在这项研究中，没有小鼠在 OA 给药后死亡（数据未显示），强调了该方法的良好技术和伦理特征。

博来霉素引起的纤维化程度和损伤时间取决于几个因素。将博来霉素滴注到小鼠肺后，发生急性肺损伤的初始炎症期，随后在 5-7 天后开始纤维增生期¹⁰。通常，在达到持续纤维化的第 14-21 天之间评估疾病终点（图 3C）。本研究集中在第 14 天，这已被证明是测量肺纤维化参数的最佳时间，因为动物已经发展出广泛的纤维化，与第 21 天相比，变异性更小，死亡率^更低。单剂量后，已注意到小鼠纤维化在大约 6 周后自发消退。为了捕捉人类多种形式的 ILD 的不可逆性，研究人员开发了重复给药模型，以实现小鼠模型中的永久性纤维化变化 ^9,12。

先前的研究表明，单剂量博来霉素所达到的纤维化严重程度存在菌株差异，其中 C57Bl/6 小鼠是“高反应者”，DBA/2 和瑞士小鼠是“中等反应者”，BALB/c 小鼠是“低反应者”³⁹。此外，所用小鼠的年龄和性别也会影响炎症和纤维化的程度。老年小鼠 （52-54 周） 比年轻小鼠 （8-12 周） 表现出纤维化增加，并且雄性小鼠通常比雌性小鼠更容易受到博来霉素的影响 ^9,40。这些观察结果表明影响炎症和伤口愈合反应的潜在遗传因素，研究人员在测试潜在的治疗途径时应与小鼠进行年龄和性别匹配，正如最近的美国胸科学会 （ATS） 官方指南所建议的那样²⁵。

博来霉素代表纤维化的炎症模型。博来霉素诱导的初始上皮损伤导致肺中短暂、急性细胞因子产生和中性粒细胞募集^41,42。除了急性加重外，IPF 本身在临床上并不具有很强的免疫表型特征，尽管其他类型的 ILD，例如与结缔组织病 （CTD-ILD） 相关的 ILD，更明显地是由免疫失调驱动的 43,44,45。因此，根据正在检验的假设，研究人员可能会选择研究在较早或较晚的时间点截断疾病轴的干预措施。此外，建议在筛选临床前疗法时考虑使用第二个模型来验证关键发现，例如二氧化硅、TGF-β1 腺病毒过表达、白喉诱导的上皮损伤或人源化小鼠模型 5,17,46,47,48。

总之，口咽抽吸技术代表了一种稳健、可重复、可翻译且安全的替代方法，可替代气管内输送博来霉素以诱导小鼠肺纤维化。

作者没有利益冲突。

这项工作得到了授予 RW （2T32HL072752-16） 的 NIH Ruth L. Kirchstein 国家研究服务奖 （NRSA） 机构研究培训补助金 （T32） 的支持。作者还要感谢 Saul 和 Joyce Brandman 基金会肺健康中心的支持。