Identificação de inibidores de PD-1/PD-L1 com tecnologia de ressonância plasmônica de superfície

Este protocolo descreve um ensaio de bloqueio para inibidores de PD-1/PD-L1 usando tecnologia de ressonância plasmônica de superfície. Ele emprega uma estratégia de imobilização em duas etapas e um sistema tampão personalizado para medir com precisão as unidades de resposta, facilitando a avaliação das taxas de bloqueio de compostos ou produtos biológicos. Além disso, suporta a identificação de alto rendimento de inibidores de PD-1/PD-L1.

A interrupção da interação PD-1/PD-L1 é uma estratégia promissora para a imunoterapia contra o câncer. Plataformas de triagem confiáveis são essenciais para avaliar a eficácia dos inibidores de PD-1/PD-L1. Um ensaio de bloqueio de PD-1/PD-L1 humano previamente estabelecido utilizando a tecnologia de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) (plataforma de triagem SPR inibidora de PD-1/PD-L1 de primeira geração) demonstrou resultados comparáveis aos obtidos por meio de Fluorescência Homogênea Resolvida no Tempo (HTRF) e ensaios baseados em células, com potencial para triagem em larga escala. Aqui, uma versão otimizada deste ensaio (plataforma de triagem SPR inibidora de PD-1 / PD-L1 de segunda geração) é apresentada, apresentando um processo de acoplamento de duas etapas que combina acoplamento de amina e bioestreptavidina para melhorar o controle de orientação de PD-1 no chip e reduzir o consumo de proteína PD-1. A plataforma atualizada foi validada com sucesso usando o inibidor de PD-1/PD-L1 BMS-1166, mostrando efeitos de bloqueio comparáveis ao método anterior baseado em SPR e outras técnicas estabelecidas, como ELISA. Esses resultados confirmam a confiabilidade da abordagem. Esta plataforma de triagem SPR otimizada oferece uma ferramenta confiável e de alto rendimento para identificar novos inibidores de PD-1/PD-L1, avançar na pesquisa de imunoterapia contra o câncer e destacar o potencial da SPR na triagem de inibidores de checkpoint imunológico.

As terapias de bloqueio de checkpoint imunológico, particularmente aquelas direcionadas à Morte Celular Programada-1 (PD-1) e ao Ligante de Morte Celular Programada 1 (PD-L1), estão na vanguarda das estratégias de imunoterapia contra o câncer. As terapias anti-PD-1/PD-L1 receberam aprovação para uso em vários tipos de câncer, como câncer hematológico, cutâneo, pulmonar, hepático, de bexiga urinária e renal¹. PD-1 é uma glicoproteína transmembrana pertencente à superfamília das imunoglobulinas, caracterizada por um único domínio semelhante a uma variável de imunoglobulina (IgV) no N-terminal, um pedúnculo de aproximadamente 20 aminoácidos separando o domínio IgV da membrana plasmática, um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática contendo motivos de sinalização baseados em tirosina². A PD-L1, identificada como um dos ligantes para a PD-1, é uma proteína transmembrana do tipo I com região transmembrana, dois domínios extracelulares - constante de imunoglobulina (IgC) e IgV - e um domínio citoplasmático relativamente curto que desencadeia vias de sinalização intracelular³. A via inibitória PD-1 / PD-L1 serve como um ponto de verificação imunológico crítico que regula a ativação e a autoimunidade das células T⁴. O PD-1 é expresso em células T, onde interage com o PD-L1, inibe a sinalização do receptor de células T e bloqueia a estimulação de moléculas CD28 e CD80 em células apresentadoras de antígenos e células T⁵. Os tecidos cancerígenos exploram esse mecanismo fisiológico superexpressando PD-L1 durante a fase de escape, criando assim um ambiente imunossupressor que promove o crescimento e a progressão do tumor⁶. Os inibidores de PD-1 e PD-L1 interrompem essa interação, permitindo que o sistema imunológico evite a supressão induzida pelo tumor e reinicie o processo de morte tumor-celular mediado por células T⁷.

Com base na base estabelecida pelo papel proeminente das terapias de bloqueio de checkpoint imunológico, o desenvolvimento de inibidores de PD-1 / PD-L1 marcou um avanço significativo na imunoterapia contra o câncer. A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA endossou nove inibidores de checkpoint imunológico que visam especificamente a via PD-1 / PD-L1. Estes incluem seis inibidores de PD-1 - pembrolizumabe, dostarlimabe, nivolumabe, cemiplimabe, oripalimabe e tislelizumabe - e três inibidores de PD-L1 - atezolizumabe, avelumabe e durvalumabe ^8,9. Essas terapias têm sido efetivamente utilizadas para tratar uma variedade de cânceres, como melanoma, câncer de pulmão, câncer urotelial, câncer cervical, câncer gástrico ou gastroesofágico e outros tumores sólidos¹⁰. Apesar de sua eficácia, as terapias baseadas em anticorpos monoclonais enfrentam limitações significativas, incluindo baixas taxas de resposta, altos custos, meias-vidas prolongadas, eventos adversos graves relacionados ao sistema imunológico e restrições ao parto intravenoso ou subcutâneo 11,12,13. Consequentemente, a pesquisa está cada vez mais focada no desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas direcionados ao eixo PD-1 / PD-L1. Essas pequenas moléculas oferecem vantagens distintas, como melhor penetração celular, modulação de diversos alvos biológicos, biodisponibilidade oral aprimorada e custos reduzidos, com o objetivo de alcançar resultados terapêuticos comparáveis com menos efeitos adversos¹⁴. No entanto, o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas direcionados à interação PD-1/PD-L1 está em seus estágios iniciais, principalmente devido à falta de uma plataforma confiável de triagem de alto rendimento. Essas plataformas são essenciais para avaliar rapidamente vastas bibliotecas de pequenas moléculas e identificar compostos principais para validação e otimização adicionais. Superar esse desafio é fundamental para o avanço da imunoterapia contra o câncer.

A tecnologia de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR) é amplamente empregada na detecção de várias biomoléculas, incluindo antígenos de anticorpos, enzimas, ácidos nucléicos e medicamentos, e é particularmente eficaz na triagem de medicamentos de moléculas pequenas^15,16. Ao contrário de outras técnicas biofísicas, a SPR oferece detecção sem marcadores, dados cinéticos em tempo real e uma ampla faixa de detecção. Em contraste, a calorimetria de titulação isotérmica carece de insights cinéticos em tempo real e requer volumes de amostra maiores, limitando o rendimento. A termoforese em microescala é propensa a interferência de buffer e não pode fornecer dados cinéticos, enquanto a interferometria de biocamada tem limitações específicas da aplicação com base no tamanho e nas propriedades moleculares. A fluorescência homogênea resolvida no tempo requer rotulagem e é suscetível à interferência fluorescente. Reconhecemos que o HTRF é outra tecnologia adequada para explorar os inibidores de PD-1 / PD-L1. Uma limitação inerente do HTRF, em comparação com o SPR, é a extinção da fluorescência causada por interações externas com o processo de excitação intramolecular (por exemplo, transferência de elétrons, FRET e branqueamento), a sensibilidade é muito baixa no processo de triagem de drogas devido ao pequeno intervalo de janela e interferência de compostos de biblioteca fluorescente ou proteínas biológicas¹⁷. Esses recursos posicionam a SPR como uma ferramenta superior para a descoberta de medicamentos. Nossos estudos anteriores demonstraram que a SPR é capaz de determinar o efeito de bloqueio de pequenas moléculas contra PD-1/PD-L1, o que é vantajoso em relação a outras técnicas que exigem altos requisitos de tecnologia de marcação, múltiplas etapas, baixa especificidade e alto custo no processo de descoberta de medicamentos¹⁸.

Este estudo apresenta uma plataforma otimizada baseada em SPR, integrando um processo de acoplamento de duas etapas que utiliza acoplamento de amina e bioestreptavidina para melhorar a orientação do PD-1 no chip e minimizar o uso de proteínas. Essa abordagem atualizada foi validada com sucesso usando o inibidor de PD-1 / PD-L1 BMS-1166 como um aglutinante de controle positivo, demonstrando efeitos de bloqueio comparáveis ao nosso método SPR anterior e a outras técnicas estabelecidas, como ELISA^19,20. Isso não apenas confirma a confiabilidade e reprodutibilidade de nosso protocolo, mas também ilustra a eficácia de nossa plataforma modificada em facilitar a triagem de alto rendimento de inibidores de PD-1 / PD-L1. A incorporação da etapa de captura de bioestreptavidina fornece orientação proteica direcionada ao local em vez de aleatória, permitindo concentração reduzida de PD-1 (40 μg/mL vs. 10 μg/mL) e economia de custos, permitindo que o usuário final imobilize estreptavidina (SA) em um chip CM5, uma alternativa mais barata aos chips SA pré-imobilizados comercializados. Isso o torna vantajoso para triagens em larga escala e econômicas de bibliotecas de compostos/peptídeos. Embora métodos adicionais de caracterização, incluindo ensaios in silico, in vitro e in vivo, sejam essenciais para avaliar o potencial clínico dos inibidores de PD-1/PD-L1 contra o câncer, nossa plataforma de triagem aprimorada baseada em SPR se destaca como uma ferramenta eficiente para triagem em larga escala de inibidores de PD-1/PD-L1.

Os reagentes e equipamentos estão listados na Tabela de Materiais.

1. Imobilização da proteína estreptavidina (SA) no chip CM5

1. Configure o método de imobilização no instrumento SPR : Abra/novo modelo de assistente , escolha a imobilização, defina o tipo de chip para CM5 e as células de fluxo por ciclo para 1. Verifique a imobilização da célula de fluxo 1 e da célula de fluxo 2.
   1. Defina Amine como método de imobilização. Defina o objetivo para o nível de imobilizado, concentração de ligante: 40 μg / mL de estreptavidina, nível alvo: 2000 RU, solução de lavagem: 50 mM NaOH. Em seguida, verifique o prime antes de executar.
2. Preparar os seguintes tubos: R2 B1 e R2 C1 - 40 μg/mL de estreptavidina; R2 B2 e R2 C2: 50 mM de NaOH; R2 B3 e R2 C3: EDC; R2 B4 e R2 C4: TAN; R2 B5 e R2 C5: Vazio; R2 B6 e R2 C6: etanolamina.
   NOTA: EDC e NHS ativam os grupos carboxila no chip CM5, permitindo o acoplamento covalente com aminas no ligante. A etanolamina é usada como um tampão de bloqueio para evitar a ligação inespecífica durante a imobilização.
3. Dilua 20 mL de tampão HBS-EP+ 10× em 180 mL de água deionizada (DI) para preparar 200 mL de solução tampão de corrida 1× HBS-EP+.
4. Adicione 1 mL de água livre de DNase a 1 mg de estreptavidina e incube em temperatura ambiente por 30 min. Em seguida, dilua a solução de estreptavidina a 40 μg/ml em tampão acetato (pH 4,5). Prepare os reagentes do kit de reagentes do acoplamento de amina de acordo com as instruções do fabricante e coloque todos os layouts do reagente relevantes conforme indicado na etapa 1.2.
5. Substitua o chip do sensor de manutenção pelo chip CM5, coloque o tubo A no buffer HBS-EP+ de 1× preparado, reabra o método de imobilização e insira os tubos de acordo com o layout da etapa 1.2. Execute o método e salve o arquivo de resultados.
6. Manutenção pós-execução: substitua o chip CM5 pelo chip do sensor de manutenção, coloque o Tubo A em uma garrafa cheia de água deionizada e execute a escorva. Depois de retirar o chip CM5, lave o chip com algumas gotas de água DI e seque ao ar. Coloque o chip em um tubo de 50 mL a 4 °C.
   NOTA: O SA imobilizado permite que o chip CM5 funcione como um chip SA.

2. Imobilização da proteína PD-1 no chip SA

1. Defina o método de imobilização no instrumento SPR : Abrir/novo modelo de assistente , escolha imobilização, defina o tipo de chip para SA e células de fluxo por ciclo para 1. Verifique imobilizar célula de fluxo 1 e célula 2.
   1. Defina a captura de SA-biotina como o método. Para a imobilização em branco do conjunto da célula 1, para a célula 2, defina o objetivo do nível imobilizado, 10 μg/mL PD-1 como ligante, nível alvo: 4000 RU e, em seguida, verifique o primer antes de executar.
      NOTA: Prepare os seguintes tubos - R2 B1 e R2 C1: 1 M de NaCl, 50 mM de NaOH; R2 B2 e R2 C2: 50% de isopropanol/50 mM de NaOH/1 m de NaCl; R2 C3: 10 μg/mL PD-1.
2. Dissolva 58,44 mg de NaCl em 1 mL de NaOH 50 mM para preparar a solução de NaCl 1 M e 50 mM de NaOH. Dissolva 58,44 mg de NaCl e 4,0 mg de NaOH em 500 μL de água e, em seguida, adicione 500 μL de isopropanol para preparar a solução de 50% de isopropanol / 50 mM de NaOH / 1 M de NaCl.
3. Prepare a solução de PD-1: Adicione 200 μL de água livre de DNase a 100 μg de PD-1 humano biotinilado (Fc e Avitagged) e estabilize à temperatura ambiente por 30 min, depois dilua para 10 μg / mL em tampão acetato (pH 5,0).
4. Coloque todos os layouts de reagente conforme descrito na etapa 2.1. Coloque o tubo A na solução tampão de execução HBS-EP+ de 1×, ejete o chip do sensor de manutenção e insira o chip SA (chip CM5 revestido pela proteína estreptavidina da etapa 1). Reabra o método de imobilização, insira o rack de reagentes 2 e verifique as posições e, em seguida, execute o método para o tempo de execução estimado.
5. Repita a etapa 1.6.

3. Reconhecimento de regeneração para PD-1 e PD-L1

1. Configure o método de reconhecimento de regeneração: Abra/novo modelo de assistente , escolha Regeneration Scouting, defina o caminho do fluxo: 2-1, 4-3, tipo de chip para SA, verifique o ciclo de condicionamento de execução, registre a solução como HBS-EP+, tempo de contato como 30 s, número de injeções como 3, solução como PD-L1, tempo de contato: 30 s, taxa de fluxo: 30 μL/min.
   1. Para parâmetros de regeneração, a vazão é de 30 μL/min e o período de estabilização é de 300 s. No planejamento experimental, defina o número de condições como 4 e o número de ciclos para cada condição como 2. Defina as condições como 4, solução de regeneração: Glicina 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, tempos de contato: 30 s, verifique a escorva antes de executar.
2. Defina cada concentração de PD-L1 como uma posição de poço de amostra separada em um layout de microplaca de 96 poços: R1 A1 a R1 A9: 1 μM PD-L1; R1 A10 a R1 A12: amortecedor HBS-EP+; R1 B1: Glicina 1,5; R1 B2: Glicina 2; R1 B3: glicina 2,5; R1 B4: Glicina 3.
   NOTA: O tampão glicina com pH diferente é usado como tampão de regeneração.
3. Prepare a solução PD-L1: Adicione 200 μL de água livre de DNase a 100 μg de proteína PD-L1 Fc Tag humana (9,42 μM) e, em seguida, dilua a 1 μM em tampão HBS-EP+.
4. Colocar todos os reagentes relevantes no esquema conforme descrito no passo 3.2. Coloque o tubo A no buffer HBS-EP+ de 1× e, em seguida, substitua o chip do sensor de manutenção pelo chip SA. Reabra o método Regeneration Scouting , siga a posição do tubo da etapa 3.2, insira o rack de reagentes e execute o método para o tempo de execução estimado.
5. Repita a etapa 1.6.

4. Validação da interação PD-1/PD-L1

NOTA: Para validação, um relatório publicado anteriormente¹⁸ foi seguido com pequenos ajustes.

1. Use os mesmos parâmetros do relatório publicado em Configurações gerais, Etapas do ensaio e Tipos de ciclo, defina o tempo de contato para 60 s, o tempo de dissociação para 60 s e a taxa de fluxo para 30 μL/min. Em variáveis de método, variáveis de avaliação e comandos, use a mesma configuração, exceto para usar Glicina 2.0 como Regeneração, taxa de fluxo de configuração para 30 μL/min, passa pelo caminho de fluxo de 1, 2, 3, 4.
   1. Em seguida, configure run e escolha o caminho do fluxo: 2-1, 4-3. Insira PD-L1 com concentrações de 0 μM, 0,037 μM, 0,111 μM, 0,333 μM e um peso molecular de 51.300 Da. Verifique todas as etapas do ensaio para verificação e selecione o primer antes da execução.
   2. Em seguida, defina cada concentração de PD-L1 como uma posição de poço de amostra separada em um layout de rack de reagentes 2: R2 B1: PD-L1 0 μM; R2 B2: PD-L1 0,037 μM; R2 B3: PD-L1 0,111 μM; R2 B4: PD-L1 0,333 μM; R2 A1: Glicina 2.0 como tampão de regeneração; R2 A2: HBS-EP+ como buffer de inicialização.
2. Prepare 200 mL de solução tampão de corrida 1× HBS-EP+. Prepare as concentrações de PD-L1: dilua a proteína PD-L1 a 9,42 μM a 0,333 μM, 0,111 μM e 0,037 μM em HBS-EP+. Em seguida, colocar todos os reagentes relevantes no esquema descrito no passo 4.1.2.
   1. Insira o tubo A na solução de buffer de execução HBS-EP+ de 1×, ejete o chip do sensor de manutenção e insira o chip SA. Reabra o método de reconhecimento de regeneração , siga o posicionamento do tubo da etapa 4.1, insira o rack de reagentes 2 e execute o método pela duração estimada.
3. Repita a etapa 1.6.

5. Ensaio de bloqueio PD-1 / PD-L1 com inibidor de molécula pequena: BMS-1166

NOTA: Para o ensaio de bloqueio, um relatório publicado anteriormente¹⁸ foi seguido com pequenos ajustes.

1. Use os mesmos parâmetros do relatório publicado em Configurações gerais, Etapas do ensaio e Tipos de ciclo, defina o tempo de contato para 60 s, o tempo de dissociação para 60 s e a taxa de fluxo para 30 μL/min. Em variáveis de método, variáveis de avaliação e comandos também usam a mesma configuração, exceto para usar Glicina 2.0 como Regeneração, taxa de fluxo de configuração para 30 μL/min, passa pelo caminho de fluxo de 1, 2, 3, 4.
   1. Em seguida, configure run e escolha o caminho do fluxo: 2-1, 4-3. Insira a solução da amostra: PD-L1 (0,111 μM, peso molecular de 51.300 Da) com BMS-1166 a 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM, 3,125 μM. Verifique todas as etapas do ensaio para verificação e selecione o primer antes da execução.
   2. Em seguida, defina cada concentração de PD-L1 como uma posição de poço de amostra separada em um layout de rack de reagentes 2: R2 B1: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0 μM R2 B2: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,125 μM; R2 B3: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,625 μM; R2 B4: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 3,125 μM; R2 A1: Glicina 2.0 para regeneração.
2. Prepare 200 mL de solução tampão de corrida 1× HBS-EP+. Prepare a mistura BMS-1166 / PD-L1: Dissolva 5 mg de BMS-1166 em 77,99 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar uma solução estoque de 100 mM. Dilua a solução estoque com proteína PD-L1 (0,11 μM) até as concentrações alvo de BMS-1166 a 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM e 3,125 μM em HBS-EP+. Colocar todos os reagentes relevantes dispostos conforme descrito no passo 5.1.2.
   1. Coloque o tubo A na solução tampão de execução HBS-EP+ de 1×, ejete o chip do sensor de manutenção e insira o chip SA. Reabra o método de reconhecimento de regeneração , siga a posição do tubo de 5.1 e, insira o rack de reagentes 2 e execute o método para o tempo de execução estimado.
3. Repita a etapa 1.6.

Imobilização de SA no chip CM5
Os dados foram analisados por meio da saída do instrumento SPR e do software de análise associado, indicando o alcance bem-sucedido da RU alvo (2000 RU) da proteína SA na célula de fluxo 1 e na célula de fluxo 2. As células de fluxo 1 e 2 foram imobilizadas com SA (40 μg/mL) na superfície do chip CM5 com uma resposta final de 1902,3 RU na célula de fluxo 1 (Figura 1A) e 1900,7 RU na célu...

Nas últimas décadas, várias abordagens de imunoterapia - incluindo vacinas contra o câncer, inibidores de checkpoint imunológico e terapias com células T CAR - avançaram significativamente no tratamento do câncer²¹. Os pontos de verificação imunológicos desempenham um papel crucial na prevenção de danos colaterais mediados por células imunes durante as respostas patogênicas e na supressão da autoimunidade. Um exemplo importante é a interação ent...

Os autores não têm nada a divulgar.

Os autores reconhecem a instalação central do RI-INBRE na Universidade de Rhode Island, apoiada por Grant P20GM103430 do Centro Nacional de Recursos de Pesquisa (NCRR), um componente dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). Esta pesquisa foi apoiada por um Prêmio Piloto da Faculdade de Farmácia da Universidade de Rhode Island, um Prêmio Pequeno Prêmio do Rhode Island Life Science Hub (RILSH) e uma bolsa da Fundação Rhode Island, todos concedidos a Chang Liu, Ph.D.