表面プラズモン共鳴技術によるPD-1/PD-L1阻害剤の同定

このプロトコルは、表面プラズモン共鳴技術を使用したPD-1/PD-L1阻害剤の遮断アッセイを説明しています。デュアルステップの固定化戦略とカスタマイズされたバッファーシステムを採用して、レスポンスユニットを正確に測定し、化合物や生物製剤の封鎖率の評価を容易にします。さらに、PD-1/PD-L1阻害剤のハイスループット同定をサポートします。

PD-1/PD-L1相互作用の破壊は、がん免疫療法の有望な戦略です。PD-1/PD-L1阻害剤の有効性を評価するためには、信頼性の高いスクリーニングプラットフォームが不可欠です。表面プラズモン共鳴(SPR)技術を利用した以前に確立されたヒトPD-1/PD-L1阻害アッセイ(第1世代PD-1/PD-L1阻害剤SPRスクリーニングプラットフォーム)は、均質時間分解蛍光(HTRF)および細胞ベースのアッセイで得られたものと同等の結果を示し、大規模なスクリーニングの可能性を秘めています。ここでは、このアッセイの最適化バージョン(第2世代PD-1/PD-L1阻害剤SPRスクリーニングプラットフォーム)を提示し、アミンとバイオストレプトアビジンカップリングを組み合わせてチップ上のPD-1配向制御を強化し、PD-1タンパク質消費を削減するデュアルステップカップリングプロセスを特徴としています。更新されたプラットフォームは、PD-1/PD-L1阻害剤BMS-1166を使用して検証に成功し、以前のSPRベースの方法やELISAなどの他の確立された技術に匹敵する阻害効果を示しました。これらの結果は、アプローチの信頼性を裏付けています。この最適化されたSPRスクリーニングプラットフォームは、新規のPD-1/PD-L1阻害剤を同定し、がん免疫療法研究を前進させ、免疫チェックポイント阻害剤スクリーニングにおけるSPRの可能性を強調するためのハイスループットで信頼性の高いツールを提供します。

免疫チェックポイント阻害療法、特にプログラム細胞死-1(PD-1)およびプログラム細胞死リガンド1(PD-L1)を標的とする治療法は、がん免疫療法戦略の最前線に立っています。抗PD-1/PD-L1療法は、血液がん、皮膚がん、肺がん、肝臓がん、膀胱がん、腎がんなど、さまざまな種類のがんに対する使用が承認されています¹。PD-1は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通型糖タンパク質であり、N末端に単一の免疫グロブリン変数(IgV)様ドメイン、IgVドメインを原形質膜から分離する約20アミノ酸の茎、膜貫通ドメイン、およびチロシンベースのシグナル伝達モチーフを含む細胞質尾部^{を特徴とする2。}PD-L1は、PD-1のリガンドの1つとして同定され、膜貫通領域、2つの細胞外ドメイン(免疫グロブリン定数(IgC)とIgV)、および細胞内シグナル伝達経路を誘発する比較的短い細胞質ドメインを特徴とするI型膜貫通タンパク質^です3。PD-1/PD-L1阻害経路は、T細胞の活性化と自己免疫を調節する重要な免疫チェックポイントとして機能します⁴。PD-1はT細胞上に発現し、PD-L1と相互作用し、T細胞受容体シグナル伝達を阻害し、抗原提示細胞およびT細胞上のCD28およびCD80分子の刺激を阻害します⁵。がん組織は、脱出期にPD-L1を過剰発現させることでこの生理学的メカニズムを利用し、腫瘍の成長と進行を促進する免疫抑制環境を作り出します⁶。PD-1およびPD-L1の阻害剤は、この相互作用を阻害し、免疫系が腫瘍誘発性の抑制を回避し、T細胞を介した腫瘍細胞死プロセスを再開することを可能にします⁷。

免疫チェックポイント阻害療法の顕著な役割によって築かれた基盤の上に、PD-1/PD-L1阻害剤の開発は、がん免疫療法の大きな進歩をマークしました。米国食品医薬品局(FDA)は、PD-1/PD-L1経路を特異的に標的とする9つの免疫チェックポイント阻害剤を承認しました。これらには、6つのPD-1阻害剤-ペムブロリズマブ、ドスタリマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、オリパリマブ、およびチスレリズマブ-、および3つのPD-L1阻害剤-アテゾリズマブ、アベルマブ、およびデュルバルマブ^{が含まれます8,9}。これらの治療法は、黒色腫、肺がん、尿路上皮がん、子宮頸がん、胃がんまたは胃食道がん、その他の固形腫瘍など、さまざまながんの治療に効果的に利用されてきました¹⁰。その有効性にもかかわらず、モノクローナル抗体ベースの治療は、低奏効率、高コスト、長期半減期、重度の免疫関連有害事象、静脈内または皮下送達の制限など、重大な制限に直面しています11,12,13。その結果、PD-1/PD-L1軸を標的とする低分子阻害剤の開発に研究がますます注力されています。これらの低分子は、細胞浸透の改善、多様な生物学的標的の調節、経口バイオアベイラビリティの向上、コストの削減などの明確な利点を提供し、副作用の少ない同等の治療結果を達成することを目標としています¹⁴。しかし、PD-1/PD-L1相互作用を標的とする低分子阻害剤の開発は、主に信頼性の高いハイスループットスクリーニングプラットフォームがないため、初期段階にあります。このようなプラットフォームは、低分子の膨大なライブラリーを迅速に評価し、さらなる検証と最適化のためにリード化合物を同定するために不可欠です。この課題を克服することは、がん免疫療法を進歩させるために重要です。

表面プラズモン共鳴(SPR)技術は、抗体抗原、酵素、核酸、薬物などのさまざまな生体分子の検出に広く採用されており、特に低分子薬物スクリーニングに効果的です^15,16。他の生物物理学的手法とは異なり、SPRはラベルフリーの検出、リアルタイムのカイネティックデータ、および幅広い検出範囲を提供します。対照的に、等温滴定型カロリメトリーは、リアルタイムの速度論的洞察を欠いており、より多くのサンプル量を必要とするため、スループットが制限されます。マイクロスケールの熱泳動はバッファー干渉を受けやすく、速度論的データを提供できませんが、バイオレイヤー干渉法は分子サイズと特性に基づくアプリケーション固有の制限があります。均質な時間分解蛍光は、標識が必要であり、蛍光干渉の影響を受けやすいです。HTRFは、PD-1/PD-L1阻害剤を探索するのに適した別の技術であると認識しています。HTRFの固有の制限の1つは、SPRと比較して、分子内励起プロセス(電子移動、FRETおよび漂白など)との外部相互作用によって引き起こされる蛍光消光であり、ウィンドウ範囲が狭いため、薬物スクリーニングプロセスにおける感度が低すぎること、および蛍光ライブラリー化合物または生物学的タンパク質からの干渉¹⁷.これらの特徴により、SPRは創薬のための優れたツールとして位置付けられています。私たちの以前の研究では、SPRがPD-1 / PD-L1に対する低分子のブロック効果を決定できることが実証されており、これは、創薬プロセスで高い標識技術要件、複数のステップ、低い特異性、および高いコストを必要とする他の技術よりも有利です¹⁸。

この研究では、最適化されたSPRベースのプラットフォームを導入し、アミンカップリングとバイオストレプトアビジンカップリングの両方を利用するデュアルステップカップリングプロセスを統合して、チップ上のPD-1の配向を強化し、タンパク質の使用量を最小限に抑えます。この更新されたアプローチは、PD-1/PD-L1阻害剤BMS-1166をポジティブコントロールバインダーとして使用して検証に成功し、以前のSPR法とELISA^19,20などの他の確立された技術の両方に匹敵する遮断効果が実証されました。これは、当社のプロトコールの信頼性と再現性を確認するだけでなく、PD-1/PD-L1阻害剤のハイスループットスクリーニングを容易にするための改良プラットフォームの有効性を示しています。バイオストレプトアビジン捕捉ステップを組み込むことで、ランダムなタンパク質配向ではなく部位指向性が得られるため、PD-1濃度の低下(40 μg/mL 対 10 μg/mL)が可能になり、エンドユーザーはストレプトアビジン(SA)をCM5チップに固定化することができ、商品化された固定化済みSAチップに代わる安価な代替品となるため、コストを節約できます。これにより、化合物/ペプチドライブラリーの大規模で費用対効果の高いスクリーニングに有利になります。がんに対するPD-1/PD-L1阻害剤の臨床的可能性を評価するには、in silico、in vitro、in vivoアッセイなどの追加の特性評価法が不可欠ですが、当社の強化されたSPRベースのスクリーニングプラットフォームは、PD-1/PD-L1阻害剤の大規模なスクリーニングのための効率的なツールとして際立っています。

試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. CM5チップ上のストレプトアビジン(SA)タンパク質の固定化

1. SPR装置で固定化方法を設定します: オープン/新規ウィザード テンプレート、 固定化を選択し、チップタイプを CM5に設定し、サイクルあたりのフローセル数を 1に設定します。 immobilize flow cell 1 と flow cell 2 にチェックを入れます。
   1. 固定化方法として Amine を設定します。固定化レベル、リガンド濃度: 40 μg/mL ストレプトアビジン、目標レベル: 2000 RU、洗浄液: 50 mM NaOHの目標を設定します。次に、実行する前にプライムを確認します。
2. 次のチューブを準備します:R2 B1およびR2 C1 - 40μg/ mLストレプトアビジン;R2 B2およびR2 C2:50 mMのNaOH;R2 B3 および R2 C3: EDC;R2 B4 および R2 C4: NHS;R2 B5 および R2 C5: 空。R2 B6およびR2 C6:エタノールアミン。
   注:EDCとNHSはCM5チップ上のカルボキシル基を活性化し、リガンド上のアミンと共有結合を可能にします。エタノールアミンは、固定化中の非特異的結合を防ぐためのブロッキングバッファーとして使用されます。
3. 20 mLのHBS-EP+バッファーを180 mLの脱イオン(DI)水で10×希釈し、200 mLの1× HBS-EP+ランニングバッファー溶液を調製します。
4. 1 mLのDNaseフリー水1 mgにストレプトアビジンを加え、室温で30分間インキュベートします。次に、ストレプトアビジン溶液を酢酸緩衝液(pH 4.5)で40 μg/mLに希釈します。製造元の指示に従ってAmine Coupling試薬キットの試薬を調製し、ステップ1.2に示されているように、関連するすべての試薬のレイアウトを配置します。
5. メンテナンスセンサーチップをCM5チップに交換し、用意した1× HBS-EP+バッファーにチューブAを入れ、固定化方法を再度開き、手順1.2のレイアウトに従ってチューブを挿入します。メソッド を実行し 、結果ファイルを保存します。
6. 運転後のメンテナンス:CM5チップをメンテナンスセンサーチップに交換し、脱イオン水で満たされたボトルにチューブAを入れ、プライムを実行します。CM5チップを取り出した後、チップを数滴のDI水で洗い、自然乾燥させます。チップを4°Cの50 mLチューブに入れます。
   注意: 固定化されたSAにより、CM5チップはSAチップとして機能します。

2. PD-1タンパク質のSAチップへの固定化

1. SPR装置で固定化方法を設定します: オープン/新規ウィザード テンプレート、 固定化を選択し、チップタイプを SAに設定し、サイクルあたりのフローセル数を 1に設定します。 immobilize flow cell 1 と cell 2 にチェックを入れます。
   1. 方法としてSA-ビオチン捕捉を設定します。セル 1 セットのブランク固定化の場合、セル 2 セットの固定化レベル、リガンドとして 10 μg/mL PD-1、目標レベル:4000 RU を目指し、実行前にプライムを確認してください。
      注:次のチューブを準備します-R2 B1およびR2 C1:1 MのNaCl、50 mMのNaOH;R2 B2およびR2 C2:50%イソプロパノール/50 mMのNaOH/1 MのNaCl;R2 C3:10 μg/mL PD-1。
2. 58.44 mgのNaClを1 mLの50 mM NaOHに溶解し、1 MのNaClおよび50 mMのNaOH溶液を調製します。58.44 mgのNaClと4.0 mgのNaOHを500 μLの水に溶解し、500 μLのイソプロパノールを加えて50%イソプロパノール/50 mM NaOH/1 M NaCl溶液を調製します。
3. PD-1溶液を調製する:200 μLのDNaseフリー水1を100 μgのビオチン化ヒトPD-1(FcおよびAvitagged)に加え、室温で30分間安定させた後、酢酸緩衝液(pH 5.0)で10 μg/mLに希釈します。
4. ステップ2.1で説明したように、すべての試薬レイアウトを配置します。1× HBS-EP+ランニングバッファー溶液にチューブAを入れ、メンテナンスセンサーチップを取り出してSAチップ(ステップ1のストレプトアビジンタンパク質でコーティングしたCM5チップ)を挿入します。固定化法を再度開き、試薬ラック2を挿入して位置を確認し、推定実行時間で方法を実行します。
5. 手順1.6を繰り返します。

3. PD-1、PD-L1の再生スカウティング

1. 再生スカウティング方法の設定: ウィザードテンプレートを開く/新規 、 再生スカウティングを選択し、流路を 2-1、4-3、チップタイプを SAに設定し、ランコンディショニングサイクルを確認し、溶液をHBS-EP+として記録し、接触時間を 30秒、注入回数を 3回、溶液を PD-L1として、接触時間: 30秒、流量: 30μL / min。
   1. 再生パラメータの場合、流速は30μL/min、安定化期間は300秒です。実験計画では、条件の数を4に設定し、各条件のサイクル数を2に設定します。条件を4、再生溶液:グリシン1.5、2.0、2.5、3.0、接触時間:30秒に設定し、実行する前にプライムを確認してください。
2. 各 PD-L1 濃度を 96 ウェルマイクロプレートレイアウトで個別のサンプルウェル位置として設定します: R1 A1 から R1 A9: 1 μM PD-L1;R1 A10 から R1 A12: HBS-EP+ バッファー;R1 B1:グリシン1.5;R1 B2:グリシン2;R1 B3:グリシン2.5;R1 B4:グリシン3。
   注:再生緩衝液として、pHの異なるグリシン緩衝液を使用します。
3. PD-L1溶液を調製する:100 μgのHuman PD-L1 Fcタグタンパク質(9.42 μM)に200 μLのDNaseフリー水を加え、HBS-EP+バッファーで1 μMに希釈します。
4. ステップ3.2で説明したように、関連するすべての試薬をレイアウトに配置します。チューブAを1×HBS-EP+バッファーに入れ、メンテナンスセンサーチップをSAチップに交換します。 Regeneration Scouting メソッドを再度開き、ステップ3.2のチューブ位置に従い、試薬ラックを挿入してから、推定実行時間でメソッド を実行します 。
5. 手順1.6を繰り返します。

4. PD-1/PD-L1相互作用の検証

注:検証のために、以前に公開されたレポート¹⁸ に続いて、若干の調整が加えられました。

1. [General Settings]、[Assay Steps]、および[Cycle Types]で公開されたレポートと同じパラメーターを使用し、接触時間を60秒、解離時間を60秒、流量を30μL/minに設定します。メソッド変数、評価変数、コマンドでは、Glycine 2.0をRegenerationとして使用する以外は、同じ設定を使用します。ただし、セットアップ流量は30μL/minで、1、2、3、4の流路を経由します。
   1. 次に、 runを設定し、流路( 2-1、4-3)を選択します。0 μM、0.037 μM、0.111 μM、0.333 μM、分子量51,300 Daの濃度でPD-L1をインプットします。すべてのアッセイステップで検証を行い、実行前にプライムを選択します。
   2. 次に、各 PD-L1 濃度を Reagent Rack 2 レイアウトの個別のサンプルウェル位置として設定します: R2 B1: PD-L1 0 μM;R2 B2: PD-L1 0.037 μM;R2 B3: PD-L1 0.111 μM;R2 B4: PD-L1 0.333 μM;R2 A1:再生バッファーとしてのグリシン2.0。R2 A2:起動バッファとしてHBS-EP +。
2. 1× HBS-EP+ランニングバッファー溶液200 mLを調製します。PD-L1濃度を調製する:HBS-EP+でPD-L1タンパク質を9.42 μMから0.333 μM、0.111 μM、および0.037 μMで希釈します。次に、ステップ4.1.2で説明したように、関連するすべての試薬をレイアウトに配置します。
   1. チューブAを1×HBS-EP+ランニングバッファー溶液に挿入し、メンテナンスセンサーチップを排出し、SAチップを挿入します。 再生スカウティング 法を再度開き、ステップ4.1のチューブの位置決めに従い、試薬ラック2を挿入し、推定時間だけメソッド を実行します 。
3. 手順1.6を繰り返します。

5. 低分子阻害剤を用いたPD-1/PD-L1阻害法:BMS-1166

注:封鎖アッセイについては、以前に発表されたレポート¹⁸ にわずかな調整を加えて追跡しました。

1. [General Settings]、[Assay Steps]、および[Cycle Types]で公開されたレポートと同じパラメーターを使用し、接触時間を60秒、解離時間を60秒、流量を30μL/minに設定します。メソッド変数、評価変数、コマンドも同じ設定を使用しますが、Glycine 2.0をRegenerationとして使用する以外は、30μL/minへの設定流量は、1、2、3、4の流路を経由します。
   1. 次に、runを設定し、フローパス( 2-1、4-3)を選択します。サンプル溶液:PD-L1(0.111 μM、分子量51,300 Da)とBMS-1166を0 μM、0.125 μM、0.625 μM、3.125 μMで入力します。
   2. 次に、各 PD-L1 濃度を Reagent Rack 2 レイアウトの個別のサンプルウェル位置として設定します: R2 B1: PD-L1 (0.111 μM) + BMS-1166 0 μM R2 B2: PD-L1 (0.111 μM) + BMS-1166 0.125 μM;R2 B3: PD-L1 (0.111 μM) + BMS-1166 0.625 μM;R2 B4: PD-L1 (0.111 μM) + BMS-1166 3.125 μM;R2 A1:再生のためのグリシン2.0。
2. 1× HBS-EP+ランニングバッファー溶液200 mLを調製します。BMS-1166/PD-L1混合物の調製:5 mgのBMS-1166を77.99 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解して、100 mMのストック溶液を調製します。ストック溶液をPD-L1タンパク質(0.11 μM)でBMS-1166の目標濃度まで0 μM、0.125 μM、0.625 μM、およびHBS-EP+で希釈します。ステップ5.1.2で説明されているように、関連するすべての試薬レイアウトを配置します。
   1. チューブAを1×HBS-EP+ランニングバッファー溶液に入れ、メンテナンスセンサーチップを排出してSAチップを挿入します。 再生スカウティング メソッドを再度開き、5.1からのチューブ位置をたどって、試薬ラック2を挿入し、推定実行時間でメソッド を実行します 。
3. 手順1.6を繰り返します。

CM5チップ上のSAの固定化
SPR装置および関連する解析ソフトウェアからの出力 により 、フローセル1およびフローセル2上のSAタンパク質の目標RU(2000RU)が成功裏に達成されたことを示しました。フローセル 1 および 2 は、CM5 チップ表面に SA(40 μg/mL)を添加して固定化し、最終レスポンスはフローセル 1 で 1902.3 RU(図 1A)、フロー...

過去数十年にわたり、がんワクチン、免疫チェックポイント阻害剤、CAR-T細胞療法など、さまざまな免疫療法のアプローチにより、がん治療は大幅に進歩しました²¹。免疫チェックポイントは、病原性応答中の免疫細胞による巻き添え被害の予防や自己免疫の抑制に重要な役割を果たします。その代表的な例が、PD-L1とPD-1の相互作用で、PD-L1は主要な...

著者は何も開示していません。

著者たちは、ロードアイランド大学のRI-INBRE中核施設が、国立衛生研究所(NIH)の一部門である全米研究資源センター(NCRR)のグラント・P20GM103430の支援を受けていることを認めている。この研究は、ロードアイランド大学薬学部のパイロット助成金賞、ロードアイランドライフサイエンスハブ(RILSH)のSmall Grant Award、ロードアイランド財団の助成金によって支援され、すべてChang Liu博士に授与されました。