Identificación de inhibidores de PD-1/PD-L1 con tecnología de resonancia de plasmón de superficie

Este protocolo describe un ensayo de bloqueo para inhibidores de PD-1/PD-L1 utilizando tecnología de resonancia de plasmón de superficie. Emplea una estrategia de inmovilización de dos pasos y un sistema de amortiguación personalizado para medir con precisión las unidades de respuesta, lo que facilita la evaluación de las tasas de bloqueo de compuestos o productos biológicos. Además, admite la identificación de alto rendimiento de inhibidores de PD-1/PD-L1.

La interrupción de la interacción PD-1/PD-L1 es una estrategia prometedora para la inmunoterapia contra el cáncer. Es esencial contar con plataformas de cribado fiables para evaluar la eficacia de los inhibidores de PD-1/PD-L1. Un ensayo de bloqueo de PD-1/PD-L1 humano previamente establecido que utiliza la tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) (plataforma de cribado SPR de inhibidor de PD-1/PD-L1 de primera generación) demostró resultados comparables a los obtenidos mediante fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) y ensayos basados en células, con potencial para el cribado a gran escala. En este trabajo, se presenta una versión optimizada de este ensayo (plataforma de cribado SPR de inhibidor de PD-1/PD-L1 de segunda generación), que presenta un proceso de acoplamiento de dos pasos que combina el acoplamiento de aminas y bioestreptavidina para mejorar el control de la orientación de PD-1 en el chip y reducir el consumo de proteínas PD-1. La plataforma actualizada se validó con éxito utilizando el inhibidor de PD-1/PD-L1 BMS-1166, mostrando efectos de bloqueo comparables al método anterior basado en SPR y otras técnicas establecidas como ELISA. Estos resultados confirman la fiabilidad del enfoque. Esta plataforma optimizada de cribado de SPR ofrece una herramienta fiable y de alto rendimiento para identificar nuevos inhibidores de PD-1/PD-L1, avanzar en la investigación de la inmunoterapia contra el cáncer y destacar el potencial de la SPR en el cribado de inhibidores de puntos de control inmunitario.

Las terapias de bloqueo de puntos de control inmunitario, en particular las dirigidas a la muerte celular programada-1 (PD-1) y al ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1), se sitúan a la vanguardia de las estrategias de inmunoterapia contra el cáncer. Las terapias anti-PD-1/PD-L1 han recibido aprobación para su uso en varios tipos de cáncer, como el hematológico, el cutáneo, el pulmonar, el hepático, el de vejiga urinaria y el renal¹. PD-1 es una glicoproteína transmembrana perteneciente a la superfamilia de las inmunoglobulinas, caracterizada por un único dominio similar a la inmunoglobulina variable (IgV) en el N-terminal, un tallo de aproximadamente 20 aminoácidos que separa el dominio IgV de la membrana plasmática, un dominio transmembrana y una cola citoplasmática que contiene motivos de señalización basados en tirosina². PD-L1, identificada como uno de los ligandos de PD-1, es una proteína transmembrana de tipo I que presenta una región transmembrana, dos dominios extracelulares -constante de inmunoglobulina (IgC) e IgV- y un dominio citoplasmático relativamente corto que desencadena vías de señalización intracelular³. La vía inhibidora de PD-1/PD-L1 sirve como un punto de control inmunitario crítico que regula la activación de las células T y la autoinmunidad⁴. La PD-1 se expresa en las células T, donde interactúa con la PD-L1, inhibe la señalización del receptor de las células T y bloquea la estimulación de las moléculas CD28 y CD80 en las células presentadoras de antígenos y las células T⁵. Los tejidos cancerosos explotan este mecanismo fisiológico mediante la sobreexpresión de PD-L1 durante la fase de escape, creando así un entorno inmunosupresor que promueve el crecimiento y la progresión del tumor⁶. Los inhibidores de PD-1 y PD-L1 interrumpen esta interacción, lo que permite al sistema inmunitario evadir la supresión inducida por el tumor y reiniciar el proceso de muerte de las células tumorales mediado por las células^{T 7}.

Sobre la base establecida por el papel destacado de las terapias de bloqueo de puntos de control inmunitario, el desarrollo de inhibidores de PD-1/PD-L1 ha marcado un avance significativo en la inmunoterapia contra el cáncer. La Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA, por sus siglas en inglés) ha respaldado nueve inhibidores de puntos de control inmunitario que se dirigen específicamente a la vía PD-1/PD-L1. Estos incluyen seis inhibidores de PD-1 (pembrolizumab, dostarlimab, nivolumab, cemiplimab, oripalimab y tislelizumab) y tres inhibidores de PD-L1 (atezolizumab, avelumab y durvalumab ^8,9). Estas^{terapias se} han utilizado eficazmente para tratar una variedad de cánceres, como el melanoma, el cáncer de pulmón, el cáncer urotelial, el cáncer de cuello uterino, el cáncer gástrico o gastroesofágico y otros tumores sólidos. A pesar de su eficacia, las terapias basadas en anticuerpos monoclonales enfrentan limitaciones significativas, incluyendo bajas tasas de respuesta, altos costos, vidas medias prolongadas, eventos adversos graves relacionados con el sistema inmunitario y restricciones a la administración intravenosa o subcutánea 11,12,13. En consecuencia, la investigación se centra cada vez más en el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos al eje PD-1/PD-L1. Estas pequeñas moléculas ofrecen ventajas distintivas, como una mejor penetración celular, modulación de diversas dianas biológicas, mayor biodisponibilidad oral y reducción de costos, con el objetivo de lograr resultados terapéuticos comparables con menos efectos adversos¹⁴. Sin embargo, el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a la interacción PD-1/PD-L1 se encuentra en sus primeras etapas, principalmente debido a la falta de una plataforma de cribado fiable de alto rendimiento. Estas plataformas son esenciales para evaluar rápidamente vastas bibliotecas de moléculas pequeñas e identificar compuestos principales para su posterior validación y optimización. Superar este desafío es fundamental para avanzar en la inmunoterapia contra el cáncer.

La tecnología de resonancia de plasmón de superficie (SPR) se emplea ampliamente en la detección de diversas biomoléculas, incluidos antígenos de anticuerpos, enzimas, ácidos nucleicos y fármacos, y es particularmente eficaz en el cribado de fármacos de moléculas pequeñas^15,16. A diferencia de otras técnicas biofísicas, SPR ofrece detección sin etiquetas, datos cinéticos en tiempo real y un amplio rango de detección. Por el contrario, la calorimetría de valoración isotérmica carece de información cinética en tiempo real y requiere mayores volúmenes de muestra, lo que limita el rendimiento. La termoforesis a microescala es propensa a la interferencia del tampón y no puede proporcionar datos cinéticos, mientras que la interferometría de biocapa tiene limitaciones específicas de la aplicación basadas en el tamaño y las propiedades moleculares. La fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo requiere etiquetado y es susceptible a la interferencia fluorescente. Reconocemos que HTRF es otra tecnología adecuada para explorar los inhibidores de PD-1/PD-L1. Una limitación inherente de HTRF, en comparación con SPR, es la extinción de la fluorescencia causada por interacciones externas con el proceso de excitación intramolecular (por ejemplo, transferencia de electrones, FRET y blanqueo), la sensibilidad es demasiado baja en el proceso de selección de fármacos debido al pequeño rango de ventana y la interferencia de compuestos de biblioteca fluorescentes o proteínas biológicas¹⁷. Estas características posicionan a SPR como una herramienta superior para el descubrimiento de fármacos. Nuestros estudios previos han demostrado que SPR es capaz de determinar el efecto de bloqueo de moléculas pequeñas frente a PD-1/PD-L1, lo que es ventajoso sobre otras técnicas que requieren altos requisitos de tecnología de etiquetado, múltiples pasos, poca especificidad y alto costo en el proceso de descubrimiento de fármacos¹⁸.

Este estudio presenta una plataforma optimizada basada en SPR, que integra un proceso de acoplamiento de dos pasos que utiliza el acoplamiento de aminas y bioestreptavidina para mejorar la orientación de PD-1 en el chip y minimizar el uso de proteínas. Este enfoque actualizado se validó con éxito utilizando el inhibidor de PD-1/PD-L1 BMS-1166 como aglutinante de control positivo, demostrando efectos de bloqueo comparables tanto a nuestro método SPR anterior como a otras técnicas establecidas como ELISA^19,20. Esto no solo confirma la fiabilidad y reproducibilidad de nuestro protocolo, sino que también ilustra la eficacia de nuestra plataforma modificada para facilitar el cribado de alto rendimiento de inhibidores de PD-1/PD-L1. La incorporación de la etapa de captura de bioestreptavidina proporciona una orientación de la proteína dirigida al sitio en lugar de aleatoria, lo que permite una concentración reducida de PD-1 (40 μg/mL frente a 10 μg/mL) y un ahorro de costos al permitir al usuario final inmovilizar la estreptavidina (SA) en un chip CM5, una alternativa menos costosa a los chips SA preinmovilizados comercializados. Esto lo hace ventajoso para el cribado a gran escala y rentable de bibliotecas de compuestos/péptidos. Aunque los métodos de caracterización adicionales, incluidos los ensayos in silico, in vitro e in vivo, son esenciales para evaluar el potencial clínico de los inhibidores de PD-1/PD-L1 contra el cáncer, nuestra plataforma de cribado mejorada basada en SPR se destaca como una herramienta eficaz para el cribado a gran escala de inhibidores de PD-1/PD-L1.

Los reactivos y equipos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Inmovilización de la proteína estreptavidina (SA) en el chip CM5

1. Configure el método de inmovilización en el instrumento SPR: Abrir / nueva plantilla de asistente, elegir inmovilización, establecer el tipo de chip en CM5 y las celdas de flujo por ciclo en 1. Verifique la inmovilización de la celda de flujo 1 y la celda de flujo 2.
   1. Establezca Amina como método de inmovilización. Establecer el objetivo para el nivel de inmovilización, concentración de ligando: 40 μg/mL de estreptavidina, nivel objetivo: 2000 RU, solución de lavado: 50 mM de NaOH. A continuación, compruebe el cebado antes de ejecutar.
2. Prepare los siguientes tubos: R2 B1 y R2 C1 - 40 μg/mL de estreptavidina; R2 B2 y R2 C2: 50 mM de NaOH; R2 B3 y R2 C3: EDC; R2 B4 y R2 C4: Servicio Nacional de Salud; R2 B5 y R2 C5: vacíos; R2 B6 y R2 C6: etanolamina.
   NOTA: EDC y NHS activan los grupos carboxilo en el chip CM5, lo que permite el acoplamiento covalente con aminas en el ligando. La etanolamina se utiliza como tampón de bloqueo para evitar la unión inespecífica durante la inmovilización.
3. Diluya 20 mL de tampón HBS-EP+ 10× en 180 mL de agua desionizada (DI) para preparar 200 mL de solución tampón HBS-EP+ 1× en funcionamiento.
4. Añadir 1 mL de agua libre de DNasa a 1 mg de estreptavidina e incubar a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, diluir la solución de estreptavidina a 40 μg/mL en tampón de acetato (pH 4,5). Prepare los reactivos del kit de reactivos de acoplamiento de aminas de acuerdo con las instrucciones del fabricante y coloque todos los diseños de reactivos relevantes como se indica en el paso 1.2.
5. Reemplace el chip del sensor de mantenimiento con el chip CM5, luego coloque el tubo A en el tampón HBS-EP+ 1× preparado, vuelva a abrir el método de inmovilización e inserte los tubos de acuerdo con el diseño del paso 1.2. Ejecute el método y guarde el archivo de resultados.
6. Mantenimiento posterior a la ejecución: reemplace el chip CM5 con el chip sensor de mantenimiento, coloque el tubo A en una botella llena de agua desionizada y ejecute el cebador. Después de sacar el chip CM5, lave el chip con unas gotas de agua desionizada y séquelo al aire. Coloque el chip en un tubo de 50 ml a 4 °C.
   NOTA: El SA inmovilizado permite que el chip CM5 funcione como un chip SA.

2. Inmovilización de la proteína PD-1 en el chip SA

1. Establezca el método de inmovilización en el instrumento SPR: Abrir / nuevo plantilla de asistente, elegir inmovilización, establecer el tipo de chip en SA y las celdas de flujo por ciclo en 1. Verifique la inmovilización de la celda de flujo 1 y la celda 2.
   1. Establezca la captura de biotina SA como método. Para la celda 1 establezca la inmovilización en blanco, para la celda 2 establezca el objetivo de un nivel inmovilizado, 10 μg / mL PD-1 como ligando, nivel objetivo: 4000 RU, luego verifique el cebado antes de ejecutar.
      NOTA: Prepare los siguientes tubos: R2 B1 y R2 C1: 1 M de NaCl, 50 mM de NaOH; R2 B2 y R2 C2: 50% de isopropanol/50 mM de NaOH/1 m de NaCl; R2 C3: 10 μg/mL PD-1.
2. Disuelva 58,44 mg de NaCl en 1 mL de 50 mM de NaOH para preparar 1 M de NaCl y 50 mM de solución de NaOH. Disuelva 58,44 mg de NaCl y 4,0 mg de NaOH en 500 μL de agua, luego agregue 500 μL de isopropanol para preparar la solución de 50% de Isopropanol/50 mM de NaOH/1 M de NaCl.
3. Prepare la solución de PD-1: Agregue 200 μL de agua libre de DNasa a 100 μg de PD-1 humano biotinilado (Fc y Avitagged) y estabilice a temperatura ambiente durante 30 min, luego diluya a 10 μg/mL en tampón de acetato (pH 5.0).
4. Coloque todos los diseños de reactivos como se describe en el paso 2.1. Coloque el tubo A en la solución tampón de funcionamiento HBS-EP+ 1×, luego expulse el chip del sensor de mantenimiento e inserte el chip SA (chip CM5 recubierto por la proteína estreptavidina del paso 1). Vuelva a abrir el método de inmovilización, inserte el bastidor de reactivos 2 y compruebe las posiciones, luego ejecute el método para el tiempo de ejecución estimado.
5. Repita el paso 1.6.

3. Exploración de regeneración para PD-1 y PD-L1

1. Configure el método de exploración de regeneración: Abrir / nueva plantilla de asistente, elegir Exploración de regeneración, establecer la ruta de flujo: 2-1, 4-3, tipo de chip a SA, verificar el ciclo de acondicionamiento de ejecución, registrar la solución como HBS-EP+, tiempo de contacto como 30 s, número de inyecciones como 3, solución como PD-L1, tiempo de contacto: 30 s, caudal: 30 μL/min.
   1. Para los parámetros de regeneración, el caudal es de 30 μL/min y el período de estabilización es de 300 s. En el diseño experimental, establezca el número de condiciones como 4 y el número de ciclos para cada condición como 2. Establezca las condiciones como 4, solución de regeneración: glicina 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, tiempos de contacto: 30 s, luego verifique el cebado antes de ejecutar.
2. Establezca cada concentración de PD-L1 como una posición de pocillo de muestra separada en un diseño de microplaca de 96 pocillos: R1 A1 a R1 A9: 1 μM PD-L1; R1 A10 a R1 A12: tampón HBS-EP+; R1 B1: Glicina 1,5; R1 B2: Glicina 2; R1 B3: glicina 2.5; R1 B4: Glicina 3.
   NOTA: El tampón de glicina con diferente pH se utiliza como tampón de regeneración.
3. Preparación de la solución de PD-L1: Añadir 200 μL de agua libre de DNasa a 100 μg de proteína Fc Tag PD-L1 humana (9,42 μM), luego diluir a 1 μM en tampón HBS-EP+.
4. Coloque todos los reactivos relevantes en el diseño como se describe en el paso 3.2. Coloque el tubo A en el tampón HBS-EP+ 1× y, a continuación, sustituya el chip del sensor de mantenimiento por el chip SA. Vuelva a abrir el método de exploración de regeneración , siga la posición del tubo del paso 3.2, inserte la gradilla de reactivos y, a continuación, ejecute el método durante el tiempo de ejecución estimado.
5. Repita el paso 1.6.

4. Validación de la interacción PD-1/PD-L1

NOTA: Para la validación, se siguió un informe¹⁸ publicado anteriormente con ajustes menores.

1. Utilice los mismos parámetros que el informe publicado en Configuración general, Pasos de ensayo y Tipos de ciclo, establezca el tiempo de contacto en 60 s, el tiempo de disociación en 60 s y el caudal en 30 μL/min. En las variables de método, las variables de evaluación y los comandos, use la misma configuración, excepto para usar Glycine 2.0 como regeneración, configure el caudal a 30 μL / min, pasa por la ruta de flujo de 1, 2, 3, 4.
   1. A continuación, configure la ejecución y elija la ruta de flujo: 2-1, 4-3. Entrada PD-L1 con concentraciones de 0 μM, 0,037 μM, 0,111 μM, 0,333 μM y un peso molecular de 51.300 Da. Compruebe todos los pasos del ensayo para la verificación y seleccione el cebado antes de la ejecución.
   2. A continuación, establezca cada concentración de PD-L1 como una posición de pocillo de muestra separada en un diseño de gradilla de reactivos 2: R2 B1: PD-L1 0 μM; R2 B2: PD-L1 0,037 μM; R2 B3: PD-L1 0,111 μM; R2 B4: PD-L1 0,333 μM; R2 A1: Glicina 2.0 como tampón de regeneración; R2 A2: HBS-EP+ como búfer de inicio.
2. Prepare 200 ml de solución tampón de funcionamiento HBS-EP+ al 1×. Preparar concentraciones de PD-L1: diluir la proteína PD-L1 a 9,42 μM a 0,333 μM, 0,111 μM y 0,037 μM en HBS-EP+. A continuación, coloque todos los reactivos relevantes en el diseño como se describe en el paso 4.1.2.
   1. Inserte el tubo A en la solución tampón de funcionamiento HBS-EP+ 1×, expulse el chip del sensor de mantenimiento e inserte el chip SA. Vuelva a abrir el método de exploración de regeneración , siga la posición del tubo del paso 4.1, inserte el bastidor de reactivos 2 y ejecute el método durante la duración estimada.
3. Repita el paso 1.6.

5. Ensayo de bloqueo de PD-1 / PD-L1 con inhibidor de molécula pequeña: BMS-1166

NOTA: Para el ensayo de bloqueo, se siguió un informe¹⁸ publicado anteriormente con ajustes menores.

1. Utilice los mismos parámetros que el informe publicado en Configuración general, Pasos de ensayo y Tipos de ciclo, establezca el tiempo de contacto en 60 s, el tiempo de disociación en 60 s y el caudal en 30 μL/min. En las variables de método, las variables de evaluación y los comandos también usan la misma configuración, excepto para usar Glycine 2.0 como regeneración, configura el caudal a 30 μL / min, pasa por la ruta de flujo de 1, 2, 3, 4.
   1. A continuación, configure la ejecución y elija la ruta de flujo: 2-1, 4-3. Introduzca la solución de muestra: PD-L1 (0,111 μM, peso molecular de 51.300 Da) con BMS-1166 a 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM, 3,125 μM. Compruebe todos los pasos del ensayo para la verificación y seleccione el cebado antes de la ejecución.
   2. A continuación, establezca cada concentración de PD-L1 como una posición de pocillo de muestra separada en un diseño de gradilla de reactivos 2: R2 B1: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0 μM R2 B2: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,125 μM; R2 B3: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 0,625 μM; R2 B4: PD-L1 (0,111 μM) + BMS-1166 3,125 μM; R2 A1: Glicina 2.0 para la regeneración.
2. Prepare 200 ml de solución tampón de funcionamiento HBS-EP+ al 1×. Preparación de la mezcla BMS-1166/PD-L1: Disuelva 5 mg de BMS-1166 en 77,99 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para preparar una solución madre de 100 mM. Diluir la solución madre con la proteína PD-L1 (0,11 μM) hasta las concentraciones objetivo de BMS-1166 a 0 μM, 0,125 μM, 0,625 μM y 3,125 μM en HBS-EP+. Coloque todos los reactivos relevantes como se describe en el paso 5.1.2.
   1. Coloque el tubo A en la solución tampón de funcionamiento HBS-EP+ 1×, luego expulse el chip del sensor de mantenimiento e inserte el chip SA. Vuelva a abrir el método de exploración de regeneración , siga la posición del tubo de 5.1 e inserte el bastidor de reactivos 2, luego ejecute el método durante el tiempo de ejecución estimado.
3. Repita el paso 1.6.

Inmovilización de SA en el chip CM5
Los datos se analizaron a través de los resultados del instrumento SPR y el software de análisis asociado, lo que indica el logro exitoso de la RU objetivo (2000 RU) de la proteína SA en la celda de flujo 1 y la celda de flujo 2. Las celdas de flujo 1 y 2 se inmovilizaron con SA (40 μg/mL) en la superficie del chip CM5 con una respuesta final de 1902.3 RU en la celda de flujo 1 (Figura 1A)...

En las últimas décadas, varios enfoques de inmunoterapia, incluidas las vacunas contra el cáncer, los inhibidores de puntos de control inmunitario y las terapias de células T con CAR, han avanzado significativamente en el tratamiento del cáncer²¹. Los puntos de control inmunitario desempeñan un papel crucial en la prevención del daño colateral mediado por las células inmunitarias durante las respuestas patógenas y en la supresión de la autoinmunidad. Un...

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores reconocen la instalación central de RI-INBRE en la Universidad de Rhode Island, respaldada por Grant P20GM103430 del Centro Nacional de Recursos de Investigación (NCRR), un componente de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Esta investigación fue apoyada por una Subvención Piloto de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Rhode Island, una Subvención Pequeña del Centro de Ciencias de la Vida de Rhode Island (RILSH) y una subvención de la Fundación de Rhode Island, todas otorgadas a Chang Liu, Ph.D.