使用表面等离子体共振技术鉴定 PD-1/PD-L1 抑制剂

该方案描述了使用表面等离子体共振技术的 PD-1/PD-L1 抑制剂的封闭测定。它采用双步固定策略和定制的缓冲系统来准确测量反应单位，有助于评估化合物或生物制剂的封闭率。此外，它还支持 PD-1/PD-L1 抑制剂的高通量鉴定。

破坏 PD-1/PD-L1 相互作用是癌症免疫治疗的一种有前途的策略。可靠的筛选平台对于评估 PD-1/PD-L1 抑制剂的疗效至关重要。先前建立的利用表面等离子体共振 （SPR） 技术（第一代 PD-1/PD-L1 抑制剂 SPR 筛选平台）的人 PD-1/PD-L1 阻断测定结果与通过均相时间分辨荧光 （HTRF） 和基于细胞的测定获得的结果相当，具有大规模筛选的潜力。在此，提出了该测定的优化版本（第二代 PD-1/PD-L1 抑制剂 SPR 筛选平台），具有结合胺和生物链霉亲和素偶联的双步偶联过程，以增强芯片上的 PD-1 方向控制并减少 PD-1 蛋白消耗。使用 PD-1/PD-L1 抑制剂 BMS-1166 成功验证了更新后的平台，显示出与之前基于 SPR 的方法和其他成熟技术（如 ELISA）相当的阻断效果。这些结果证实了该方法的可靠性。这种优化的 SPR 筛选平台为识别新型 PD-1/PD-L1 抑制剂、推进癌症免疫治疗研究以及突出 SPR 在免疫检查点抑制剂筛选中的潜力提供了高通量和可靠的工具。

免疫检查点阻断疗法，尤其是针对程序性细胞死亡 1 （PD-1） 和程序性细胞死亡配体 1 （PD-L1） 的疗法，处于癌症免疫治疗策略的最前沿。抗 PD-1/PD-L1 疗法已获准用于各种癌症类型，例如血液癌、皮肤癌、肺癌、肝癌、膀胱癌和肾癌¹。PD-1 是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，其特征是 N 末端有一个免疫球蛋白可变 （IgV） 样结构域、一个大约 20 个氨基酸的茎将 IgV 结构域与质膜分开、一个跨膜结构域和一个包含基于酪氨酸的信号转导基序的细胞质尾部²。PD-L1 被鉴定为 PD-1 的配体之一，是一种 I 型跨膜蛋白，具有一个跨膜区、两个胞外结构域（免疫球蛋白恒定因子 （IgC） 和 IgV）以及一个相对较短的细胞质结构域，可触发细胞内信号通路³。PD-1/PD-L1 抑制通路是调节 T 细胞活化和自身免疫的关键免疫检查点⁴。PD-1 在 T 细胞上表达，与 PD-L1 相互作用，抑制 T 细胞受体信号传导，并阻断抗原呈递细胞和 T 细胞上 CD28 和 CD80 分子的刺激⁵。癌组织通过在逃逸期过表达 PD-L1 来利用这种生理机制，从而产生促进肿瘤生长和进展的免疫抑制环境⁶。PD-1 和 PD-L1 抑制剂会破坏这种相互作用，使免疫系统能够逃避肿瘤诱导的抑制并重新启动 T 细胞介导的肿瘤细胞死亡过程⁷。

PD-1/PD-L1 抑制剂的开发建立在免疫检查点阻断疗法的突出作用所奠定的基础之上，标志着癌症免疫治疗的重大进步。美国食品药品监督管理局 （FDA） 已批准了 9 种专门靶向 PD-1/PD-L1 通路的免疫检查点抑制剂。其中包括 6 种 PD-1 抑制剂——帕博利珠单抗、dostarlimab、nivolumab、cemiplimab、oripalimab 和 tislelizumab——以及 3 种 PD-L1 抑制剂——atezolizumab、avelumab 和 durvalumab ^8,9。这些疗法已被有效用于治疗多种癌症，例如黑色素瘤、肺癌、尿路上皮癌、宫颈癌、胃癌或胃食管癌以及其他实体瘤¹⁰。尽管疗效良好，但基于单克隆抗体的疗法面临重大局限性，包括反应率低、成本高、半衰期延长、严重的免疫相关不良事件以及对静脉内或皮下给药的限制 11,12,13。因此，研究越来越集中在开发靶向 PD-1/PD-L1 轴的小分子抑制剂上。这些小分子具有明显的优势，例如提高细胞渗透率、调节多种生物靶标、提高口服生物利用度和降低成本，目标是获得相当的治疗结果和更少的不良反应¹⁴。然而，靶向 PD-1/PD-L1 相互作用的小分子抑制剂的开发处于早期阶段，主要是由于缺乏可靠的高通量筛选平台。此类平台对于快速评估大量小分子库和识别先导化合物以进行进一步验证和优化至关重要。克服这一挑战对于推进癌症免疫治疗至关重要。

表面等离子体共振 （SPR） 技术广泛用于检测各种生物分子，包括抗体抗原、酶、核酸和药物，在小分子药物筛选中特别有效^15,16。与其他生物物理技术不同，SPR 提供无标记检测、实时动力学数据和广泛的检测范围。相比之下，等温滴定量热法缺乏实时动力学信息，需要更大的样品量，从而限制了通量。微量热泳容易受到缓冲液干扰，无法提供动力学数据，而生物膜干涉法根据分子大小和特性具有特定应用的限制。均相时间分辨荧光需要标记，并且容易受到荧光干扰。我们承认 HTRF 是另一种适合探索 PD-1/PD-L1 抑制剂的技术。与 SPR 相比，HTRF 的一个固有局限性是由与分子内激发过程（例如电子转移、FRET 和漂白）的外部相互作用引起的荧光猝灭，由于窗口范围小，药物筛选过程中的灵敏度太低，以及荧光库化合物或生物蛋白质的干扰¹⁷.这些特性使 SPR 成为药物发现的卓越工具。我们以前的研究表明，SPR 能够确定小分子对 PD-1/PD-L1 的阻断作用，这优于其他在药物发现过程中需要高标记技术要求、多步骤、特异性差、成本高的技术¹⁸。

本研究介绍了一个优化的基于 SPR 的平台，该平台集成了双步偶联过程，该工艺利用胺和生物链霉亲和素偶联来增强芯片上的 PD-1 方向并最大限度地减少蛋白质使用。使用 PD-1/PD-L1 抑制剂 BMS-1166 作为阳性对照结合物成功验证了这种更新的方法，证明其阻断效果与我们之前的 SPR 方法和其他成熟技术（如 ELISA）相当^19,20。这不仅证实了我们方案的可靠性和可重复性，还说明了我们改良的平台在促进 PD-1/PD-L1 抑制剂的高通量筛选方面的有效性。生物链霉亲和素捕获步骤的掺入提供了定点导向而不是随机的蛋白质定向，通过使最终用户能够将链霉亲和素 （SA） 固定到 CM5 芯片上，从而降低 PD-1 浓度（40 μg/mL 对 10 μg/mL）并节省成本，CM5 芯片是商业化预固定化 SA 芯片的更便宜的替代品。这使其有利于大规模、经济高效的化合物/肽库筛选。尽管其他表征方法（包括计算机模拟、体外和体内分析）对于评估 PD-1/PD-L1 抑制剂抗癌的临床潜力至关重要，但我们基于 SPR 的增强型筛选平台作为大规模筛选 PD-1/PD-L1 抑制剂的有效工具脱颖而出。

试剂和设备列在 材料表中。

1. 将链霉亲和素 （SA） 蛋白固定在 CM5 芯片上

1. 在 SPR 仪器上设置固定方法： 打开/新建向导 模板，选择 固定，将芯片类型设置为 CM5，并将每个循环的流通池设置为 1。选中 固定流动槽 1 和流通池 2。
   1. 将 Amine 设置为固定方法。设定固定水平目标，配体浓度： 40 μg/mL 链霉亲和素，目标水平： 2000 RU，洗涤液： 50 mM NaOH。接下来，在运行之前检查 prime。
2. 准备以下试管：R2 B1 和 R2 C1 - 40 μg/mL 链霉亲和素;R2 B2 和 R2 C2：50 mM NaOH;R2 B3 和 R2 C3：EDC;R2 B4 和 R2 C4：NHS;R2 B5 和 R2 C5：空;R2 B6 和 R2 C6：乙醇胺。
   注：EDC 和 NHS 激活 CM5 芯片上的羧基，允许与配体上的胺共价偶联。乙醇胺用作封闭缓冲液，以防止固定过程中的非特异性结合。
3. 在 180 mL 去离子 （DI） 水中稀释 20 mL HBS-EP+ 缓冲液 10× 以制备 200 mL 1× HBS-EP+ 电泳缓冲液。
4. 向 1 mg 链霉亲和素中加入 1 mL 不含 DNase 的水，并在室温下孵育 30 分钟。接下来，在乙酸盐缓冲液 （pH 4.5） 中将链霉亲和素溶液稀释至 40 μg/mL。根据制造商的说明准备胺偶联试剂盒试剂，并按照步骤 1.2 中的指示放置所有相关试剂的布局。
5. 用 CM5 芯片替换维护传感器芯片，然后将管 A 放入准备好的 1× HBS-EP + 缓冲液中，重新打开固定方法，并根据步骤 1.2 布局插入管。 运行 该方法并保存结果文件。
6. 运行后维护：将 CM5 芯片更换为维护传感器芯片，将 Tube A 放入装满去离子水的瓶子中，运行灌注。取出 CM5 芯片后，用几滴去离子水清洗芯片并风干。将芯片放入 4 °C 的 50 mL 试管中。
   注意：固定化 SA 使 CM5 芯片能够用作 SA 芯片。

2. 将 PD-1 蛋白固定在 SA 芯片上

1. 在 SPR 仪器上设置固定方法： 打开/新建向导 模板，选择 固定，将芯片类型设置为 SA，并将每个循环的流通池设置为 1。选中固定 流动池 1 和池 2。
   1. 将 SA-生物素捕获 设置为方法。对于细胞 1 设置空白固定，对于细胞 2 设置固定水平， 10 μg/mL PD-1 作为配体，目标水平： 4000 RU，然后在运行前检查灌注。
      注：准备以下试管 - R2 B1 和 R2 C1：1 M NaCl、50 mM NaOH;R2 B2 和 R2 C2：50% 异丙醇/50 mM NaOH/1 M NaCl;R2 C3：10 μg/mL PD-1。
2. 将 58.44 mg NaCl 溶解在 1 mL 50 mM NaOH 中，以制备 1 M NaCl 和 50 mM NaOH 溶液。将 58.44 mg NaCl 和 4.0 mg NaOH 溶于 500 μL 水中，然后加入 500 μL 异丙醇以制备 50% 异丙醇/50 mM NaOH/1 M NaCl 溶液。
3. 制备 PD-1 溶液：将 200 μL 不含 DNase 的水加入 100 μg 生物素化的人 PD-1（Fc 和 Avitagged）中，在室温下稳定 30 分钟，然后在乙酸盐缓冲液 （pH 5.0） 中稀释至 10 μg/mL。
4. 按照步骤 2.1 中的说明放置所有试剂布局。将试管 A 放入 1× HBS-EP+ 电泳缓冲液中，然后弹出维护传感器芯片并插入 SA 芯片（步骤 1 中由链霉亲和素蛋白包被的 CM5 芯片）。重新打开固定方法，插入试剂架 2，检查位置，然后按照估计的运行时间运行该方法。
5. 重复步骤 1.6。

3. PD-1 和 PD-L1 的再生侦查

1. 设置再生筛选方法： 打开/新建向导 模板，选择 再生筛选，设置流路： 2-1、4-3，芯片类型为 SA，检查运行调节周期，将溶液记录为 HBS-EP+，接触时间为 30 秒，注射次数为 3，溶液为 PD-L1，接触时间： 30 秒，流速： 30 μL/min。
   1. 对于 再生参数，流速为 30 μL/min，稳定期为 300 s。在试验设计中，将条件数设置为 4，将每个条件的循环数设置为 2。将条件设置为 4，再生溶液： 甘氨酸 1.5、2.0、2.5、3.0，接触时间： 30 s，然后在运行前检查灌注。
2. 在 96 孔微孔板布局中，将每个 PD-L1 浓度设置为单独的样品孔位置：R1 A1 至 R1 A9：1 μM PD-L1;R1 A10 至 R1 A12：HBS-EP+ 缓冲液;R1 B1： 甘氨酸 1.5;R1 B2： 甘氨酸 2;R1 B3： 甘氨酸 2.5;R1 B4： 甘氨酸 3.
   注：使用具有不同 pH 值的甘氨酸缓冲液作为再生缓冲液。
3. 制备 PD-L1 溶液：将 200 μL 不含 DNase 的水加入 100 μg 人 PD-L1 Fc 标签蛋白 （9.42 μM） 中，然后在 HBS-EP+ 缓冲液中稀释至 1 μM。
4. 按照步骤 3.2 中的说明将所有相关试剂放置在布局中。将管 A 放入 1× HBS-EP+ 缓冲液中，然后用 SA 芯片替换维护传感器芯片。重新打开 再生侦查 方法，按照步骤 3.2 中的试管位置，插入试剂架，然后按照估计的运行时间 运行 该方法。
5. 重复步骤 1.6。

4. PD-1/PD-L1 相互作用的验证

注意：为了进行验证，在之前发布的报告¹⁸ 之后进行了细微的调整。

1. 使用与“ 常规设置”、“分析步骤”和 “循环类型”下已发布报告相同的参数，将接触时间设置为 60 秒，将解离时间设置为 60 秒，将流速设置为 30 μL/min。在 方法变量、评估变量 和 命令下，使用相同的设置，除了使用甘氨酸 2.0 作为 再生外，将流速设置为 30 μL/min，流路为 1、2、3、4。
   1. 然后设置 Run，并选择流路： 2-1、4-3。输入 PD-L1，浓度为 0 μM、0.037 μM、0.111 μM、0.333 μM，分子量为 51,300 Da。检查所有检测步骤进行验证，并在运行前选择引物。
   2. 然后在试剂架 2 布局中将每个 PD-L1 浓度设置为单独的样品孔位置：R2 B1：PD-L1 0 μM;R2 B2：PD-L1 0.037 μM;R2 B3：PD-L1 0.111 μM;R2 B4：PD-L1 0.333 μM;R2 A1：甘氨酸 2.0 作为再生缓冲液;R2 A2：HBS-EP+ 作为启动缓冲液。
2. 制备 200 mL 的 1× HBS-EP+ 电泳缓冲液。制备 PD-L1 浓度：在 HBS-EP+ 中以 9.42 μM 稀释 PD-L1 蛋白至 0.333 μM、0.111 μM 和 0.037 μM。然后按照步骤 4.1.2 中的说明将所有相关试剂放入布局中。
   1. 将管 A 插入 1× HBS-EP+ 电泳缓冲液中，弹出维护传感器芯片，插入 SA 芯片。重新打开 再生侦察 方法，按照步骤 4.1 中的试管定位，插入试剂架 2，并在估计的持续时间 内运行 该方法。
3. 重复步骤 1.6。

5. 小分子抑制剂 PD-1/PD-L1 阻断试验：BMS-1166

注意：对于封闭测定，先前发表的报告¹⁸ 之后进行了细微的调整。

1. 使用与“ 常规设置”、“分析步骤”和 “循环类型”下已发布报告相同的参数，将接触时间设置为 60 秒，将解离时间设置为 60 秒，将流速设置为 30 μL/min。在 方法变量下，评估变量 和 命令 也使用相同的设置，除了使用甘氨酸 2.0 作为 再生外，将流速设置为 30 μL/min，流路为 1、2、3、4。
   1. 然后设置 run，并选择 flow path： 2-1， 4-3。输入样品溶液：PD-L1（0.111 μM，分子量为 51,300 Da）和 BMS-1166，浓度为 0 μM、0.125 μM、0.625 μM、3.125 μM。检查所有检测步骤进行验证，并在运行前选择引物。
   2. 然后在试剂架 2 布局中将每个 PD-L1 浓度设置为单独的样品孔位置：R2 B1：PD-L1 （0.111 μM） + BMS-1166 0 μM R2 B2：PD-L1 （0.111 μM） + BMS-1166 0.125 μM;R2 B3：PD-L1 （0.111 μM） + BMS-1166 0.625 μM;R2 B4：PD-L1 （0.111 μM） + BMS-1166 3.125 μM;R2 A1：甘氨酸 2.0 用于再生。
2. 制备 200 mL 的 1× HBS-EP+ 电泳缓冲液。制备 BMS-1166/PD-L1 混合物：将 5 mg BMS-1166 溶解在 77.99 μL 二甲基亚砜 （DMSO） 中，制备 100 mM 储备液。在 HBS-EP+ 中，用 PD-L1 蛋白 （0.11 μM） 将储备液稀释至 BMS-1166 的目标浓度 0 μM、0.125 μM、0.625 μM 和 3.125 μM。按照步骤 5.1.2 中的说明放置所有相关的试剂布局。
   1. 将管 A 放入 1× HBS-EP+ 电泳缓冲液中，然后弹出维护传感器芯片并插入 SA 芯片。重新打开 再生侦查 方法，按照 5.1 中的试管位置，插入试剂架 2，然后按照估计的运行时间 运行 该方法。
3. 重复步骤 1.6。

SA 固定在 CM5 芯片上
通过 SPR 仪器和相关分析软件的输出分析数据，表明在流通池 1 和流通池 2 上成功实现了 SA 蛋白的目标 RU （2000 RU）。用 SA （40 μg/mL） 固定在 CM5 芯片表面的流通池 1 和 2，流通池 1 的最终响应为 1902.3 RU（图 1A），流通池 2 的最终响应为 1900.7 RU（图 1B）。

PD...

在过去的几十年里，各种免疫治疗方法（包括癌症疫苗、免疫检查点抑制剂和 CAR T 细胞疗法）显著推动了癌症治疗的进步²¹。免疫检查点在预防致病反应期间免疫细胞介导的附带损伤和抑制自身免疫方面起着至关重要的作用。一个关键的例子是 PD-L1 和 PD-1 之间的相互作用，它形成了一个主要的免疫检查点，使癌细胞能够逃避免疫监视。用单克隆抗体靶?...

作者没有什么可披露的。

作者感谢罗德岛大学的 RI-INBRE 核心设施，该设施得到了美国国立卫生研究院 （NIH） 下属国家研究资源中心 （NCRR） 的 Grant P20GM103430 的支持。这项研究得到了罗德岛大学药学院的试点资助奖、罗德岛生命科学中心 （RILSH） 的小额资助奖和罗德岛基金会的资助，所有这些都颁发给了 Chang Liu 博士。