JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول اختبار الحصار لمثبطات PD-1 / PD-L1 باستخدام تقنية رنين البلازمون السطحي. يستخدم استراتيجية تثبيت مزدوجة الخطوتين ونظام عازل مخصص لقياس وحدات الاستجابة بدقة ، مما يسهل تقييم معدلات الحصار للمركبات أو الأدوية البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك ، فهو يدعم تحديد مثبطات PD-1 / PD-L1 عالية الإنتاجية.

Abstract

يعد تعطيل تفاعل PD-1 / PD-L1 استراتيجية واعدة للعلاج المناعي للسرطان. تعد منصات الفحص الموثوقة ضرورية لتقييم فعالية مثبطات PD-1 / PD-L1. أظهر اختبار الحصار البشري PD-1 / PD-L1 الذي تم إنشاؤه مسبقا باستخدام تقنية الرنين البلازمي السطحي (SPR) (الجيل الأول من منصة فحص مثبط SPR PD-1 / PD-L1) نتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من خلال التألق المتجانس الذي تم حله بمرور الوقت (HTRF) والمقايسات القائمة على الخلايا ، مع إمكانية الفحص على نطاق واسع. هنا ، يتم تقديم نسخة محسنة من هذا الاختبار (منصة فحص SPR مثبطة PD-1 / PD-L1 من الجيل الثاني) ، والتي تتميز بعملية اقتران مزدوجة الخطوة تجمع بين اقتران الأمين والستربتافيدين الحيوي لتعزيز التحكم في اتجاه PD-1 على الرقاقة وتقليل استهلاك بروتين PD-1. تم التحقق من صحة النظام الأساسي المحدث بنجاح باستخدام مثبط PD-1 / PD-L1 BMS-1166 ، مما يدل على تأثيرات الحصار المماثلة للطريقة السابقة القائمة على SPR والتقنيات الأخرى المعمول بها مثل ELISA. تؤكد هذه النتائج موثوقية النهج. توفر منصة فحص SPR المحسنة هذه أداة عالية الإنتاجية وموثوقة لتحديد مثبطات PD-1 / PD-L1 الجديدة ، وتعزيز أبحاث العلاج المناعي للسرطان ، وتسليط الضوء على إمكانات SPR في فحص مثبطات نقاط التفتيش المناعية.

Introduction

تقف علاجات الحصار المناعي لنقاط التفتيش ، لا سيما تلك التي تستهدف موت الخلايا المبرمج -1 (PD-1) و Programmed Cell Death-Ligand 1 (PD-L1) ، في طليعة استراتيجيات العلاج المناعي للسرطان. حصلت العلاجات المضادة ل PD-1 / PD-L1 على الموافقة على استخدامها في أنواع مختلفة من السرطان ، مثل سرطان الدم والجلد والرئة والكبد والمثانة البولية والكلى1. PD-1 هو بروتين سكري عبر الغشاء ينتمي إلى عائلة الغلوبولين المناعي الفائقة ، ويتميز بمجال شبيه بمتغير الغلوبولين المناعي (IgV) في الطرف N ، وساق من الأحماض الأمينية تقريبا 20 تفصل مجال IgV عن غشاء البلازما ، ومجال الغشاء ، وذيل سيتوبلازمي يحتوي على أشكال إشارات قائمة على التيروزين2. PD-L1 ، الذي تم تحديده على أنه أحد روابط PD-1 ، هو بروتين غشاء من النوع الأول يتميز بمنطقة عبر الغشاء ، ومجالين خارج الخلية - ثابت الغلوبولين المناعي (IgC) و IgV - ومجال سيتوبلازم قصير نسبيا يؤدي إلى مسارات الإشارات داخل الخلايا3. يعمل المسار المثبط PD-1 / PD-L1 كنقطة تفتيش مناعية حرجة تنظم تنشيط الخلايا التائية والمناعة الذاتية4. يتم التعبير عن PD-1 على الخلايا التائية ، حيث يتفاعل مع PD-L1 ، ويمنع إشارات مستقبلات الخلايا التائية ، ويمنع تحفيز جزيئات CD28 و CD80 على الخلايا العارضة للمستضد والخلايا التائية5. تستغل الأنسجة السرطانية هذه الآلية الفسيولوجية عن طريق الإفراط في التعبير عن PD-L1 أثناء مرحلة الهروب ، وبالتالي خلق بيئة مثبطة للمناعة تعزز نمو الورموتطوره 6. تعطل مثبطات PD-1 و PD-L1 هذا التفاعل ، مما يمكن الجهاز المناعي من التهرب من القمع الناجم عن الورم وإعادة بدء عملية موت الخلايا السرطانية بوساطة الخلاياالتائية 7.

بناء على الأساس الذي أرساه الدور البارز لعلاجات الحصار المناعي لنقاط التفتيش ، أدى تطوير مثبطات PD-1 / PD-L1 إلى تقدم كبير في العلاج المناعي للسرطان. أيدت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) تسعة مثبطات لنقاط التفتيش المناعية التي تستهدف على وجه التحديد مسار PD-1 / PD-L1. وتشمل هذه ستة مثبطات PD-1 - بيمبروليزوماب ، ودوستارليماب ، ونيفولوماب ، وسيميبليماب ، وأوريباليماب ، وتيسليليزوماب - وثلاثة مثبطات PD-L1 - أتيزوليزوماب ، أفيلوماب ، ودورفالوماب8،9. تم استخدام هذه العلاجات بشكل فعال لعلاج مجموعة متنوعة من السرطانات ، مثل الورم الميلانيني وسرطان الرئة وسرطان الظهارة البولية وسرطان عنق الرحم وسرطان المعدة أو المريء والأورام الصلبةالأخرى 10. على الرغم من فعاليتها ، تواجه العلاجات القائمة على الأجسام المضادة أحادية النسيلة قيودا كبيرة ، بما في ذلك معدلات الاستجابة المنخفضة ، والتكاليف المرتفعة ، وفترات النصف الطويلة ، والأحداث الضائرة الشديدة المرتبطة بالمناعة ، والقيود المفروضة على الولادة الوريدية أو تحت الجلد11 ، 12 ، 13. وبالتالي ، تركز الأبحاث بشكل متزايد على تطوير مثبطات جزيئات صغيرة تستهدف محور PD-1 / PD-L1. توفر هذه الجزيئات الصغيرة مزايا مميزة ، مثل تحسين الاختراق الخلوي ، وتعديل الأهداف البيولوجية المتنوعة ، وتعزيز التوافر البيولوجي عن طريق الفم ، وخفض التكاليف ، بهدف تحقيق نتائج علاجية قابلة للمقارنة مع آثار ضارةأقل 14. ومع ذلك ، فإن تطوير مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف تفاعل PD-1 / PD-L1 لا يزال في مراحله الأولى ، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود منصة فحص موثوقة عالية الإنتاجية. هذه المنصات ضرورية للتقييم السريع للمكتبات الواسعة من الجزيئات الصغيرة وتحديد مركبات الرصاص لمزيد من التحقق والتحسين. التغلب على هذا التحدي أمر بالغ الأهمية للنهوض بالعلاج المناعي للسرطان.

يتم استخدام تقنية رنين البلازمون السطحي (SPR) على نطاق واسع في الكشف عن الجزيئات الحيوية المختلفة ، بما في ذلك مستضدات الأجسام المضادة والإنزيمات والأحماض النووية والأدوية ، وهي فعالة بشكل خاص في فحص الأدوية الجزيئات الصغيرة15،16. على عكس التقنيات الفيزيائية الحيوية الأخرى ، يوفر SPR اكتشافا خاليا من الملصقات ، وبيانات حركية في الوقت الفعلي ، ونطاق كشف واسع. في المقابل، يفتقر كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة إلى رؤى حركية في الوقت الفعلي ويتطلب أحجام عينات أكبر، مما يحد من الإنتاجية. الرحلان الحراري المجهري عرضة للتداخل المؤقت ولا يمكنه توفير بيانات حركية ، في حين أن قياس تداخل الطبقة الحيوية له قيود خاصة بالتطبيق بناء على الحجم الجزيئي وخصائصه. يتطلب التألق المتجانس الذي تم حله زمنيا وضع العلامات وهو عرضة للتداخل الفلوري. نحن نقر بأن HTRF هي تقنية أخرى مناسبة لاستكشاف مثبطات PD-1 / PD-L1. أحد القيود المتأصلة في HTRF ، مقارنة ب SPR ، هو التبريد الفلوري الناجم عن التفاعلات الخارجية مع عملية الإثارة داخل الجزيئات (على سبيل المثال ، نقل الإلكترون ، FRET ، والتبييض) ، والحساسية منخفضة جدا في عملية فحص الأدوية بسبب نطاق النافذة الصغير ، والتداخل من مركبات مكتبة الفلورسنت أو البروتينات البيولوجية17. تضع هذه الميزات SPR كأداة متفوقة لاكتشاف الأدوية. أظهرت دراساتنا السابقة أن SPR قادر على تحديد تأثير الحصار للجزيئات الصغيرة ضد PD-1 / PD-L1 ، وهو أمر مفيد على التقنيات الأخرى التي تتطلب متطلبات تقنية وضع العلامات العالية ، وخطوات متعددة ، وخصوصية رديئة ، وتكلفة عالية في عملية اكتشافالدواء 18.

تقدم هذه الدراسة نظاما أساسيا محسنا قائما على SPR ، يدمج عملية اقتران مزدوجة الخطوة تستخدم كلا من اقتران الأمين والستربتافيدين الحيوي لتعزيز اتجاه PD-1 على الرقاقة وتقليل استخدام البروتين. تم التحقق من صحة هذا النهج المحدث بنجاح باستخدام مثبط PD-1 / PD-L1 BMS-1166 كموثق تحكم إيجابي ، مما يدل على تأثيرات الحصار المماثلة لكل من طريقة SPR السابقة والتقنيات الأخرى الراسخة مثل ELISA19،20. هذا لا يؤكد موثوقية بروتوكولنا وقابليته للتكرار فحسب ، بل يوضح أيضا فعالية منصتنا المعدلة في تسهيل الفحص عالي الإنتاجية لمثبطات PD-1 / PD-L1. يوفر دمج خطوة التقاط الستربتافيدين الحيوي توجيها موجها للموقع بدلا من اتجاه البروتين العشوائي ، مما يسمح بتقليل تركيز PD-1 (40 ميكروغرام / مل مقابل 10 ميكروغرام / مل) وتوفير التكاليف من خلال تمكين المستخدم النهائي من شل حركة الستربتافيدين (SA) إلى شريحة CM5 ، وهو بديل أقل تكلفة لرقائق SA المسموقة مسبقا. هذا يجعلها مفيدة للفحوصات واسعة النطاق والفعالة من حيث التكلفة للمكتبات المركبة / الببتيد. على الرغم من أن طرق التوصيف الإضافية ، بما في ذلك المقايسات في السيليكو ، في المختبر ، وفي الجسم الحي ، ضرورية لتقييم الإمكانات السريرية لمثبطات PD-1 / PD-L1 ضد السرطان ، إلا أن منصة الفحص المحسنة القائمة على SPR تبرز كأداة فعالة للفحص على نطاق واسع لمثبطات PD-1 / PD-L1.

Protocol

الكواشف والمعدات مدرجة في جدول المواد.

1. تثبيت بروتين الستربتافيدين (SA) على شريحة CM5

  1. قم بإعداد طريقة تثبيت الحركة على أداة SPR: قالب معالج مفتوح/جديد ، واختر التثبيت وتعيين نوع الرقاقة إلى CM5، وخلايا التدفق لكل دورة إلى 1. تحقق من تثبيت خلية التدفق 1 وخلية التدفق 2.
    1. قم بتعيين Amine كطريقة الشلل. حدد الهدف لمستوى الجمود ، تركيز الترابط: 40 ميكروغرام / مل ستربتافيدين ، المستوى المستهدف: 2000 RU ، محلول الغسيل: 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم. بعد ذلك ، تحقق من Prime قبل التشغيل.
  2. تحضير الأنابيب التالية: R2 B1 و R2 C1 - 40 ميكروغرام / مل ستربتافيدين ؛ R2 B2 و R2 C2: 50 ملي من هيدروكسيد الصوديوم ؛ R2 B3 و R2 C3: EDC; R2 B4 و R2 C4: NHS; R2 B5 و R2 C5: فارغة; R2 B6 و R2 C6: الإيثانولامين.
    ملاحظة: يقوم EDC و NHS بتنشيط مجموعات الكربوكسيل على شريحة CM5 ، مما يسمح بالاقتران التساهمي مع الأمينات الموجودة على الترابط. يستخدم الإيثانولامين كمخزن مؤقت لمنع الارتباط غير المحدد أثناء الشلل.
  3. قم بتخفيف 20 مل من المخزن المؤقت HBS-EP + 10× في 180 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) لتحضير 200 مل من محلول عازل تشغيل 1× HBS-EP +.
  4. أضف 1 مل من الماء الخالي من DNase إلى 1 مجم من الستربتافيدين واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلول الستربتافيدين إلى 40 ميكروغرام / مل في محلول الأسيتات (الرقم الهيدروجيني 4.5). قم بإعداد كواشف مجموعة كاشف Amine Coupling وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وضع جميع تخطيطات الكاشف ذات الصلة كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  5. استبدل شريحة مستشعر الصيانة بشريحة CM5 ، ثم ضع الأنبوب A في المخزن المؤقت 1× HBS-EP + المحضر ، وأعد فتح طريقة الشلل ، وأدخل الأنابيب وفقا لتخطيط الخطوة 1.2. قم بتشغيل الطريقة واحفظ ملف النتائج.
  6. صيانة ما بعد التشغيل: استبدل شريحة CM5 بشريحة مستشعر الصيانة ، ضع الأنبوب A في زجاجة مملوءة بالماء منزوع الأيونات ، وقم بتشغيل الأنبوب الأول. بعد إخراج شريحة CM5 ، اغسل الشريحة ببضع قطرات من ماء DI وجففها في الهواء. ضع الشريحة في أنبوب سعة 50 مل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يتيح SA الثابت لشريحة CM5 العمل كشريحة SA.

2. تثبيت بروتين PD-1 على شريحة SA

  1. قم بتعيين طريقة تثبيت الحركة على أداة SPR: قالب معالج مفتوح/جديد ، واختر التثبيت وتعيين نوع الرقاقة إلى SA، وتدفق الخلايا لكل دورة إلى 1. تحقق من تثبيت خلية التدفق 1 والخلية 2.
    1. اضبط التقاط SA-biotin كطريقة. بالنسبة للخلية 1 ، قم بتعيين الشلل الفارغ ، بالنسبة للخلية 2 ، حدد الهدف للمستوى الثابت ، 10 ميكروغرام / مل PD-1 باعتباره الترابط ، المستوى المستهدف: 4000 RU ، ثم تحقق من الأولوية قبل التشغيل.
      ملاحظة: قم بإعداد الأنابيب التالية - R2 B1 و R2 C1: 1 م من كلوريد الصوديوم ، 50 ملي مولار من هيدروكسيد الصوديوم ؛ R2 B2 و R2 C2: 50٪ إيزوبروبانول / 50 ملي مولار من هيدروكسيد الصوديوم / 1 م من كلوريد الصوديوم ؛ R2 C3: 10 ميكروغرام / مل PD-1.
  2. قم بإذابة 58.44 مجم من كلوريد الصوديوم في 1 مل من 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم لتحضير 1 متر من كلوريد الصوديوم و 50 ملي مولار من محلول هيدروكسيد الصوديوم. قم بإذابة 58.44 مجم من كلوريد الصوديوم و 4.0 مجم من هيدروكسيد الصوديوم في 500 ميكرولتر من الماء ، ثم أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول لتحضير محلول 50٪ من الأيزوبروبانول / 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم / 1 م كلوريد الصوديوم.
  3. تحضير محلول PD-1: أضف 200 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase إلى 100 ميكروغرام من PD-1 البشري الحيوي (Fc and Avitagged) واستقر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم خفف إلى 10 ميكروغرام / مل في مخزن الأسيتات (درجة الحموضة 5.0).
  4. ضع جميع تخطيطات الكاشف كما هو موضح في الخطوة 2.1. ضع الأنبوب A في محلول المخزن المؤقت للتشغيل 1× HBS-EP + ، ثم أخرج شريحة مستشعر الصيانة وأدخل شريحة SA (شريحة CM5 مطلية ببروتين الستربتافيدين من الخطوة 1). أعد فتح طريقة الشلل ، وأدخل رف الكاشف 2 ، وتحقق من المواضع ، ثم قم بتشغيل الطريقة لوقت التشغيل المقدر.
  5. كرر الخطوة 1.6.

3. استكشاف التجديد ل PD-1 و PD-L1

  1. قم بإعداد طريقة استكشاف التجديد: قالب معالج مفتوح / جديد ، واختر استكشاف التجديد ، واضبط مسار التدفق: 2-1 ، 4-3 ، ونوع الرقاقة إلى SA ، وتحقق من دورة تكييف التشغيل ، وسجل الحل ك HBS-EP + ، ووقت الاتصال على أنه 30 ثانية ، وعدد الحقن ك 3 ، والمحلول ك PD-L1 ، وقت الاتصال: 30 ثانية ، معدل التدفق: 30 ميكرولتر / دقيقة.
    1. بالنسبة لمعلمات التجديد ، يبلغ معدل التدفق 30 ميكرولتر / دقيقة ، وفترة الاستقرار 300 ثانية. في التصميم التجريبي ، قم بتعيين عدد الشروط على أنه 4 ، وعدد الدورات لكل شرط على أنه 2. اضبط الشروط على أنها 4 ، محلول التجديد: جلايسين 1.5 ، 2.0 ، 2.5 ، 3.0 ، أوقات الاتصال: 30 ثانية ، ثم تحقق من الأولوية قبل التشغيل.
  2. اضبط كل تركيز PD-L1 كموضع بئر عينة منفصل في تخطيط صفيحة دقيقة 96 بئرا: R1 A1 إلى R1 A9: 1 ميكرومتر PD-L1 ؛ R1 A10 إلى R1 A12: المخزن المؤقت HBS-EP+; R1 B1: جلايسين 1.5 ؛ R1 B2: الجلايسين 2 ؛ R1 B3: جلايسين 2.5 ؛ R1 B4: الجلايسين 3.
    ملاحظة: يتم استخدام المخزن المؤقت للجلايسين بدرجة حموضة مختلفة كمخزن مؤقت للتجديد.
  3. تحضير محلول PD-L1: أضف 200 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase إلى 100 ميكروغرام من بروتين PD-L1 Fc Tag البشري (9.42 ميكرومتر) ، ثم خفف إلى 1 ميكرومتر في المخزن المؤقت HBS-EP +.
  4. ضع جميع الكواشف ذات الصلة في التخطيط كما هو موضح في الخطوة 3.2. ضع الأنبوب A في المخزن المؤقت 1× HBS-EP+ ، ثم استبدل شريحة مستشعر الصيانة بشريحة SA. أعد فتح طريقة Regenerate Scouting ، واتبع موضع الأنبوب من الخطوة 3.2، وأدخل حامل الكاشف، ثم قم بتشغيل الطريقة لوقت التشغيل المقدر.
  5. كرر الخطوة 1.6.

4. التحقق من صحة تفاعل PD-1 / PD-L1

ملاحظة: للتحقق من الصحة، تم اتباع تقريرمنشور سابقا 18 بتعديلات طفيفة.

  1. استخدم نفس المعلمات مثل التقرير المنشور ضمن الإعدادات العامة وخطوات الفحص وأنواع الدورات، واضبط وقت الاتصال على 60 ثانية، ووقت التفكك على 60 ثانية، ومعدل التدفق إلى 30 ميكرولتر/دقيقة. ضمن متغيرات الطريقة ومتغيرات التقييم والأوامر ، استخدم نفس الإعداد ، باستثناء استخدام Glycine 2.0 كتجديد ، ومعدل تدفق الإعداد إلى 30 ميكرولتر / دقيقة ، يمر عبر مسار التدفق 1 ، 2 ، 3 ، 4.
    1. ثم قم بإعداد التشغيل، واختر مسار التدفق: 2-1، 4-3. أدخل PD-L1 بتركيزات من 0 ميكرومتر ، 0.037 ميكرومتر ، 0.111 ميكرومتر ، 0.333 ميكرومتر ، ووزن جزيئي يبلغ 51,300 دال. تحقق من جميع خطوات الفحص للتحقق وحدد العدد الأولي قبل التشغيل.
    2. ثم قم بتعيين كل تركيز PD-L1 كموضع بئر عينة منفصل في تخطيط رف الكاشف 2: R2 B1: PD-L1 0 ميكرومتر؛ R2 B2: PD-L1 0.037 ميكرومتر; R2 B3: PD-L1 0.111 ميكرومتر ؛ R2 B4: PD-L1 0.333 ميكرومتر؛ R2 A1: الجلايسين 2.0 كمخزن مؤقت للتجدد. R2 A2: HBS-EP+ كمخزن مؤقت لبدء التشغيل.
  2. قم بإعداد 200 مل من محلول المخزن المؤقت للتشغيل 1× HBS-EP+. تحضير تركيزات PD-L1: قم بتخفيف بروتين PD-L1 عند 9.42 ميكرومتر إلى 0.333 ميكرومتر و 0.111 ميكرومتر و 0.037 ميكرومتر في HBS-EP +. ثم ضع جميع الكواشف ذات الصلة في التخطيط كما هو موضح في الخطوة 4.1.2.
    1. أدخل الأنبوب A في حل المخزن المؤقت للتشغيل 1× HBS-EP+ ، وأخرج شريحة مستشعر الصيانة ، وأدخل شريحة SA. أعد فتح طريقة استكشاف التجديد ، واتبع موضع الأنبوب من الخطوة 4.1 ، وأدخل رف الكاشف 2 ، وقم بتشغيل الطريقة للمدة المقدرة.
  3. كرر الخطوة 1.6.

5. اختبار الحصار PD-1 / PD-L1 مع مثبط جزيء صغير: BMS-1166

ملاحظة: بالنسبة لمقايسة الحصار ، تم اتباع تقريرنشر سابقا رقم 18 بتعديلات طفيفة.

  1. استخدم نفس المعلمات مثل التقرير المنشور ضمن الإعدادات العامة وخطوات الفحص وأنواع الدورات، واضبط وقت الاتصال على 60 ثانية، ووقت التفكك على 60 ثانية، ومعدل التدفق إلى 30 ميكرولتر/دقيقة. تحت متغيرات الطريقة ، تستخدم متغيرات التقييم والأوامر أيضا نفس الإعداد ، باستثناء استخدام Glycine 2.0 كتجديد ، ومعدل تدفق الإعداد إلى 30 ميكرولتر / دقيقة ، ويمر عبر مسار التدفق 1 ، 2 ، 3 ، 4.
    1. ثم قم بإعداد التشغيل، واختر مسار التدفق: 2-1، 4-3. أدخل محلول العينة: PD-L1 (0.111 ميكرومتر ، الوزن الجزيئي 51,300 Da) مع BMS-1166 عند 0 ميكرومتر ، 0.125 ميكرومتر ، 0.625 ميكرومتر ، 3.125 ميكرومتر. تحقق من جميع خطوات الفحص للتحقق وحدد العدد الأولي قبل التشغيل.
    2. ثم اضبط كل تركيز PD-L1 كموضع بئر عينة منفصل في تخطيط رف الكاشف 2: R2 B1: PD-L1 (0.111 ميكرومتر) + BMS-1166 0 ميكرومتر R2 B2: PD-L1 (0.111 ميكرومتر) + BMS-1166 0.125 ميكرومتر؛ R2 B3: PD-L1 (0.111 ميكرومتر) + BMS-1166 0.625 ميكرومتر؛ R2 B4: PD-L1 (0.111 ميكرومتر) + BMS-1166 3.125 ميكرومتر؛ R2 A1: جلايسين 2.0 للتجديد.
  2. قم بإعداد 200 مل من محلول المخزن المؤقت للتشغيل 1× HBS-EP+. تحضير خليط BMS-1166 / PD-L1: قم بإذابة 5 مجم من BMS-1166 في 77.99 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتحضير محلول مخزون 100 ملم. قم بتخفيف محلول المخزون ببروتين PD-L1 (0.11 ميكرومتر) إلى التركيزات المستهدفة ل BMS-1166 عند 0 ميكرومتر و 0.125 ميكرومتر و 0.625 ميكرومتر و 3.125 ميكرومتر في HBS-EP +. ضع جميع تخطيطات الكواشف ذات الصلة كما هو موضح في الخطوة 5.1.2.
    1. ضع الأنبوب A في حل المخزن المؤقت للتشغيل 1× HBS-EP+ ، ثم أخرج شريحة مستشعر الصيانة وأدخل شريحة SA. أعد فتح طريقة استكشاف التجديد ، واتبع موضع الأنبوب من 5.1 ، وأدخل رف الكاشف 2 ، ثم قم بتشغيل الطريقة لوقت التشغيل المقدر.
  3. كرر الخطوة 1.6.

النتائج

تثبيت SA على شريحة CM5
تم تحليل البيانات عبر مخرجات من أداة SPR وبرنامج التحليل المرتبط بها مما يشير إلى التحقيق الناجح للهدف RU (2000 RU) لبروتين SA على خلية التدفق 1 وخلية التدفق 2. تم تثبيت خلايا التدفق 1 و 2 باستخدام SA (40 ميكروغرام / مل) على سطح شريحة CM5 مع استجابة نها...

Discussion

على مدى العقود القليلة الماضية ، أدت أساليب العلاج المناعي المختلفة - بما في ذلك لقاحات السرطان ، ومثبطات نقاط التفتيش المناعية ، وعلاجات الخلايا التائية CAR - إلى تطوير علاج السرطانبشكل كبير 21. تلعب نقاط التفتيش المناعية دورا مهما في منع الأضرار الجانبية الت...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يقر المؤلفون بمرفق RI-INBRE الأساسي في جامعة رود آيلاند ، بدعم من Grant P20GM103430 من المركز الوطني لموارد البحث (NCRR) ، وهو أحد مكونات المعاهد الوطنية للصحة (NIH). تم دعم هذا البحث من خلال جائزة منحة تجريبية من كلية الصيدلة بجامعة رود آيلاند ، وجائزة منحة صغيرة من مركز رود آيلاند لعلوم الحياة (RILSH) ، ومنحة مؤسسة رود آيلاند ، وكلها منحت إلى تشانغ ليو ، دكتوراه.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mM NaOHCytiva Life Sciences100358
50 mM NaOHFisher Scientific905376
96-Well Polystyrene MicroplatesCytiva Life SciencesBR100503
Amine Coupling KitCytiva Life Sciences35120
Biacore T200 SPR System and Evaluation Software 3.2Cytiva Life Sciences28975001
Biotinylated Human PD-1 Fc, Avitag ProteinAcro BiosystemsPD1-H82F1
BMS1166MedChemExpressHY-102011
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich276855
DNase Free WaterFisher Scientific188506
Glycine 1.5Cytiva Life SciencesBR100354
Glycine 2.0Cytiva Life SciencesBR100355
Glycine 2.5Cytiva Life SciencesBR100356
Glycine 3.0Cytiva Life SciencesBR100357
HBS-EP+ BufferCytiva Life SciencesBR100669
Human PD-L1 Fc Tag ProteinAcro BiosystemsPD-1-H5258
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Microplate Foil, 96-Well Cytiva Life Sciences28975816
NaClSigma-Aldrich746398
Plastic Vials 7 mmCytiva Life SciencesBR100212
Rubber Caps, Type 3Cytiva Life SciencesBR100502
Series S Sensor Chip CM5Cytiva Life Sciences29149603
Sodium Acetate 4.5Cytiva Life Sciences100350
Sodium Acetate 5.0Cytiva Life Sciences100351
StreptavidinSigma-AldrichS4762

References

  1. Ribas, A., Wolchok, J. D. Cancer immunotherapy using checkpoint blockade. Science. 359 (6382), 1350-1355 (2018).
  2. Zhang, X., et al. Structural and functional analysis of the costimulatory receptor programmed death-1. Immunity. 20 (3), 337-347 (2004).
  3. Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J Exp Med. 192 (7), 1027-1034 (2000).
  4. Han, Y., Liu, D., Li, L. PD-1/PD-L1 pathway: Current researches in cancer. Am J Cancer Res. 10 (3), 727-742 (2020).
  5. Lyu, N., et al. Recognition of PDL1/L2 by different induced-fit mechanisms of PD1: A comparative study of molecular dynamics simulations. Phys Chem Chem Phys. 22 (3), 1276-1287 (2020).
  6. Taube, J. M., et al. Colocalization of inflammatory response with B7-H1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci Trans Med. 4 (127), 127ra37 (2012).
  7. Sun, X., et al. Immune-related adverse events associated with programmed cell death protein-1 and programmed cell death ligand 1 inhibitors for non-small cell lung cancer: A PRISMA systematic review and meta-analysis. BMC Cancer. 19 (1), 558 (2019).
  8. Alkholifi, F. K., Alsaffar, R. M. Dostarlimab an inhibitor of PD-1/PD-L1: A new paradigm for the treatment of cancer. Medicina. 58 (11), 1572 (2022).
  9. Uzar, W., et al. An updated patent review on PD-1/PD-L1 antagonists (2022-present). Expert Opin Ther Pat. 34 (8), 627-650 (2024).
  10. Ai, L., et al. Research status and outlook of PD-1/PD-L1 inhibitors for cancer therapy. Drug Des Devel Ther. 14, 3625-3649 (2020).
  11. Conroy, M., Naidoo, J. Immune-related adverse events and the balancing act of immunotherapy. Nat Commun. 13 (1), 392 (2022).
  12. Guzik, K., et al. Small-molecule inhibitors of the Programmed Cell Death-1/Programmed Death-Ligand 1 (PD-1/PD-L1) interaction via transiently induced protein states and dimerization of PD-L1. J Med Chem. 60 (13), 5857-5867 (2017).
  13. Sifniotis, V., Cruz, E., Eroglu, B., Kayser, V. Current advancements in addressing key challenges of therapeutic antibody design, manufacture, and formulation. Antibodies. 8 (2), 36 (2019).
  14. Beck, H., Härter, M., Haß, B., Schmeck, C., Baerfacker, L. Small molecules and their impact in drug discovery: A perspective on the occasion of the 125th anniversary of the Bayer Chemical Research Laboratory. Drug Discov Today. 27 (6), 1560-1574 (2022).
  15. Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A Versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel, Switzerland). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  16. Liu, C., Seeram, N. P., Ma, H. Small molecule inhibitors against PD-1/PD-L1 immune checkpoints and current methodologies for their development: A review. Cancer Cell Int. 21 (1), 239 (2021).
  17. Hu, K., Li, X. -. J., Asmamaw, M. D., Shi, X. -. J., Liu, H. -. M. Establishment of high-throughput screening HTRF assay for identification small molecule inhibitors of Skp2-Cks1. Sci Rep. 11 (1), 21105 (2021).
  18. Puopolo, T., et al. Establishment of human PD-1/PD-L1 blockade assay based on surface plasmon resonance (SPR) biosensor. Bio-protoc. 13 (15), e4765 (2023).
  19. Ding, M., Chen, Y., Lang, Y., Cui, L. The role of cellular prion protein in cancer biology: A potential therapeutic target. Front Oncol. 11, 742949 (2021).
  20. Li, H., Seeram, N. P., Liu, C., Ma, H. Further investigation of blockade effects and binding affinities of selected natural compounds to immune checkpoint PD-1/PD-L1. Front Oncol. 12, 995461 (2022).
  21. Kamrani, A., et al. New immunotherapeutic approaches for cancer treatment. Pathol Res Pract. 248, 154632 (2023).
  22. Yan, Y., Zhang, L., Zuo, Y., Qian, H., Liu, C. Immune checkpoint blockade in cancer immunotherapy: mechanisms, clinical outcomes, and safety profiles of PD-1/PD-L1 inhibitors. Arch Immunol Ther Exp. 68 (6), 36 (2020).
  23. Chandrasekharan, G., Unnikrishnan, M. High throughput methods to study protein-protein interactions during host-pathogen interactions. Eur J Cell Biol. 103 (2), 151393 (2024).
  24. Zhang, Y., et al. BMS-202, a PD-1/PD-L1 inhibitor, decelerates the profibrotic effects of fibroblasts derived from scar tissues via ERK and TGFβ1/Smad signaling pathways. Immun Inflamm Dis. 10 (1), e591 (2022).
  25. Surmiak, E., et al. PD-L1 inhibitors: Different classes, activities, and mechanisms of action. Int J Mol Sci. 22 (21), 11797 (2021).
  26. Feoli, A., Sarno, G., Castellano, S., Sbardella, G. DMSO-Related effects on ligand-binding properties of lysine methyltransferases G9a and SETD8. ChemBioChem. 25 (4), e202300809 (2024).
  27. Tjernberg, A., Markova, N., Griffiths, W. J., HalléN, D. DMSO-Related effects in protein characterization. SLAS Discov. 11 (2), 131-137 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved