Identificação da fonte de proteínas secretadas no rim por injeção de Brefeldin A

Identificar o tipo de célula responsável pela secreção de citocinas é necessário para entender a patobiologia da doença renal. Aqui, descrevemos um método para corar quantitativamente o tecido renal em busca de citocinas produzidas por células epiteliais ou intersticiais renais usando brefeldina A, um inibidor de secreção e marcadores específicos do tipo de célula.

A doença renal crônica (DRC) é uma das dez principais causas de morte nos EUA. A lesão renal aguda (LRA), embora muitas vezes recuperável, predispõe os pacientes à DRC mais tarde na vida. As células epiteliais renais foram identificadas como nós-chave de sinalização tanto na LRA quanto na DRC, por meio das quais as células podem determinar o curso da doença por meio da secreção de citocinas e outras proteínas. Especialmente na DRC, várias linhas de evidência demonstraram que as células tubulares reparadas de forma inadequada impulsionam a progressão da doença por meio da secreção do fator de crescimento transformador beta (TGF-β), fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) e outras citocinas pró-fibróticas. No entanto, identificar a fonte e o número relativo de proteínas secretadas de diferentes tipos de células in vivo continua sendo um desafio.

Este trabalho descreve uma técnica que utiliza brefeldina A (BFA) para prevenir a secreção de citocinas, permitindo a coloração de citocinas no tecido renal usando técnicas padrão de imunofluorescência. O BFA inibe o transporte do retículo endoplasmático (RE) para o aparelho de Golgi, que é necessário para a secreção de citocinas e outras proteínas. A injeção de BFA 6 h antes do sacrifício leva a um acúmulo de TGF-β, PDGF e CTGF dentro das células do túbulo proximal (PTCs) em um modelo de cisplatina de camundongo de LRA e TGF-β em um modelo de ácido aristolóquico (AA) de camundongo de DRC. A análise revelou que BFA + cisplatina ou BFA + AA aumentou significativamente o sinal positivo para TGF-β em comparação com BFA + solução salina, cisplatina ou AA isoladamente. Esses dados sugerem que o BFA pode ser usado para identificar o tipo de célula produtora de citocinas específicas e quantificar as quantidades relativas e/ou diferentes tipos de citocinas produzidas.

Estima-se que >10% da população mundial tenha algum tipo de doença renal¹. Definida por seu rápido início, a LRA é amplamente curável; no entanto, um episódio de LRA pode predispor os pacientes a desenvolver DRC mais tarde na vida ^2,3. Ao contrário da LRA, a DRC é marcada por fibrose progressiva e piora da função renal, levando à doença renal terminal que requer terapia renal substitutiva. A maioria das lesões nos rins tem como alvo as células epiteliais especializadas, como podócitos ou células dos túbulos proximais, que compõem o néfron ^4,5. Após a lesão, as células epiteliais sobreviventes ajudam a coordenar a resposta de reparo por meio da secreção de citocinas e outras proteínas. Dessa forma, as células sobreviventes podem modular a resposta imune, direcionar a remodelação da matriz extracelular e auxiliar na recuperação de órgãos.

As citocinas são pequenas proteínas secretadas essenciais para modular a maturação, o crescimento e a capacidade de resposta de organismos multicelulares ^6,7. Eles funcionam como mensageiros de sinal entre vários tipos de células, incluindo células imunes e epiteliais⁸. Embora se acredite que as citocinas sejam secretadas principalmente por células imunes, pesquisas de longa data demonstraram que as células epiteliais e intersticiais renais também secretam citocinas como sinais para outras células renais residentes, como células tubulares, células intersticiais e células imunes ^9,10. Os PTCs, em particular, desempenham um papel importante na fase de iniciação e recuperação após a LRA¹¹. No entanto, sabe-se que os PTCs reparados de forma inadequada secretam citocinas pró-fibróticas, como o fator de crescimento transformador-β (TGF-β), o fator de crescimento derivado de plaquetas D (PDGF-D) e o fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), contribuindo para a progressão da DRC¹². Assim, as células epiteliais renais usam citocinas secretadas para modular a lesão renal.

Embora se saiba que as células epiteliais renais secretam citocinas, a fonte exata e a contribuição relativa de cada tipo celular têm sido difíceis de determinar devido aos desafios técnicos do estudo das proteínas secretadas¹³. A citometria de fluxo, uma abordagem comum usada para medir citocinas, é difícil de realizar em rins lesionados, especialmente em rins altamente fibróticos. Com a Cre recombinase impulsionada por um promotor de citocinas, os camundongos repórteres de citocinas são frequentemente usados para identificar o tipo de célula que expressa uma determinada citocina. No entanto, o uso de camundongos repórteres é limitado devido à necessidade de cruzar camundongos repórteres em vários fundos de nocaute, à falta de repórteres adequados e ao fato de que apenas uma citocina pode ser analisada por vez. Assim, é necessário desenvolver uma técnica simples, versátil e acessível para detectar células renais liberadoras de citocinas.

Nossa hipótese é que a injeção de BFA, um inibidor de secreção que bloqueia o transporte de retículo endoplasmático-Golgi in vivo, permitiria a coloração de proteínas secretadas no tecido renal (Figura 1A, B), como mostrado em ensaios baseados em citometria de fluxo^14,15. Juntamente com os fabricantes específicos do tipo de célula, essa técnica pode ser usada para identificar a fonte e a contribuição relativa das células produtoras de citocinas nos rins lesionados. Ao contrário das amostras para citometria de fluxo, os tecidos fixos podem ser mantidos a longo prazo com preservação de proteínas e estruturas celulares, permitindo uma investigação mais completa das células secretoras. Para testar essa hipótese, os rins de camundongos foram lesados com um modelo de LRA (cisplatina) e um modelo de DRC (nefropatia por ácido aristolóquico (AAN)), injetados com BFA e corados usando técnicas imunofluorescentes padrão.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o protocolo de uso de animais aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados com Animais e Usuários do Vanderbilt University Medical Center.

1. Animais

1. Use camundongos machos BALB/c de 8 a 12 semanas de idade (peso corporal: aproximadamente 25 g) para nefropatia induzida por cisplatina ou ácido aristolóquico.
2. Certifique-se de que os ratos estejam saudáveis e não tenham sinais óbvios de angústia ou ferimentos causados pela luta.
   NOTA: Ferimentos, especialmente na cauda, podem interferir no protocolo descrito aqui. Os camundongos BALB/c foram escolhidos porque é mais fácil visualizar a veia da cauda para injeção nesses camundongos. O protocolo descrito aqui funciona para outras linhagens de camundongos; no entanto, a dosagem de cisplatina ou ácido aristolóquico pode diferir de cepa para cepa.

2. Injeção de cisplatina

1. Dissolva a cisplatina em solução salina estéril até uma concentração final de 1 mg / mL.
   NOTA: A cisplatina não se dissolve completamente à temperatura ambiente. Deve ser manuseado em um exaustor.
2. Aquecer a solução de cisplatina em banho-maria a 37 °C e agitar repetidamente até que a cisplatina se dissolva completamente.
3. Pesar os ratinhos e calcular o volume de solução de cisplatina necessário para injectar 20 mg/kg de peso corporal (pc).
4. Desinfetar a pele abdominal com swabs de iodopovidona (7,5%) e álcool (70%) alternando 3x cada.
5. Usando uma seringa de insulina com uma agulha de 25 G, injete a solução de cisplatina por via intraperitoneal.
6. Prossiga para a secção 4 no dia 3 após a injeção.

3. Injeção de ácido aristolóquico (AA)

1. Dissolva o ácido aristolóquico-I em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração final de 0,5 mg / mL.
   NOTA: AA deve ser manuseado em um exaustor. AA-I deve ser usado, pois é a forma dominante que induz lesão renal.
2. Aquecer a solução de AA em banho-maria a 37 °C e vórtice repetidamente até dissolver completamente.
3. Pesar os ratinhos e calcular o volume da solução de AA para injectar 5 mg/kg de peso corporal.
4. Desinfetar a pele abdominal com cotonete de iodopovidona (7,5%) e álcool (70%) 3x.
5. Usando uma seringa de insulina com uma agulha de 25 G, injete a solução de AA por via intraperitoneal.
6. Injete AA em dias alternados para um total de 3 injeções.
7. Prossiga para a secção 4 no dia 42 após a última injeção.

4. Preparação da solução BFA

1. Dissolva o BFA em dimetilsulfóxido na concentração de 10 mg / mL para fazer uma solução estoque.
2. Conservar a solução-mãe a -20 °C.
3. Diluir a solução-mãe de BFA com PBS estéril na concentração final de trabalho de 1,25 mg/ml
   NOTA: Prepare uma nova solução de trabalho a cada vez imediatamente antes da injeção.

5. Injeção de BFA na veia da cauda

1. Antes da injeção, coloque a gaiola meio colocada, metade fora de uma almofada de aquecimento por 10 minutos para garantir que os camundongos estejam aquecidos para evitar uma queda na temperatura corporal, o que pode causar vasoconstrição dos vasos na cauda e interferir na injeção.
   NOTA: Coloque a gaiola nas almofadas de aquecimento de forma que metade da gaiola fique na almofada enquanto a outra metade não. Dessa forma, quando os ratos se sentirem aquecidos, eles podem se mover para o outro lado da gaiola e vice-versa.
2. Contenha os mouses usando dispositivos de retenção disponíveis comercialmente de tamanho apropriado.
3. Desinfete a cauda usando iodopovidona e cotonete embebido em álcool três vezes, conforme descrito acima.
4. Segure a cauda horizontalmente e visualize as veias laterais da cauda (Figura 1C). Use uma fonte de luz sob a cauda para ajudar a visualizar as veias.
5. Insira uma agulha de 28 G, mantendo a agulha e a seringa paralelas à veia na direção da cabeça.
6. Injete 200 μL da solução de BFA a 1,25 mg/ml (0,25 mg de BFA). Aguarde até que a veia fique clara à medida que o sangue é substituído pela solução injetável, indicando que a injeção foi bem-sucedida.
7. Remova a agulha e pressione a cauda suavemente até que o sangramento pare.
8. Retorne os ratos para a gaiola e monitore-os quanto a sangramento adicional ou sinais de angústia.

6. Sacrifício e colheita dos rins

1. Eutanasiar os camundongos com uma overdose de isoflurano seguida de luxação cervical 6 h após a injeção de BFA.
   NOTA: O ponto de tempo de 6 h foi escolhido com base na literatura que demonstra que 6 h de tratamento com BFA em outros órgãos permitem acúmulo suficiente de citocinas dentro das células para visualizá-las por coloração imunofluorescente¹⁶.
2. Imediatamente após o sacrifício, exponha o abdômen e o coração do camundongo por uma incisão na linha média ventral.
3. Colete 100-500 μL de sangue para um ensaio de nitrogênio ureico no sangue (BUN) por punção cardíaca. Use agulhas de 25 G com seringas de insulina de 1 mL para coletar o sangue. Para evitar a coagulação, adicione 5 μL de solução de heparina (100 mg / 15 mL de dH₂O) a cada amostra.
   NOTA: É necessário um mínimo de 20 μL de sangue para o ensaio de ureia; no entanto, aproximadamente 500 μL podem ser coletados por punção cardíaca após a eutanásia, o que pode ser útil para outros ensaios. Colete o máximo de sangue possível.
4. Conservar as amostras de sangue no gelo até que os rins sejam recolhidos na secção 7 abaixo.
   1. Centrifugue as amostras de sangue a 1.300 × g por 10 min.
   2. Isolar o plasma suavemente e conservá-lo a -20 °C até estar pronto para realizar o ensaio de ureia na secção 17 abaixo. Em alternativa, armazene as amostras de plasma para ensaios de creatinina.

7. Perfusão e remoção dos rins

1. Perfunda o camundongo com 10-20 mL de PBS através do ventrículo esquerdo usando uma seringa de 20 mL a uma taxa de fluxo de 2-4 mL / min até que o perfusato fique claro.
2. Remova os rins segurando a artéria e a veia renais com uma pinça perto da papila e cortando os vasos do lado oposto ao rim.
3. Remova suavemente a cápsula renal retirando-a manualmente ou com uma pinça fina e estéril.
4. Dependendo do anticorpo, prossiga para a seção 8 para preparação de tecido fixo embebido em parafina ou seção 10 para preparação de tecido congelado fixo.
   NOTA: O processamento de tecidos precisará ser otimizado para cada anticorpo a ser usado para coloração.

8. Tecido embebido em parafina para coloração de TGF-β e PDGF-D

1. Dividindo o rim colocando-o em uma lâmina de vidro limpa e cortando-o horizontalmente com uma nova lâmina de barbear. Coloque metade em 10 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS por 24 h em um rotador de ponta a ponta a uma velocidade de 10 rotações por minuto (rpm).
   NOTA: O rim inteiro não é necessário para seccionamento. Metade do rim pode ser armazenada ou usada para outros ensaios.
2. Substitua o PFA por etanol 70%.
3. Envie a metade do rim para processamento e inclusão de parafina nesta fase, em seguida, corte os tecidos renais embebidos em parafina a 4-6 μm usando um micrótomo e monte-os em lâminas carregadas pré-limpas^17,18.
   NOTA: Os rins foram processados e incluídos em parafina pelo Recurso Compartilhado de Patologia Translacional do Centro Médico da Universidade Vanderbilt e armazenados em temperatura ambiente.

9. Desparafinização e reidratação

1. Coloque as lâminas em um rack de coloração de lâminas e mergulhe-as em um poço de coloração contendo D-limoneno por 5 min, garantindo que o tecido esteja completamente submerso. Repita em um poço contendo D-limoneno fresco.
2. Reidrate os tecidos mergulhando as lâminas em diluições seriadas de etanol 100% (2x), 95%, 90% e 70% por 5 min cada.
3. Lave as lâminas em fluxo dH₂O por 5 min.
4. Realize a recuperação do antígeno incubando as seções em tampão citrato (pH 6,0) em uma panela de pressão a 121 ° C e 15 psi por 45 min.
5. Lave as lâminas em fluxo dH₂O por 20 min.
6. Prossiga para a seção 12.

10. Preparação de tecido congelado para coloração CTGF

1. Dividir o rim ao longo do eixo horizontal usando uma lâmina de barbear nova.
   NOTA: O rim inteiro não é necessário para seccionamento. Metade do rim pode ser armazenada ou usada para outros ensaios.
2. Coloque a metade do rim em 10 mL de PFA a 0,5% em um tubo de 15 mL em um rotador por 2 h a 4 ° C a uma velocidade de 10 rpm.
3. Transvase o PFA para um recipiente para descarte adequado e adicione 10 mL de glicina 0,1 M em PBS por 1 h a 4 °C a uma velocidade de 10 rpm.
4. Transvase a glicina, adicione 10 ml de sacarose a 15% dissolvida em PBS e coloque o tubo num rotador durante a noite a 4 °C e 10 rpm.
5. Transvase a sacarose a 15% e substitua por 10 ml de sacarose a 30% dissolvida em PBS durante 1 h a 4 °C e 10 rpm.
6. Encha o molde de incorporação com composto de temperatura de corte ideal (OCT) e incorpore a metade do rim da etapa 10.5 com a superfície de corte do rim voltada para baixo.
7. Coloque o molde contendo o meio rim e a OCT cuidadosamente em uma poça de nitrogênio líquido para congelar.
   NOTA: Não deixe o nitrogênio líquido entrar em contato direto com a OCT, pois isso pode resultar na formação de bolhas. Equipamento de proteção individual adequado deve ser usado ao usar nitrogênio líquido, como óculos de proteção/protetor facial, luvas criogênicas e jaleco. É melhor usar uma pinça longa, ~ 25 cm, para colocar os moldes em nitrogênio líquido.
8. Depois de congelado, armazene o molde a -80 °C.

11. Seccionamento congelado

1. Certifique-se de que o criostato esteja a -20 °C.
2. Armazenar os moldes contendo amostras em OCT no criostato a -20 °C durante 2 h para equilibrar a temperatura.
3. Remova o molde segurando as abas e pressionando por baixo.
4. Coloque OCT fresco em um suporte de amostra e coloque o bloco de amostra congelado por cima, com o lado do tecido voltado para longe do suporte de amostra.
5. Coloque o suporte da amostra e a amostra na prateleira de congelamento.
6. Coloque um extrator de calor pesado no topo do bloco para achatar a superfície. Mantenha a tampa do criostato fechada quando não estiver em uso para evitar flutuações de temperatura.
7. Uma vez que o OCT fresco entre o bloco de amostra e o suporte de amostra esteja congelado, verifique se a conexão está segura.
8. Prenda o suporte da amostra na cabeça do micrótomo do criostato.
9. Comece a seccionar até que o tecido fique visível no bloco da amostra.
10. Corte o tecido renal a 4-6 μm e pegue as seções em uma lâmina carregada à temperatura ambiente¹⁹.
11. Depois que o tecido for coletado, armazene a lâmina de -20 °C a -80 °C até que esteja pronta para colorir. Não deixe descongelar até que esteja pronto para começar a manchar.
12. Antes da coloração, remova a(s) lâmina(s) do armazenamento e deixe aquecer até a temperatura ambiente. Não deixe as seções secarem.
13. Uma vez em temperatura ambiente, lave imediatamente as seções com PBS por 5 min duas vezes em temperatura ambiente para eliminar o composto OCT.
14. Prossiga para a seção 12.

12. Coloração de imunofluorescência

1. Contorne as seções de tecido com uma caneta marcadora de barreira hidrofóbica. Mantenha pelo menos 5 mm de distância do tecido ao contorno da barreira hidrofóbica.
2. Adicione 50 μL de tampão de bloqueio contendo 3% de soro de burro e 0,1% de Triton em albumina de soro bovino a 1% / solução salina tamponada com Tris (TBS) no topo da seção e incube por 1 h em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
3. Diluir os anticorpos primários com PBS na concentração apropriada. Para detecção de citocinas, use 50 μL de soluções de anticorpos primários direcionados contra TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) e CTGF (1:200). Para marcar miofibroblastos, use 50 μL de uma solução do anticorpo primário direcionado contra a actina do músculo liso alfa (α-SMA) conjugada com Cy3 a 1:200.
4. Remova a solução de bloqueio e adicione os anticorpos primários à seção, garantindo que ela não vaze do contorno hidrofóbico circular e incube durante a noite a 4 ° C em uma câmara umidificada. Reaplique a barreira hidrofóbica se ocorrer vazamento.
5. Lave 3x com PBS por 5 min.
6. Diluir os anticorpos secundários apropriados a 1:200 com PBS.
7. Incubar as amostras com 50 μL de soluções de anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
8. Lave com PBS por 5 min.
9. Lectina de lótus tetragonolobus diluída (LTL) conjugada com fluoresceína em PBS com Ca²⁺ e Mg²⁺ na concentração de 10 μg/mL.
   NOTA: Ca²⁺ e Mg²⁺ são necessários para a ligação LTL.
10. Incubar os tecidos com 50 μL de solução LTL por 30 min em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
11. Lave com PBS com Ca²⁺ e Mg²⁺ por 5 min.
12. Incubar com 50 μL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 5 μg/mL em água) para corar DNA/núcleos por 5 min em temperatura ambiente.
13. Monte as lamínulas adicionando 20 μL de reagente de montagem antidesbotamento no tecido e colocando lentamente a lamínula. Aguarde 24 h para que o reagente antidesbotamento solidifique antes de fazer a imagem.
    NOTA: A ligação da lectina pode se degradar com o tempo, resultando em perda de sinal. É melhor obter imagens de amostras coradas com lectina logo após a configuração do reagente de montagem. Se for observada perda de sinal, Ca²⁺ e Mg²⁺ podem ser adicionados ao reagente de montagem para preservar a coloração.

13. Aquisição de imagem

1. Ligue o microscópio invertido (consulte a Tabela de Materiais) com um estágio XY automatizado.
2. Selecione o objetivo 20x.
3. Abra o software de aquisição de imagem (consulte a Tabela de Materiais).
4. Clique em Ao vivo para abrir a janela de visualização ao vivo.
5. Encontre a seção de tecido e certifique-se de que esteja em foco.
6. Clique no menu Adquirir e selecione Digitalizar imagem grande.
7. Na janela Digitalizar imagem grande , configure a área a ser digitalizada movendo o palco usando o joystick para a parte mais à esquerda da seção de tecido e clique na seta para a esquerda. Repita para os segmentos de tecido superior, direito e inferior.
8. Clique no menu de aquisição .
9. Certifique-se de que a caixa de seleção para imagem grande esteja marcada.
   1. Se estiver capturando imagens multicanal, clique na guia Lambda .
   2. Clique em cada canal e defina o tempo de exposição para um nível em que a coloração seja aparente sem saturação de qualquer parte da imagem.
      NOTA: Essas configurações precisam ser consistentes dentro de um grupo experimental. Alterar as configurações de aquisição entre amostras levará a resultados imprecisos.
   3. Repita a etapa 9.2 para cada canal a ser coletado.
10. Clique em Digitalizar.

14. Análise de imagem

1. Abra o software de aquisição de imagem.
2. Clique em Arquivo | Abra e selecione a imagem.
3. Clique com o botão direito do mouse na janela da imagem e escolha a região de interesse poligonal (ROI).
4. Descreva o ROI com a ferramenta à mão livre . Descreva as células tubulares positivas para LTL ou células intersticiais positivas para α-SMA.
5. Clique na guia Medição | Limiar.
6. Configure os limites superior e inferior do limite ajustando os controles deslizantes para ambos os lados da área de sinal positivo.
7. Clique na guia ROI .
8. Clique no ícone Exportar para salvar os valores. Use um software de planilha para calcular a porcentagem de área de sinal positivo/área de ROI.

15. Alternativa: Análise de imagem com software livre (ImageJ)

1. Abra o ImageJ.
2. Clique em Arquivo | Abra para ver uma imagem.
3. Clique em seleções à mão livre.
4. Selecione o ROI delineando com a ferramenta à mão livre . Descreva as células tubulares positivas para LTL ou células intersticiais positivas para α-SMA.
5. Clique no menu Editar e selecione Limpar fora.
6. Clique em Analisar e selecione Medir para determinar a área de ROI.
7. Ir para a imagem | Cor | Canais divididos.
8. Ajuste os limites superior e inferior do limite para detectar a área do sinal positivo.
9. Clique em Analisar e selecione Medir.
10. Salve os dados.
11. Abra os dados com o software de planilha e calcule a relação entre a área do sinal positivo/área do ROI.

16. Opcional: Imagem latente com microscópio confocal da exploração do laser

NOTA: Para obter imagens de maior resolução para publicação, a microscopia confocal de varredura fornece imagens mais nítidas e fundo reduzido no tecido renal.

1. Ligue o microscópio confocal de varredura a laser (consulte a Tabela de Materiais).
2. Selecione a objetiva 40x (consulte a Tabela de Materiais).
3. Clique na guia Localizar e encontre os tecidos ajustando o foco.
4. Vá para a guia Aquisição , clique em Canais e escolha 1 UA na configuração pinhole.
5. Ajuste a intensidade de ganho do laser em cada canal de forma que o sinal positivo seja visível, mas não saturado. Certifique-se de que as configurações em um conjunto de amostras experimentais permaneçam constantes.
6. Clique em Ajustar e salve a imagem no formato desejado.

17. Nível de BUN plasmático

1. Retirar as amostras a -20 °C e descongelá-las sobre gelo.
2. Diluir o plasma com dH₂O na proporção de 1:10.
3. Para cada amostra, configure três reações separadas em duplicata em uma placa de 96 poços.
   1. Para amostra mais padrão, adicione 5 μL de ureia de 200 mg / dL e 20 μL de plasma diluído.
   2. Apenas para a amostra, adicionar 5 μL de dH₂O e 20 μL de plasma diluído.
   3. Para o branco da amostra, adicionar 5 μL de dH₂O e 20 μL de plasma diluído.
4. Misturar 85 μl do reagente + 1 μl de urease por amostra para preparar a solução de trabalho.
5. Adicionar 80 μL da solução de trabalho aos alvéolos «amostra mais padrão» e «amostra isolada».
6. Adicionar 80 μL do reagente (sem urease) ao alvéolo «amostra em branco» do passo 17.3 acima.
7. Bata suavemente no prato para misturá-lo e incubá-lo por 5 min em temperatura ambiente.
8. Leia o OD₅₆₀ com um leitor de placas.
9. Calcule a concentração de ureia Eq (1) e converta-a em BUN usando Eq (2).
   Ureia (mg/dL) = (Amostra isolada-Amostra em branco)/(Amostra-Padrão isoladamente) x (Padrão/4) x (fator de diluição) (1)
   BUN (mg/dL) = Concentração de ureia/2,14 (2)
   NOTA: Este ensaio mede o teor de ureia (peso molecular: 60) do soro; no entanto, o BUN faz referência apenas ao teor de nitrogênio da ureia (peso molecular: 28). Assim, uma correção de 2,14 (60/28) é necessária para converter a concentração de ureia em BUN.

Para examinar o papel das células epiteliais tubulares na produção de citocinas após LRA induzida por cisplatina, a cisplatina foi injetada a uma concentração de 20 mg / kg, seguida por uma injeção intravenosa de 0,25 mg de BFA no dia 3 após a injeção de cisplatina. Os rins foram colhidos 6 h depois. Os rins embebidos em parafina foram seccionados e corados com TGF-β, PDGF-D e CTGF, citocinas representativas responsáveis pelo reparo tecidual na LRA. Conforme mostrado na Figura 2A, vesículas TGF-β⁺ são observadas em PTCs marcados com LTL em rins tratados com cisplatina na presença de BFA. Enquanto isso, vesículas TGF-β⁺ não foram observadas em rins não lesionados ou não tratados com BFA.

A quantificação revelou um aumento na área de TGF-β1⁺ com o tratamento com BFA na LRA induzida por cisplatina (Figura 2B). Semelhante ao TGF-β, as vesículas PDGF-D⁺ ou CTGF⁺ também se acumularam com o tratamento com BFA na LRA induzida por cisplatina (Figura 2C e Figura 2E). A quantificação demonstrou que as áreas de PDGF-D⁺ e CTGF⁺ foram significativamente aumentadas com BFA em PTCs LTL⁺ (Figura 2D e Figura 2F). Para estudar o efeito do tratamento com BFA na função renal, os níveis plasmáticos de ureia foram medidos no dia 3 após a injeção de cisplatina. Conforme mostrado na Figura 2G, a injeção de BFA não aumentou significativamente os níveis plasmáticos de BUN.

Em seguida, para investigar quais citocinas são secretadas por células intersticiais na LRA induzida por cisplatina, os rins foram corados para TGF-β ou CTGF, e os miofibroblastos intersticiais foram marcados por α-SMA. Conforme mostrado na Figura 3A, vesículas ^TGF-β+ foram observadas em células intersticiais marcadas com α-SMA em cisplatina-LRA com tratamento com BFA (Figura 3A). Para quantificar o sinal dentro das células α-SMA⁺ , a área α-SMA⁺ foi delineada e os sinais positivos de citocinas e α-SMA foram quantificados dentro da área. A quantificação revelou que a área de TGF-β⁺ na área de α-SMA⁺ aumentou significativamente com o tratamento com BFA na LRA de cisplatina (Figura 3B). As vesículas CTGF⁺ também aumentaram com o tratamento com BFA (Figura 3C), e a quantificação demonstrou que o tratamento com BFA aumentou a proporção de área CTGF⁺ /área α-SMA⁺ na LRA induzida por cisplatina (Figura 3D).

Para determinar se o tratamento com BFA pode ser usado em modelos de lesão renal crônica, a lesão renal foi induzida por meio de três doses de AA, que induz LRA que evolui para uma lesão crônica com fibrose renal madura e é clinicamente relevante para a DRC humana. O BFA foi injetado no dia 42 após a injeção de AA, e os rins foram colhidos 6 h depois. Em comparação com a lesão induzida pela cisplatina, as vesículas de ^TGF-β+ nos PTCs foram muito menores na fase crônica da AA. Houve coloração positiva mínima em PTCs LTL⁺ ; no entanto, a intensidade do sinal de TGF-β em PTCs positivos para molécula de lesão renal 1 (KIM-1⁺) aumentou com o tratamento com BFA (Figura 3E). O nível médio de intensidade de TGF-β foi 3 vezes maior com a injeção de BFA do que sem BFA (Figura 3F). Esse achado indica que a injeção in vivo de BFA pode ser usada para coloração de imunofluorescência e em combinação com outros marcadores para avaliar a produção de citocinas de maneira específica do tipo de célula.

Figura 1: Representação esquemática do modo de ação BFA. (A) O BFA bloqueia o transporte de ER-para-Golgi de vesículas contendo proteínas a serem secretadas, como TGF-β. (B) O BF induz um acúmulo de citocinas intracelulares, como o TGF-β, nas células epiteliais tubulares renais. (C) Seção transversal esquemática de uma cauda de rato. As veias laterais são as mais acessíveis para injeção. Abreviaturas: BFA = brefeldina A; ER = retículo endoplasmático; TGF-β = fator de crescimento transformador-beta; BFA- = BFA-negativo; BFA+ = BFA-positivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A imunofluorescência com injeção de BFA detecta vesículas ricas em citocinas em células epiteliais tubulares após lesão renal aguda induzida por cisplatina. (A) Imagens representativas de vesículas TGF-β⁺ no dia 3 após cisplatina (20 mg/kg) ou administração de solução salina. Barra de escala = 20 μm. As setas indicam vesículas de TGF-β⁺ em PTCs. (B) Quantificação de vesículas/túbulos de TGF-β⁺ em solução salina (n = 5), solução salina + BFA (n = 5), Cis (n = 5), Cis + BFA (n = 5). (C) Imagens representativas de vesículas PDGF-D no dia 3 após cisplatina (20 mg/kg) ou administração salina. Barra de escala = 20 μm. (D) Quantificação de vesículas/túbulos PDGF-D⁺ em solução salina (n = 4), solução salina + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (E) Imagens representativas de vesículas CTGF⁺ no dia 3 após cisplatina (20 mg/kg) ou administração salina. Barra de escala = 20 μm. (F) Quantificação de vesículas/túbulos CTGF⁺ em solução salina (n = 4), solução salina + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (G) Nível plasmático de ureia no dia 3 após a administração de cisplatina (20 mg/kg): Cisplatina (Cis) (n = 7) e cisplatina + BFA (Cis + BFA) (n = 3). Os dados são apresentados como médias ± DP. * p < 0,05, **p < 0,01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. As regiões delimitadas por caixas brancas tracejadas são mostradas no painel de inserção de maior ampliação. Abreviaturas: BFA = brefeldina A; TGF-β = fator de crescimento transformador-beta; Cis = cisplatina; PDGF-D = fator de crescimento derivado de plaquetas-D; CTGF = fator de crescimento do tecido conjuntivo; BUN = nitrogênio ureico no sangue; LTL = lectina de lótus tetragonolobus; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; HM = Alta ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Vesículas ricas em citocinas observadas em miofibroblastos após lesão renal aguda induzida por cisplatina e células epiteliais tubulares na fase crônica da nefropatia ácida aristolóquica. (A) Imagens representativas de vesículas TGF-β⁺ no dia 3 após cisplatina (20 mg/kg) ou administração de solução salina. Barra de escala = 20 μm. As setas indicam vesículas TGF-β⁺ em células intersticiais a-SMA⁺ . (B) Quantificação da área de TGF-β⁺ /área α-SMA⁺ em solução salina (n = 4), solução salina + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (C) Imagens representativas de vesículas CTGF⁺ no dia 3 após cisplatina (20 mg/kg) ou administração salina. Barra de escala = 20 μm. As setas indicam vesículas CTGF⁺ em células intersticiais a-SMA⁺ . (D) Quantificação da área CTGF⁺ /área α-SMA⁺ em solução salina (n = 4), salina + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (E) Imagens representativas do rim corado com TGF-β (vermelho) na nefropatia crônica por ácido aristolóquico. Barra de escala = 20 μm. (F) Quantificação da intensidade do sinal TGF-β⁺ / KIM-1⁺ PTCs em AAN (n = 6) e AAN + BFA (n = 6). Os dados apresentados como médias ± DP. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p < 0,0001. As regiões delimitadas por caixas brancas tracejadas são mostradas no painel de inserção de maior ampliação. Abreviaturas: BFA = brefeldina A; TGF-β = fator de crescimento transformador-beta; α-SMA = actina alfa-músculo liso; Cis = cisplatina; CTGF = fator de crescimento do tecido conjuntivo; KIM-1 = molécula de lesão renal-1; LTL = lectina de lótus tetragonolobus; AAN = nefropatia por ácido aristolóquico; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; HM = alta ampliação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sabe-se que os PTCs renais regulam a LRA e a DRC por meio da secreção de TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, fator de crescimento endotelial vascular, bem como muitas outras proteínas 20,21,22,23. Da mesma forma, glomérulos, túbulos distais e outras células epiteliais renais, bem como células intersticiais, secretam essas e/ou outras proteínas durante a lesão 24,25,26. A contribuição relativa de cada um desses tipos de células na secreção de citocinas é difícil de elucidar, pois as citocinas são secretadas logo após serem produzidas. Embora a hibridização in situ e outras técnicas de coloração de RNA possam ser usadas para corar o RNA de proteínas secretadas, é difícil combinar essas técnicas com a coloração de marcadores específicos de tipo de célula ou marcadores de lesão. Alternativamente, muitos estudos combinam achados in vivo com experimentos in vitro realizados em células renais cultivadas. Nesse caso, os dados de lesão renal estão associados aos dados de secreção de citocinas de células cultivadas para tirar conclusões, o que limitou a traduzibilidade para a situação in vivo.

O advento do sequenciamento de nova geração e do RNAseq de célula única permitiu a classificação dos tipos celulares pela expressão gênica e a identificação de outros genes expressos por cada tipo de célula²⁷. Embora isso forneça detalhes requintados em uma base populacional, muitas vezes deixa de fora muitos dos dados anatômicos e patológicos que podem ser obtidos a partir de seções renais. Além disso, o sequenciamento de célula única geralmente identifica apenas os principais 3.000-7.000 genes expressos em cada célula, o que pode não fornecer profundidade suficiente para rastrear todas as citocinas de interesse²⁸. Este artigo oferece uma alternativa a essas abordagens. Usando BFA para bloquear a secreção de proteínas, o tecido renal pode ser corado diretamente para citocinas e outras proteínas de interesse, incluindo marcadores de tipo de célula usando técnicas imunofluorescentes padrão.

TGF-β, PDGF-D e CTGF estão entre as citocinas mais amplamente estudadas na lesão renal. Todos os três são conhecidos por atuarem como facas de dois gumes, promovendo a recuperação após LRA e contribuindo para a progressão da fibrose na DRC^29,30. Embora se saiba que as células epiteliais dos túbulos renais e as células intersticiais podem potencialmente secretar TGF-β, PDGF-D e CTGF na lesão renal, identificar diretamente qual tipo de célula e a produção relativa continua sendo um desafio. No presente estudo, optamos por corar TGF-β, PDGF-D e CTGF nos rins durante a LRA induzida por cisplatina e TGF-β no modelo AAN CKD, juntamente com o marcador PTC LTL, marcador de lesão PTC KIM-1 ou o marcador de miofibroblastos α-SMA. Isso permitirá determinar se os PTCs ou miofibroblastos produzem essas citocinas e os níveis de expressão relativa entre os grupos experimentais.

Em camundongos tratados apenas com BFA, houve pouca ou nenhuma coloração positiva de qualquer citocina. Da mesma forma, o tratamento com cisplatina induziu apenas um aumento marginal na coloração de citocinas. A combinação de lesão de cisplatina com tratamento com BFA por 6 h resultou em um aumento dramático nos sinais positivos intracelulares de todas as três citocinas, indicando que essas citocinas são normalmente secretadas. Da mesma forma, apenas o grupo cisplatina + BFA apresentou um aumento significativo do sinal de TGF-β e CTGF nas células intersticiais α-SMA⁺. No modelo AAN crônico, no qual o TGF-β está associado a uma resposta patológica, a injeção de AA sozinha induziu alguma coloração de TGF-β, particularmente ^{em PTCs} KIM-1+ lesionados. O tratamento com BFA aumentou o sinal intracelular positivo em PTCs KIM-1⁺ (os PTCs são as únicas células do túbulo renal conhecidas por expressar KIM-1³¹). Curiosamente, os PTCs LTL⁺ KIM-1⁺ ou LTL⁺ KIM-1^- não mostraram coloração significativa de TGF-β, enquanto os PTCs ^LTL-KIM-1+ tiveram mais positividade para TGF-β. A perda da coloração LTL sugere que os PTCs que expressam níveis mais altos de TGF-β são lesados e desdiferenciados na fase crônica da lesão. Esse fenótipo é provavelmente o reparo mal-adaptativo descrito anteriormente^32,33. Assim, o tratamento com BFA demonstra que o TGF-β é expresso em PTCs após LRA e durante a DRC.

Embora o estudo atual esteja focado na coloração imunofluorescente, é importante observar que o tratamento com BFA pode ser combinado com outros ensaios. Por exemplo, se o experimento não exigir a identificação do tipo de célula que secreta a proteína de interesse, pode-se injetar BFA e realizar um immunoblot ou ELISA em lisados renais inteiros em grupos controle versus experimental. Outro ensaio que pode ser considerado é a citometria de fluxo. O tratamento com BFA tem sido combinado com citometria de fluxo em estudos imunológicos para determinar a produção relativa de citocinas em diferentes tipos celulares¹⁵. Embora a separação das células epiteliais renais do tecido renal em células únicas possa ser desafiadora, a citometria de fluxo pode ser uma alternativa em laboratórios que possuem a técnica estabelecida. Além disso, o tratamento com BFA pode ser usado para estudos de cultura de células in vitro em todos os ensaios listados acima.

O estudo atual descreve dois dos métodos de preparação de tecido mais comuns, tecido fixado embebido em parafina e tecido congelado, que funcionam bem para os anticorpos usados no estudo. Dada a natureza variável dos anticorpos, no entanto, é provável que os pesquisadores que adotam essa técnica sejam obrigados a padronizar ainda mais os protocolos de coloração ou o processamento de tecidos, dependendo do anticorpo. Como as citocinas são normalmente secretadas, poucos anticorpos anticitocinas são testados para coloração no tecido. Para agilizar a padronização do protocolo, recomendamos a geração de controles positivos nos quais órgãos conhecidos por secretar as citocinas de interesse são colhidos após o tratamento com BFA. Por exemplo, baços de animais tratados com lipopolissacarídeos e BFA podem servir como tecido de controle positivo para muitas citocinas diferentes. A coleta de baços e o processamento como tecido embebido em parafina ou congelado permitiriam uma padronização mais rápida da concentração de anticorpos e tampões. Além disso, se os anticorpos anticitocinas foram caracterizados para corar citocinas em sua conformação nativa in vitro, é mais provável que esses anticorpos reconheçam seu alvo no tecido congelado menos processado.

Embora o tratamento com BFA possa ser uma ferramenta poderosa ao medir as proteínas secretadas, ele não é isento de limitações. A limitação mais aparente é que a proteína secretada que está sendo analisada deve seguir a rota de secreção ER-Golgi; caso contrário, o BFA pode ter efeito limitado. Outra limitação é que os animais tratados com BFA podem ter resultados alterados em outros ensaios experimentais. Por exemplo, alguns biomarcadores de lesão renal, como o KIM-1, dependem do transporte ER-Golgi para serem apresentados na superfície celular. Assim, os níveis de KIM-1 na urina provavelmente serão reduzidos em animais tratados com BFA. Além disso, existe a preocupação de que o BFA possa levar ao aumento do estresse celular. Embora essa preocupação possa ser mitigada reduzindo o tempo de tratamento com BFA, ela deve ser considerada. Não foi observado aumento significativo no BUN neste estudo; no entanto, houve um aumento de ~ 10%. Assim, deve-se ter cuidado ao decidir outros alvos ou marcadores a serem analisados em animais tratados com BFA.

Este estudo demonstra que o BFA pode ser utilizado para bloquear a secreção de proteínas, levando ao acúmulo intracelular de citocinas, que podem ser coradas por técnicas padrão de imunofluorescência. Isso permite a identificação dos tipos de células que secretam citocinas específicas ou outras proteínas e a quantificação da produção de citocinas por essas células. A outra vantagem desse protocolo é que os dados histológicos e patológicos podem ser preservados e analisados no mesmo corte seriado ou em cortes seriados vizinhos. Assim, o tratamento com BFA fornece uma abordagem econômica e relativamente simples para estudar a produção de citocinas no tecido renal.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Associação Americana do Coração (AHA): Kensei Taguchi, 20POST35200221; HHS | NIH | Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK): Craig Brooks, DK114809-01 DK121101-01.