זיהוי מקור החלבונים המופרשים בכליה על ידי הזרקת ברפלדין A

זיהוי סוג התא האחראי על הפרשת ציטוקינים הכרחי להבנת הפתוביולוגיה של מחלת כליות. כאן, אנו מתארים שיטה לצביעה כמותית של רקמת כליה עבור ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי אפיתל או אינטרסטיציאליים של הכליה באמצעות ברפלדין A, מעכב הפרשה, וסמנים ספציפיים לסוג התא.

מחלת כליות כרונית (CKD) היא אחד מעשרת גורמי המוות המובילים בארה"ב. פגיעה כלייתית חריפה (AKI), למרות שלעתים קרובות ניתנת להחלמה, נוטה לחולים ל-CKD בשלב מאוחר יותר בחיים. תאי אפיתל בכליות זוהו כצמתי איתות מרכזיים הן ב-AKI והן ב-CKD, לפיהם התאים יכולים לקבוע את מהלך המחלה באמצעות הפרשת ציטוקינים וחלבונים אחרים. במיוחד ב-CKD, מספר קווי ראיות הראו שתאים צינוריים שתוקנו באופן לא אדפטיבי מניעים את התקדמות המחלה באמצעות הפרשת גורם גדילה טרנספורמטיבי-בטא (TGF-β), גורם גדילת רקמת חיבור (CTGF) וציטוקינים פרוברוטיים אחרים. עם זאת, זיהוי המקור והמספר היחסי של חלבונים המופרשים מסוגי תאים שונים in vivo נותר מאתגר.

מאמר זה מתאר טכניקה המשתמשת בברפלדין A (BFA) למניעת הפרשת ציטוקינים, המאפשרת צביעה של ציטוקינים ברקמת הכליה באמצעות טכניקות אימונופלואורסצנטיות סטנדרטיות. BFA מעכב הובלת מנגנון רשתית אנדופלזמית (ER) לגולגי, הנחוצה להפרשת ציטוקינים וחלבונים אחרים. הזרקת BFA 6 שעות לפני ההקרבה מובילה להצטברות של TGF-β, PDGF ו-CTGF בתוך תאי הצינורית הפרוקסימליים (PTCs) במודל ציספלטין של עכבר של AKI ו-TGF-β במודל חומצה אריסטולוצ'ית (AA) של עכבר של CKD. הניתוח גילה כי BFA + ציספלטין או BFA + AA הגדילו את האות החיובי ל-TGF-β באופן משמעותי בהשוואה ל-BFA + מי מלח, ציספלטין או AA בלבד. נתונים אלה מצביעים על כך שניתן להשתמש ב-BFA כדי לזהות את סוג התא המייצר ציטוקינים ספציפיים ולכמת את הכמויות היחסיות ו/או הסוגים השונים של ציטוקינים המיוצרים.

ההערכה היא כי >10% מאוכלוסיית העולם סובלים ממחלת כליות^{כלשהי 1}. מוגדר על ידי הופעתו המהירה, AKI ניתן לריפוי במידה רבה; עם זאת, אפיזודה של AKI יכולה לגרום לחולים לפתח CKD בשלב מאוחר יותר בחיים ^2,3. בניגוד ל-AKI, CKD מאופיינת בפיברוזיס מתקדם והחמרה בתפקוד הכליות, מה שמוביל למחלת כליות סופנית הדורשת טיפול תחליפי כליה. רוב הפגיעות בכליות מכוונות לתאי האפיתל המתמחים, כגון פודוציטים או תאי צינורית פרוקסימליים, המרכיבים את הנפרון ^4,5. לאחר הפציעה, תאי האפיתל ששרדו עוזרים לתאם את תגובת התיקון באמצעות הפרשת ציטוקינים וחלבונים אחרים. בדרך זו, התאים השורדים יכולים לווסת את התגובה החיסונית, לכוון עיצוב מחדש של מטריצה חוץ-תאית ולסייע בהתאוששות האיברים.

ציטוקינים הם חלבונים קטנים ומופרשים החיוניים לוויסות ההתבגרות, הצמיחה וההיענות של אורגניזמים רב-תאיים ^6,7. הם מתפקדים כשליחי אותות בין סוגי תאים שונים, כולל תאי חיסון ותאי אפיתל⁸. למרות שציטוקינים נחשבים מופרשים בעיקר על ידי תאי חיסון, מחקר ארוך שנים הראה שתאי אפיתל כליה ותאי ביניים מפרישים גם ציטוקינים כאותות לתאי כליה תושבים אחרים, כגון תאי צינורית, תאי ביניים ותאי חיסון ^9,10. PTCs, במיוחד, ממלאים תפקיד חשוב בשלב ההתחלה וההתאוששות לאחר AKI¹¹. עם זאת, ידוע כי PTCs שתוקנו באופן לא אדפטיבי מפרישים ציטוקינים פרופיברוטיים כגון גורם גדילה טרנספורמטיבי-β (TGF-β), גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF-D) וגורם גדילת רקמת חיבור (CTGF), התורמים להתקדמות CKD¹². לפיכך, תאי אפיתל בכליות משתמשים בציטוקינים המופרשים כדי לווסת את הפגיעה בכליות.

בעוד שידוע שתאי אפיתל בכליות מפרישים ציטוקינים, קשה היה לקבוע את המקור המדויק והתרומה היחסית של כל סוג תא בשל האתגרים הטכניים של חקר חלבונים מופרשים¹³. זרימה ציטומטרית, גישה נפוצה המשמשת למדידת ציטוקינים, מאתגרת לביצוע בכליות פגועות, במיוחד בכליות פיברוטיות מאוד. עם Cre recombinase המונע על ידי מקדם ציטוקינים, עכברים מדווחים על ציטוקינים משמשים לעתים קרובות לזיהוי סוג התא המבטא ציטוקין נתון. עם זאת, השימוש בעכברים מדווחים מוגבל בגלל הדרישה להצליב עכברים מדווחים לרקעים שונים של נוק-אאוט, היעדר מדווחים מתאימים והעובדה שניתן לנתח רק ציטוקין אחד בכל פעם. לפיכך, יש צורך לפתח טכניקה פשוטה, רב-תכליתית ובמחיר סביר לאיתור תאי כליה משחררי ציטוקינים.

שיערנו כי הזרקת BFA, מעכב הפרשה החוסם את הובלת הרטיקולום-גולגי האנדופלזמית in vivo תאפשר צביעה של חלבונים המופרשים ברקמת הכליה (איור 1A,B), כפי שמוצג במבחנים מבוססי ציטומטריית זרימה^14,15. יחד עם יצרנים ספציפיים לסוג התא, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות את המקור והתרומה היחסית של תאים מייצרי ציטוקינים בכליות פגועות. בניגוד לדגימות לציטומטריית זרימה, ניתן לשמור על רקמות קבועות לטווח ארוך עם שימור חלבונים ומבנים תאיים, מה שמאפשר חקירה יסודית יותר של תאי ההפרשה. כדי לבחון השערה זו, כליות עכבר נפגעו במודל של AKI (ציספלטין) ומודל של CKD (נפרופתיה של חומצה אריסטולוצית (AAN)), שהוזרקו עם BFA, ונצבעו בטכניקות אימונו-פלואורסצנטיות סטנדרטיות.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול השימוש בבעלי חיים שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ומשתמשים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.

1. בעלי חיים

1. השתמש בעכברים זכרים BALB/c בני 8-12 שבועות (משקל גוף: כ-25 גרם) לנפרופתיה הנגרמת על ידי ציספלטין או חומצה אריסטולוכית.
2. ודא שהעכברים בריאים ואין להם סימני מצוקה או פציעות ברורים מהלחימה.
   הערה: פצעים, במיוחד בזנב, עלולים להפריע לפרוטוקול המתואר כאן. עכברי BALB/c נבחרו מכיוון שקל יותר לדמיין את וריד הזנב להזרקה בעכברים אלה. הפרוטוקול המתואר כאן עובד עבור זני עכברים אחרים; עם זאת, המינון של ציספלטין או חומצה אריסטולוצ'ית עשוי להשתנות מזן לזן.

2. הזרקת ציספלטין

1. ממיסים ציספלטין במי מלח סטריליים לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
   הערה: ציספלטין לא יתמוסס לחלוטין בטמפרטורת החדר. יש לטפל בזה במכסה אדים.
2. מחממים את תמיסת הציספלטין באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ומערבולת שוב ושוב עד שהציספלטין נמס לחלוטין.
3. שקלו את העכברים וחשבו את נפח תמיסת הציספלטין הדרושה להזרקת 20 מ"ג/ק"ג משקל גוף (bw).
4. חיטוי עור הבטן באמצעות ספוגיות פובידון-יוד (7.5%) ואלכוהול (70%) לסירוגין פי 3 כל אחת.
5. בעזרת מזרק אינסולין עם מחט 25 גרם, הזריק את תמיסת הציספלטין תוך צפקית.
6. המשך לסעיף 4 ביום השלישי לאחר ההזרקה.

3. הזרקת חומצה אריסטולוצ'ית (AA).

1. ממיסים חומצה אריסטולוצ'ית-I בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) בריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל.
   הערה: יש לטפל ב-AA במכסה אדים. יש להשתמש ב-AA-I מכיוון שזו הצורה הדומיננטית הגורמת לפגיעה בכליות.
2. מחממים את תמיסת ה-AA באמבט מים ב-37 מעלות צלזיוס ומערבולת שוב ושוב עד להמסה מלאה.
3. שקלו את העכברים וחשבו את נפח תמיסת ה-AA להזרקת 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף.
4. חיטוי עור הבטן באמצעות ספוגית פובידון-יוד (7.5%) ואלכוהול (70%) פי 3.
5. בעזרת מזרק אינסולין עם מחט 25 גרם, הזרקו את תמיסת ה-AA תוך צפקית.
6. יש להזריק AA כל יומיים ובסך הכל 3 זריקות.
7. המשך לסעיף 4 ביום ה-42 לאחר הזריקה האחרונה.

4. הכנת תמיסת BFA

1. ממיסים BFA בדימתילסולפוקסיד בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל ליצירת תמיסת מלאי.
2. אחסן את תמיסת המלאי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. יש לדלל את תמיסת ה-BFA עם PBS סטרילי בריכוז העבודה הסופי של 1.25 מ"ג/מ"ל
   הערה: הכינו תמיסת עבודה טרייה בכל פעם מיד לפני ההזרקה.

5. הזרקת וריד זנב של BFA

1. לפני ההזרקה, הניחו את הכלוב חצי על כרית חימום למשך 10 דקות כדי להבטיח שהעכברים חמים כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף, שעלולה לגרום להתכווצות כלי דם בזנב ולהפריע להזרקה.
   הערה: הנח את הכלוב על כריות החימום כך שחצי מהכלוב יהיה על הכרית ואילו חצי לא. כך, כאשר העכברים מרגישים חמים, הם יכולים לעבור לצד השני של הכלוב ולהיפך.
2. רסן את העכברים באמצעות התקני ריסון זמינים מסחרית בגודל מתאים.
3. יש לחטא את הזנב באמצעות ספוגית פובידון-יוד ואלכוהול שלוש פעמים כמתואר לעיל.
4. החזיקו את הזנב בצורה אופקית ודמיינו את ורידי הזנב הצדדיים (איור 1C). השתמש במקור אור מתחת לזנב כדי לעזור לדמיין את הוורידים.
5. הכנס מחט 28 גרם, תוך שמירה על המחט והמזרק מקבילים לווריד לכיוון הראש.
6. יש להזריק 200 מיקרוליטר מתמיסת BFA של 1.25 מ"ג/מ"ל (0.25 מ"ג BFA). המתן עד שהווריד יתבהר כאשר הדם מוחלף בתמיסת ההזרקה, מה שמעיד על כך שההזרקה הצליחה.
7. הסר את המחט ולחץ בעדינות על הזנב עד שהדימום ייפסק.
8. החזירו את העכברים לכלוב ועקבו אחריהם לאיתור דימום נוסף או סימני מצוקה.

6. הקרבה וקציר של הכליות

1. המתת חסד של העכברים עם מנת יתר של איזופלורן ואחריה פריקת צוואר הרחם 6 שעות לאחר הזרקת BFA.
   הערה: נקודת הזמן של 6 שעות נבחרה על סמך ספרות המדגימה כי 6 שעות של טיפול ב-BFA באיברים אחרים מאפשר הצטברות מספקת של ציטוקינים בתוך התאים כדי לדמיין אותם על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית¹⁶.
2. מיד לאחר ההקרבה, חשוף את הבטן והלב של העכבר על ידי חתך בקו האמצע הגחוני.
3. אסוף 100-500 מיקרוליטר דם לבדיקת חנקן אוריאה בדם (BUN) על ידי ניקוב לב. השתמש במחטים של 25 גרם עם מזרקי אינסולין של 1 מ"ל כדי לאסוף את הדם. כדי למנוע קרישה, הוסף 5 מיקרוליטר של תמיסת הפרין (100 מ"ג/15 מ"ל של dH₂O) לכל דגימה.
   הערה: יש צורך במינימום של 20 מיקרוליטר דם לבדיקת BUN; עם זאת, ניתן לאסוף כ-500 מיקרוליטר על ידי ניקור לב לאחר המתת חסד, מה שיכול להיות שימושי לבדיקות אחרות. אסוף כמה שיותר דם.
4. אחסן את דגימות הדם על קרח עד לאיסוף הכליות בסעיף 7 להלן.
   1. צנטריפוגה את דגימות הדם ב-1,300 × גרם למשך 10 דקות.
   2. בודד את הפלזמה בעדינות ואחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שתהיה מוכנה לבצע את בדיקת ה-BUN בסעיף 17 להלן. לחלופין, אחסן את דגימות הפלזמה לבדיקות קריאטינין.

7. זלוף והסרת הכליות

1. החדרו את העכבר עם 10-20 מ"ל PBS דרך החדר השמאלי באמצעות מזרק של 20 מ"ל בקצב זרימה של 2-4 מ"ל לדקה עד שהפרפוזה תתבהר.
2. הסר את הכליות על ידי החזקת עורק הכליה והווריד בעזרת מלקחיים קרוב לפפילה וחיתוך כלי הדם בצד הרחק מהכליה.
3. הסר בעדינות את קפסולת הכליה על ידי קילוף ביד או עם זוג מלקחיים עדינים וסטריליים.
4. בהתאם לנוגדן, המשך לסעיף 8 להכנת רקמה קבועה משובצת פרפין או סעיף 10 להכנת רקמה קפואה קבועה.
   הערה: יהיה צורך לבצע אופטימיזציה של עיבוד הרקמות עבור כל נוגדן שישמש לצביעה.

8. רקמה משובצת פרפין לצביעה TGF-β ו-PDGF-D

1. חצו את הכליה על ידי הנחתה על מגלשת זכוכית נקייה וחיתוך אופקית בעזרת סכין גילוח חדש. הנח חצי אחד ב-10 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS למשך 24 שעות על מסובב קצה במהירות של 10 סיבובים לדקה (סל"ד).
   הערה: הכליה כולה אינה נחוצה לחתך. ניתן לאחסן מחצית מהכליה או להשתמש בה לבדיקות אחרות.
2. החלף את ה-PFA ב-70% אתנול.
3. הגש את מחצית הכליה לעיבוד והטמעת פרפין בשלב זה ואז חתך את רקמות הכליה המשובצות בפרפין ב-4-6 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום והרכיב אותן על שקופיות טעונות שנוקו מראש^17,18.
   הערה: הכליות עובדו והוטמעו בפרפין על ידי המשאב המשותף לפתולוגיה תרגומית של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט ואוחסנו בטמפרטורת החדר.

9. דה-פרפיניזציה והתייבשות

1. הנח את השקופיות במתלה צביעת שקופיות וטבל אותן בבאר צביעה המכילה D-לימונן למשך 5 דקות, כדי להבטיח שהרקמה שקועה לחלוטין. יש לחזור על הפעולה בבאר המכילה D-לימונן טרי.
2. החזר את הרקמות על ידי טבילת השקופיות בדילולים סדרתיים של אתנול 100% (2x), 95%, 90% ו-70% למשך 5 דקות כל אחד.
3. שוטפים את השקופיות ב-dH₂O זורם למשך 5 דקות.
4. בצע אחזור אנטיגן על ידי דגירה של החלקים במאגר ציטראט (pH 6.0) בסיר לחץ ב-121 מעלות צלזיוס ו-15 psi למשך 45 דקות.
5. שוטפים את השקופיות ב-dH₂O זורם למשך 20 דקות.
6. המשך לסעיף 12.

10. הכנת רקמה קפואה לצביעה CTGF

1. חצו את הכליה לאורך הציר האופקי בעזרת סכין גילוח טרי.
   הערה: הכליה כולה אינה נחוצה לחתך. ניתן לאחסן מחצית מהכליה או להשתמש בה לבדיקות אחרות.
2. שים את מחצית הכליה ב-10 מ"ל של 0.5% PFA בצינור של 15 מ"ל על מסובב למשך שעתיים ב-4 מעלות צלזיוס במהירות של 10 סל"ד.
3. שפכו את ה-PFA למיכל לסילוק נכון והוסיפו 10 מ"ל של 0.1 מ' גליצין ב-PBS למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס במהירות של 10 סל"ד.
4. רוקנים את הגליצין, מוסיפים 10 מ"ל של 15% סוכרוז מומס ב-PBS, ומניחים את הצינור על מסובב למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס ו-10 סל"ד.
5. רוקנים את 15% הסוכרוז ומחליפים ב-10 מ"ל של 30% סוכרוז מומס ב-PBS למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס ו-10 סל"ד.
6. מלאו את תבנית ההטבעה בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) והטמיעו את חצי הכליה משלב 10.5 כשהמשטח החתוך של הכליה פונה כלפי מטה.
7. מניחים את התבנית המכילה את חצי הכליה וה-OCT בזהירות בבריכה של חנקן נוזלי להקפאה.
   הערה: אל תתנו לחנקן הנוזלי ליצור קשר ישיר עם ה-OCT מכיוון שהדבר עלול לגרום להיווצרות בועה. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בעת שימוש בחנקן נוזלי, כגון משקפי מגן/מגן פנים, כפפות קריוגניות ומעיל מעבדה. עדיף להשתמש במלקחיים ארוכים, ~25 ס"מ, כדי למקם את התבניות בחנקן נוזלי.
8. לאחר הקפאה מוצקה, אחסן את התבנית בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

11. חתך קפוא

1. ודא שהקריוסטט נמצא ב-20 מעלות צלזיוס.
2. אחסן תבניות המכילות דגימות ב-OCT בקריוסטט בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לאזן את הטמפרטורה.
3. הסר את התבנית על ידי החזקת הלשוניות ולחיצה מלמטה.
4. הניחו OCT טרי על מחזיק דגימה והניחו את גוש הדגימה הקפוא מעל, כשצד הרקמה פונה הרחק ממחזיק הדגימה.
5. הנח את מחזיק הדגימה והדגימה על מדף ההקפאה.
6. הנח מחלץ חום משוקלל על גבי הבלוק כדי לשטח את פני השטח. שמור את מכסה הקריוסטט סגור כאשר אינו בשימוש כדי למנוע תנודות טמפרטורה.
7. לאחר שה-OCT הטרי בין בלוק הדגימה למחזיק הדגימה קפוא, בדוק כדי לוודא שהחיבור מאובטח.
8. מהדק את מחזיק הדגימה על ראש המיקרוטום הקריוסטט.
9. התחל לחתוך עד שהרקמה נראית בגוש הדגימה.
10. חתכו את רקמת הכליה ב-4-6 מיקרומטר והרימו את החלקים על שקופית טעונה בטמפרטורת החדר¹⁹.
11. לאחר איסוף הרקמה, אחסן את השקופית בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד -80 מעלות צלזיוס עד שהיא מוכנה להכתמה. אל תאפשר לו להפשיר עד שהוא מוכן להתחיל להכתים.
12. לפני הצביעה, הסר את השקופיות מהאחסון ואפשר להתחמם לטמפרטורת החדר. אל תאפשר לחלקים להתייבש.
13. לאחר טמפרטורת החדר, שטפו מיד את החלקים עם PBS למשך 5 דקות פעמיים בטמפרטורת החדר כדי לחסל את תרכובת ה-OCT.
14. המשך לסעיף 12.

12. צביעה אימונופלואורסצנטית

1. מתאר את קטעי הרקמה בעזרת עט סמן מחסום הידרופובי. שמור על מרחק של לפחות 5 מ"מ מהרקמה למתאר המחסום ההידרופובי.
2. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר חוסם המכיל 3% סרום חמור ו-0.1% טריטון בסרום בקר 1% אלבומין / תמיסת מלח Tris-buffered (TBS) על גבי החלק ודגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
3. לדלל את הנוגדנים העיקריים עם PBS בריכוז המתאים. לזיהוי ציטוקינים, השתמש ב-50 מיקרוליטר של תמיסות של נוגדנים ראשוניים המכוונים כנגד TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) ו-CTGF (1:200). לתיוג מיופיברובלסטים, השתמש ב-50 מיקרוליטר של תמיסה של הנוגדן העיקרי המכוון כנגד אקטין שריר חלק אלפא (α-SMA) מצומד ל-Cy3 בשעה 1:200.
4. הסר את תמיסת החסימה והוסף את הנוגדנים העיקריים לקטע, וודא שהוא לא ידלוף החוצה מהמתאר ההידרופובי המעגלי וידגור למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בתא לח. החל מחדש את המחסום ההידרופובי אם מתרחשת דליפה.
5. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS למשך 5 דקות.
6. יש לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים בשעה 1:200 עם PBS.
7. דגרו את הדגימות עם 50 מיקרוליטר של תמיסות נוגדנים משניות למשך שעה בטמפרטורת החדר בתא לח.
8. שוטפים עם PBS למשך 5 דקות.
9. לקטין לוטוס טטרגונולבוס מדולל (LTL) מצומד עם פלואורסצאין ב-PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺ בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל.
   הערה: Ca²⁺ ו-Mg²⁺ נחוצים לקשירת LTL.
10. דגרו את הרקמות עם 50 מיקרוליטר של תמיסת LTL למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח.
11. יש לשטוף עם PBS עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺ למשך 5 דקות.
12. דגירה עם 50 מיקרוליטר של 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI, 5 מיקרוגרם/מ"ל במים) כדי לצבוע DNA/גרעינים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
13. הרכיבו את החלקות הכיסוי על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של מגיב הרכבה נגד דהייה על הרקמה והנחת הכיסוי באיטיות. המתן 24 שעות עד שהמגיב נגד דהייה יתמצק לפני ההדמיה.
    הערה: קשירת לקטין עלולה להתקלקל עם הזמן, וכתוצאה מכך לאובדן אות. עדיף לדמות דגימות מוכתמות בלקטין זמן קצר לאחר הגדרת מגיב ההרכבה. אם נצפה אובדן אות, ניתן להוסיף Ca²⁺ ו-Mg²⁺ למגיב ההרכבה כדי לשמר את הצביעה.

13. רכישת תמונות

1. הפעל את המיקרוסקופ ההפוך (ראה טבלת החומרים) עם XY אוטומטיtage.
2. בחר את המטרה פי 20.
3. פתח את תוכנת רכישת התמונות (ראה טבלת החומרים).
4. לחץ על שידור חי כדי לפתוח את חלון התצוגה החיה.
5. מצא את קטע הרקמות וודא שהוא בפוקוס.
6. לחץ על התפריט Acquire ובחר סרוק תמונה גדולה.
7. בחלון סריקת תמונה גדולה , הגדר את האזור לסריקה על-ידי הזזת הבמה באמצעות הג'ויסטיק לחלק השמאלי ביותר של מקטע הרקמה ולחץ על החץ שמאלה. חזור על הפעולה עבור מקטעי הרקמה העליונים, הימניים והתחתונים.
8. לחץ על תפריט הרכישה .
9. ודא שתיבת הסימון עבור תמונה גדולה מסומנת.
   1. בשעת צילום תמונות מרובות ערוצים, לחץ על הכרטיסייה Lambda .
   2. לחץ על כל ערוץ והגדר את זמן החשיפה לרמה שבה הצביעה ניכרת ללא רוויה של חלק כלשהו בתמונה.
      הערה: הגדרות אלה צריכות להיות עקביות בתוך קבוצת ניסוי אחת. שינוי הגדרות רכישה בין דגימות יוביל לתוצאות לא מדויקות.
   3. חזור על שלב 9.2 עבור כל ערוץ שייאסף.
10. לחץ על סריקה.

14. ניתוח תמונות

1. פתחו את התוכנה לרכישת תמונות.
2. לחץ על קובץ | פתח ובחר את התמונה.
3. לחץ לחיצה ימנית על חלון התמונה ובחר אזור עניין מצולע (ROI).
4. תאר את ההחזר על ההשקעה עם הכלי ביד חופשית . תאר את תאי הצינורית החיוביים ל-LTL או תאי ביניים חיוביים ל-α-SMA.
5. לחץ על הכרטיסייה מדידה | סף.
6. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של הסף על ידי התאמת המחוונים לכל צד של אזור האות החיובי.
7. לחץ על הכרטיסייה ROI .
8. לחץ על סמל הייצוא כדי לשמור את הערכים. השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את אחוז אזור האות החיובי/אזור ההחזר על ההשקעה.

15. אלטרנטיבה: ניתוח תמונות עם תוכנה חופשית (ImageJ)

1. פתח את ImageJ.
2. לחץ על קובץ | פתח כדי להציג תמונה.
3. לחץ על בחירות חופשיות.
4. בחר את ההחזר על ההשקעה על ידי מתאר עם הכלי ביד חופשית . תאר את תאי הצינורית החיוביים ל-LTL או תאי ביניים חיוביים ל-α-SMA.
5. לחץ על תפריט Edit ובחר Clear outside.
6. לחץ על נתח ובחר מדידה כדי לקבוע את אזור ההחזר על ההשקעה.
7. עבור לתמונה | צבע | ערוצים מפוצלים.
8. כוונן את הגבולות העליונים והתחתונים של הסף כדי לזהות את אזור האות החיובי.
9. לחץ על נתח ובחר מדידה.
10. שמור את הנתונים.
11. פתח את הנתונים עם תוכנת גיליון אלקטרוני וחשב את היחס בין שטח האות החיובי/אזור החזר ההשקעה.

16. אופציונלי: הדמיה עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר

הערה: כדי להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה יותר לפרסום, מיקרוסקופיה קונפוקלית סורקת מספקת תמונות ברורות יותר ורקע מופחת ברקמת הכליה.

1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי של סריקת הלייזר (ראה טבלת החומרים).
2. בחר מטרה פי 40 (ראה טבלת החומרים).
3. לחץ על הכרטיסייה אתר ומצא את הממחטות על-ידי התאמת המיקוד.
4. עבור אל הכרטיסייה רכישה , לחץ על ערוצים ובחר 1 AU בהגדרת חור סיכה.
5. כוונן את עוצמת רווח הלייזר בכל ערוץ כך שהאות החיובי יהיה גלוי אך לא רווי. ודא שההגדרות בתוך קבוצה של דגימות ניסוי נשארות קבועות.
6. נקישה הצמד ושמור את התמונה בפורמט הרצוי.

17. רמת BUN בפלזמה

1. הסר את הדגימות מ-20 מעלות צלזיוס והפשיר אותן על קרח.
2. מדללים את הפלזמה עם dH₂O ביחס של 1:10.
3. עבור כל דגימה, הגדר שלוש תגובות נפרדות בשכפול בצלחת של 96 בארות.
   1. לדגימה פלוס סטנדרט, הוסף 5 מיקרוליטר של 200 מ"ג/ד"ל אוריאה ו-20 מיקרוליטר פלזמה מדוללת.
   2. לדגימה בלבד, הוסף 5 מיקרוליטר של dH₂O ו-20 מיקרוליטר של פלזמה מדוללת.
   3. לדגימה ריקה, הוסף 5 מיקרוליטר של dH₂O ו-20 מיקרוליטר של פלזמה מדוללת.
4. מערבבים 85 מיקרוליטר של המגיב + 1 מיקרוליטר אוראז לדגימה להכנת תמיסת העבודה.
5. הוסף 80 מיקרוליטר של תמיסת העבודה לבארות 'מדגם פלוס תקן' ו'דגימה בלבד'.
6. הוסף 80 מיקרוליטר של המגיב (ללא אוראז) לבאר 'ריק הדגימה' משלב 17.3 לעיל.
7. הקש בעדינות על הצלחת כדי לערבב ולדגור אותה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. קרא את OD₅₆₀ עם קורא לוחות.
9. חשב את ריכוז האוריאה Eq (1) והמר אותו ל-BUN באמצעות Eq (2).
   אוריאה (מ"ג/ד"ל) = (מדגם לבד - מדגם ריק) / (מדגם רגיל בלבד) x (רגיל / 4) x (גורם דילול) (1)
   BUN (מ"ג/ד"ל) = ריכוז אוריאה/2.14 (2)
   הערה: בדיקה זו מודדת את תכולת האוריאה (משקל מולקולרי: 60) של הסרום; עם זאת, BUN מתייחס רק לתכולת החנקן של אוריאה (משקל מולקולרי: 28). לפיכך, יש צורך בתיקון של 2.14 (60/28) כדי להמיר את ריכוז האוריאה ל-BUN.

כדי לבחון את תפקידם של תאי אפיתל צינוריים בייצור ציטוקינים לאחר AKI המושרה על ידי ציספלטין, הוזרק ציספלטין בריכוז של 20 מ"ג/ק"ג ואחריו הזרקה תוך ורידית של 0.25 מ"ג BFA ביום השלישי לאחר הזרקת הציספלטין. הכליות נקטפו כעבור 6 שעות. כליות משובצות פרפין נחתכו ונצבעו ב-TGF-β, PDGF-D ו-CTGF, ציטוקינים מייצגים האחראים לתיקון רקמות ב-AKI. כפי שמוצג באיור 2A, שלפוחיות TGF-β⁺ נצפות ב-PTCs המסומנים ב-LTL בכליות שטופלו בציספלטין בנוכחות BFA. בינתיים, שלפוחיות TGF-β⁺ לא נצפו בכליות לא פצועות או לא מטופלות ב-BFA.

הכימות הראה עלייה באזור TGF-β1⁺ עם טיפול BFA ב-AKI המושרה על ידי ציספלטין (איור 2B). בדומה ל-TGF-β, שלפוחיות PDGF-D⁺ או CTGF⁺ הצטברו גם עם טיפול BFA ב-AKI המושרה על ידי ציספלטין (איור 2C ואיור 2E). הכימות הראה שאזורי PDGF-D⁺ ו-CTGF⁺ גדלו באופן משמעותי עם BFA ב-LTL⁺ PTCs (איור 2D ואיור 2F). כדי לחקור את השפעת הטיפול ב-BFA על תפקוד הכליות, נמדדו רמות BUN בפלזמה ביום השלישי לאחר הזרקת ציספלטין. כפי שמוצג באיור 2G, הזרקת BFA לא העלתה באופן משמעותי את רמות ה-BUN בפלזמה.

לאחר מכן, כדי לחקור אילו ציטוקינים מופרשים על ידי תאי ביניים ב-AKI המושרה על ידי ציספלטין, הכליות נצבעו עבור TGF-β או CTGF, ומיופיברובלסטים אינטרסטיציאליים סומנו על ידי α-SMA. כפי שמוצג באיור 3A, שלפוחיות TGF-β⁺ נצפו בתאים אינטרסטיציאליים המסומנים ב-α-SMA בציספלטין-AKI עם טיפול ב-BFA (איור 3A). כדי לכמת את האות בתוך תאי α-SMA⁺ , תוארה אזור α-SMA⁺ ואותות הציטוקין וה-α-SMA החיוביים כומתו בתוך האזור. הכימות גילה כי אזור TGF-β⁺ באזור α-SMA⁺ גדל באופן משמעותי עם טיפול ב-BFA בציספלטין AKI (איור 3B). שלפוחיות CTGF⁺ גדלו גם הן עם טיפול ב-BFA (איור 3C), וכימות הראה שטיפול ב-BFA שיפר את היחס בין שטח CTGF⁺ לאזור α-SMA⁺ ב-AKI המושרה על ידי ציספלטין (איור 3D).

כדי לקבוע אם ניתן להשתמש בטיפול ב-BFA במודלים של פגיעה כלייתית כרונית, פגיעה בכליות נגרמה באמצעות שלוש מנות של AA, הגורם ל-AKI המתפתח לפגיעה כרונית עם פיברוזיס כלייתי בוגר ורלוונטי קלינית ל-CKD אנושי. BFA הוזרק ביום ה-42 לאחר הזרקת AA, והכליות נקטפו 6 שעות לאחר מכן. בהשוואה לפגיעה הנגרמת על ידי ציספלטין, שלפוחיות TGF-β⁺ ב-PTCs היו קטנות בהרבה בשלב הכרוני של AA. היה מכתים חיוביים מינימליים ב-LTL⁺ PTCs; עם זאת, עוצמת האות של TGF-β ב-PTCs חיוביים למולקולת פגיעה בכליות 1 (KIM-1⁺) גדלה עם טיפול ב-BFA (איור 3E). רמת העוצמה הממוצעת של TGF-β הייתה גבוהה פי 3 עם הזרקת BFA מאשר ללא BFA (איור 3F). ממצא זה מצביע על כך שניתן להשתמש בהזרקת BFA in vivo לצביעה אימונופלואורסצנטית ובשילוב עם סמנים אחרים כדי להעריך את ייצור הציטוקינים באופן ספציפי לסוג התא.

איור 1: ייצוג סכמטי של אופן הפעולה של BFA. (A) BFA חוסם הובלה מ-ER לגולגי של שלפוחיות שמכילות חלבונים שמופרשים, כמו למשל TGF-β. (B) BFA גורם להצטברות של ציטוקינים תוך-תאיים, כמו למשל TGF-β, בתאי אפיתל צינוריים בכליות. (C) חתך סכמטי של זנב עכבר. הוורידים הרוחביים הם הנגישים ביותר להזרקה. קיצורים: BFA = brefeldin A; ER = רשתית אנדופלזמית; TGF-β = גורם גדילה טרנספורמציה-בטא; BFA- = BFA-שלילי; BFA+ = BFA חיובי. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אימונופלואורסצנציה עם הזרקת BFA מזהה שלפוחיות עשירות בציטוקינים בתאי אפיתל צינוריים בעקבות פגיעה כלייתית חריפה הנגרמת על ידי ציספלטין. (A) תמונות מייצגות של שלפוחיות TGF-β⁺ ביום השלישי לאחר מתן ציספלטין (20 מ"ג/ק"ג) או מתן מי מלח. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. חיצים מציינים שלפוחיות TGF-β⁺ ב-PTCs. (B) כימות של שלפוחיות/צינוריות TGF-β⁺ במי מלח (n = 5), מי מלח + BFA (n = 5), Cis (n = 5), Cis + BFA (n = 5). (C) תמונות מייצגות של שלפוחיות PDGF-D ביום השלישי לאחר מתן ציספלטין (20 מ"ג/ק"ג) או מתן מי מלח. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (D) כימות שלפוחיות/צינוריות PDGF-D⁺ במי מלח (n = 4), מי מלח + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (E) תמונות מייצגות של שלפוחיות CTGF⁺ ביום השלישי לאחר מתן ציספלטין (20 מ"ג/ק"ג) או מתן מי מלח. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (F) כימות שלפוחיות/צינוריות CTGF⁺ במי מלח (n = 4), מי מלח + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (ז) רמת BUN בפלזמה ביום השלישי לאחר מתן ציספלטין (20 מ"ג/ק"ג): ציספלטין (ציס) (n = 7) וציספלטין + BFA (Cis + BFA) (n = 3). הנתונים מוצגים כאמצעים ± SD. * p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אזורים התחומים בתיבות לבנות מקווקווים מוצגים בחלונית כניסה בהגדלה גבוהה יותר. קיצורים: BFA = brefeldin A; TGF-β = גורם גדילה טרנספורמציה-בטא; ציס = ציספלטין; PDGF-D = גורם גדילה שמקורו בטסיות-D; CTGF = גורם גדילה של רקמת חיבור; BUN = חנקן אוריאה בדם; LTL = לוטוס טטרגונולבוס לקטין ; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול; HM = הגדלה גבוהה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שלפוחיות עשירות בציטוקינים שנצפו במיופיברובלסטים לאחר פגיעה כלייתית חריפה הנגרמת על ידי ציספלטין ותאי אפיתל צינוריים בשלב כרוני של נפרופתיה של חומצה אריסטולוצ'ית. (A) תמונות מייצגות של שלפוחיות TGF-β⁺ ביום השלישי לאחר מתן ציספלטין (20 מ"ג/ק"ג) או מתן מי מלח. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. החצים מציינים שלפוחיות TGF-β⁺ בתאי ביניים a-SMA⁺ . (B) כימות של שטח TGF-β⁺ /שטח α-SMA⁺ במי מלח (n = 4), מי מלח + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (C) תמונות מייצגות של שלפוחיות CTGF⁺ ביום השלישי לאחר מתן ציספלטין (20 מ"ג/ק"ג) או מתן מי מלח. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. החצים מציינים שלפוחיות CTGF⁺ בתאי ביניים a-SMA⁺ . (D) כימות של שטח CTGF⁺ / שטח α-SMA⁺ במי מלח (n = 4), מי מלח + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (E) תמונות מייצגות של כליה מוכתמת ב-TGF β (אדומה) בנפרופתיה כרונית של חומצה אריסטולוכית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (F) כימות עוצמת האות TGF-β⁺ / KIM-1⁺ PTCs ב-AAN (n = 6) ו-AAN + BFA (n = 6). הנתונים המוצגים כאמצעים ± SD. * p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. אזורים התחומים בתיבות לבנות מקווקווים מוצגים בחלונית כניסה בהגדלה גבוהה יותר. קיצורים: BFA = brefeldin A; TGF-β = גורם גדילה טרנספורמציה-בטא; α-SMA = אקטין שריר חלק אלפא; ציס = ציספלטין; CTGF = גורם גדילה של רקמת חיבור; KIM-1 = מולקולת פגיעה בכליות-1; LTL = לוטוס טטרגונולבוס לקטין ; AAN = נפרופתיה של חומצה אריסטולוצ'ית; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול; HM = הגדלה גבוהה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ידוע כי PTCs בכליות מווסתים AKI ו-CKD באמצעות הפרשת TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, גורם גדילה אנדותל כלי דם, כמו גם חלבונים רבים אחרים 20,21,22,23. באופן דומה, גלומרולים, צינוריות דיסטליות ותאי אפיתל כליות אחרים, כמו גם תאי ביניים, מפרישים חלבונים אלה ו/או אחרים במהלך הפציעה 24,25,26. קשה להבהיר את התרומה היחסית של כל אחד מסוגי התאים הללו בהפרשת ציטוקינים מכיוון שציטוקינים מופרשים זמן קצר לאחר ייצורם. בעוד שניתן להשתמש בהכלאה באתרה וטכניקות צביעת RNA אחרות כדי לצבוע את ה-RNA של חלבונים מופרשים, קשה לשלב טכניקות אלה עם צביעה עבור סמנים ספציפיים לסוג התא או סמני פציעה. לחלופין, מחקרים רבים משלבים ממצאים in vivo עם ניסויים במבחנה שבוצעו בתאי כליה מתורבתים. במקרה זה, נתוני פגיעה בכליות קשורים לנתוני הפרשת ציטוקינים מתאים מתורבתים כדי להסיק מסקנות, שיש להם יכולת תרגום מוגבלת למצב in vivo.

הופעתם של ריצוף הדור הבא ו-RNAseq של תא בודד אפשרה סיווג של סוגי תאים לפי ביטוי גנים וזיהוי של גנים אחרים המתבטאים על ידי כל סוג תא²⁷. בעוד שזה מספק פירוט מעולה על בסיס אוכלוסייה, לעתים קרובות זה משאיר הרבה מהנתונים האנטומיים והפתולוגיים שניתן ללקט מחלקי כליות. בנוסף, ריצוף של תא בודד מזהה לעתים קרובות רק את 3,000-7,000 הגנים המובילים המתבטאים בכל תא, מה שעשוי שלא לספק מספיק עומק כדי לסנן את כל הציטוקינים המעניינים²⁸. מאמר זה מציע אלטרנטיבה לגישות אלה. באמצעות BFA לחסימת הפרשת חלבון, ניתן לצבוע את רקמת הכליה ישירות עבור ציטוקינים וחלבונים אחרים מעניינים, כולל סמני סוג תאים באמצעות טכניקות אימונופלואורסצנטיות סטנדרטיות.

TGF-β, PDGF-D ו-CTGF הם בין הציטוקינים הנחקרים ביותר בפגיעה בכליות. שלושתן ידועות כחרבות פיפיות, מקדמות החלמה לאחר AKI תוך תרומה להתקדמות פיברוזיס ב-CKD^29,30. אמנם ידוע שתאי אפיתל של צינוריות כליה ותאי ביניים יכולים להפריש TGF-β, PDGF-D ו-CTGF בפגיעה בכליות, אך זיהוי ישיר של סוג התא והייצור היחסי נותר מאתגר. במחקר הנוכחי, בחרנו לצבוע TGF-β, PDGF-D ו-CTGF בכליות במהלך AKI המושרה על ידי ציספלטין, ו-TGF-β במודל AAN CKD, יחד עם סמן PTC LTL, סמן פגיעה PTC KIM-1, או סמן מיופיברובלסטים α-SMA. זה יאפשר לקבוע אם PTCs או מיופיברובלסטים מייצרים ציטוקינים אלה ואת רמות הביטוי היחסיות בין קבוצות הניסוי.

בעכברים שטופלו ב-BFA בלבד, היה מעט מאוד צביעה חיובית של אף אחד מהציטוקינים כמו כן, טיפול בציספלטין גרם רק לעלייה שולית בצביעת ציטוקינים. השילוב של פגיעה בציספלטין עם טיפול ב-BFA במשך 6 שעות הביא לעלייה דרמטית באותות החיוביים התוך תאיים של כל שלושת הציטוקינים, מה שמצביע על כך שציטוקינים אלה מופרשים באופן נורמלי. באופן דומה, רק קבוצת ציספלטין + BFA הראתה עלייה משמעותית באות TGF-β ו-CTGF בתאי ביניים α-SMA⁺. במודל ה-AAN הכרוני, שבו TGF-β קשור לתגובה פתולוגית, הזרקת AA לבדה גרמה לצביעה מסוימת של TGF-β, במיוחד ב-KIM-1⁺ PTCs פצועים. טיפול BFA הגביר את האות התוך-תאי החיובי ב-KIM-1⁺ PTCs (PTCs הם תאי צינורית הכליה היחידים הידועים כמבטאים KIM-1³¹). מעניין לציין כי LTL⁺ KIM-1⁺ או LTL⁺ KIM-1^- PTCs לא הראו צביעה משמעותית של TGF-β, בעוד של-LTL-KIM-1⁺ PTCs הייתה יותר TGF-β חיובית. אובדן צביעת LTL מצביע על כך שה-PTCs המבטאים רמות גבוהות יותר של TGF-β נפגעים ובלתי מובחנים בשלב הכרוני של הפציעה. פנוטיפ זה הוא ככל הנראה התיקון הלא מסתגל שתואר קודם לכן^32,33. לפיכך, טיפול BFA מדגים כי TGF-β מתבטא ב-PTCs לאחר AKI ובמהלך CKD.

בעוד שהמחקר הנוכחי מתמקד בצביעה אימונו-פלואורסצנטית, חשוב לציין שניתן לשלב טיפול ב-BFA עם בדיקות אחרות. לדוגמה, אם הניסוי אינו דורש זיהוי סוג התא המפריש את החלבון המעניין, ניתן להזריק BFA ולבצע כתם חיסוני או ELISA על ליזטים של כליה שלמה בקבוצת ביקורת לעומת קבוצות ניסוי. בדיקה נוספת שניתן לשקול היא ציטומטריית זרימה. טיפול ב-BFA שולב עם זרימה ציטומטרית במחקרים אימונולוגיים כדי לקבוע את הייצור היחסי של ציטוקינים בסוגי תאים שונים¹⁵. בעוד שהפרדת תאי אפיתל כליה מרקמת הכליה לתאים בודדים יכולה להיות מאתגרת, ציטומטריית זרימה עשויה להוות אלטרנטיבה במעבדות שבהן הטכניקה מבוססת. בנוסף, ניתן להשתמש בטיפול ב-BFA למחקרי תרבית תאים במבחנה בכל הבדיקות המפורטות לעיל.

המחקר הנוכחי מתאר שתיים משיטות הכנת הרקמות הנפוצות ביותר, רקמה קבועה משובצת פרפין ורקמה קפואה, שעובדות היטב עבור הנוגדנים המשמשים במחקר. עם זאת, בהתחשב באופי המשתנה של הנוגדנים, סביר להניח שחוקרים המאמצים טכניקה זו יידרשו לתקן פרוטוקולי צביעה או עיבוד רקמות עוד יותר, בהתאם לנוגדן. מכיוון שציטוקינים מופרשים בדרך כלל, מעט נוגדנים נגד ציטוקינים נבדקים להכתמה ברקמה. כדי לזרז את הסטנדרטיזציה של הפרוטוקול, אנו ממליצים ליצור בקרות חיוביות בהן איברים הידועים כמפרישים את הציטוקינים המעניינים נקצרים לאחר טיפול BFA. לדוגמה, טחול מבעלי חיים שטופלו בליפופוליסכריד ו-BFA יכול לשמש כרקמת בקרה חיובית לציטוקינים רבים ושונים. קצירת טחול ועיבוד כרקמה משובצת פרפין או קפואה תאפשר סטנדרטיזציה מהירה יותר של ריכוז הנוגדנים והמאגרים. יתר על כן, אם הנוגדנים נגד ציטוקינים אופיינו כמכתימים ציטוקינים בקונפורמציה המקורית שלהם במבחנה, יש סיכוי גבוה יותר שהנוגדנים הללו יזהו את מטרתם ברקמה הקפואה הפחות מעובדת.

בעוד שטיפול ב-BFA יכול להיות כלי רב עוצמה בעת מדידת חלבונים מופרשים, הוא אינו חף ממגבלות. המגבלה הברורה ביותר היא שהחלבון המופרש המנותח חייב לעקוב אחר מסלול הפרשת ER-Golgi; אחרת, ל-BFA עשויה להיות השפעה מוגבלת. מגבלה נוספת היא שבעלי חיים שטופלו ב-BFA עשויים לשנות את התוצאות במבחני ניסוי אחרים. לדוגמה, חלק מהסמנים הביולוגיים של פגיעה בכליות, כגון KIM-1, מסתמכים על הובלת ER-Golgi כדי להיות מוצגת על פני התא. לפיכך, סביר להניח שרמות KIM-1 בשתן יופחתו בבעלי חיים שטופלו ב-BFA. בנוסף, קיים חשש ש-BFA עלול להוביל ללחץ תאי מוגבר. אמנם ניתן להפחית את הדאגה הזו על ידי הפחתת זמן הטיפול ב-BFA, אבל זה צריך להיות שיקול. לא נצפתה עלייה משמעותית ב-BUN במחקר זה; עם זאת, הייתה עלייה של ~10%. לפיכך, יש לנקוט בזהירות בעת החלטת מטרות או סמנים אחרים שיש לנתח בבעלי חיים שטופלו ב-BFA.

מחקר זה מדגים כי ניתן להשתמש ב-BFA כדי לחסום את הפרשת החלבונים, מה שמוביל להצטברות תוך תאית של ציטוקינים, אותם ניתן לצבוע בטכניקות אימונופלואורסצנטיות סטנדרטיות. זה מאפשר לזהות את סוגי התאים המפרישים ציטוקינים ספציפיים או חלבונים אחרים, ולכמת את ייצור הציטוקינים על ידי תאים אלה. היתרון הנוסף של פרוטוקול זה הוא שניתן לשמר ולנתח נתונים היסטולוגיים ופתולוגיים באותם קטעים סדרתיים או סמוכים. לפיכך, טיפול BFA מספק גישה חסכונית ופשוטה יחסית לחקר ייצור ציטוקינים ברקמת הכליה.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

איגוד הלב האמריקאי (AHA): קנסיי טאגוצ'י, 20POST35200221; מניית HHS | מניית NIH | המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK): קרייג ברוקס, DK114809-01 DK121101-01.