Identifizierung der Quelle von sezernierten Proteinen in der Niere durch Brefeldin A-Injektion

Die Identifizierung des Zelltyps, der für die Sekretion von Zytokinen verantwortlich ist, ist notwendig, um die Pathobiologie der Nierenerkrankung zu verstehen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur quantitativen Färbung von Nierengewebe auf Zytokine, die von Nierenepithelzellen oder interstitiellen Zellen produziert werden, unter Verwendung von Brefeldin A, einem Sekretionshemmer, und zelltypspezifischen Markern.

Die chronische Nierenerkrankung (CKD) gehört zu den zehn häufigsten Todesursachen in den USA. Akutes Nierenversagen (AKI) ist zwar oft heilbar, prädisponiert Patienten aber für eine CNE im späteren Leben. Sowohl bei der AKI als auch bei der CKD wurden Nierenepithelzellen als wichtige Signalknoten identifiziert, wobei die Zellen durch die Sekretion von Zytokinen und anderen Proteinen den Krankheitsverlauf bestimmen können. Insbesondere bei CKD haben mehrere Beweise gezeigt, dass maladaptiv reparierte Röhrenzellen das Fortschreiten der Krankheit durch die Sekretion von transformierendem Wachstumsfaktor-beta (TGF-β), Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) und anderen profibrotischen Zytokinen vorantreiben. Die Identifizierung der Quelle und der relativen Anzahl der sezernierten Proteine aus verschiedenen Zelltypen in vivo bleibt jedoch eine Herausforderung.

In dieser Arbeit wird eine Technik beschrieben, bei der Brefeldin A (BFA) verwendet wird, um die Sekretion von Zytokinen zu verhindern, was die Färbung von Zytokinen in Nierengewebe unter Verwendung von Standard-Immunfluoreszenztechniken ermöglicht. BFA hemmt den Transport des endoplasmatischen Retikulums (ER) zum Golgi-Apparat, der für die Sekretion von Zytokinen und anderen Proteinen notwendig ist. Die Injektion von BFA 6 h vor der Tötung führt zu einem Aufbau von TGF-β, PDGF und CTGF in den proximalen Tubuluszellen (PTCs) in einem Maus-Cisplatin-Modell von AKI und TGF-β in einem Maus-Aristolochiasäure (AA)-Modell von CKD. Die Analyse ergab, dass BFA + Cisplatin oder BFA + AA das TGF-β-positive Signal im Vergleich zu BFA + Kochsalzlösung, Cisplatin oder AA allein signifikant erhöhte. Diese Daten deuten darauf hin, dass BFA verwendet werden kann, um den Zelltyp zu identifizieren, der spezifische Zytokine produziert, und die relativen Mengen und/oder verschiedene Arten von produzierten Zytokinen zu quantifizieren.

Es wird geschätzt, dass >10 % der Weltbevölkerung an einer Form von Nierenerkrankung^{leiden 1}. AKI zeichnet sich durch seinen schnellen Wirkungseintritt aus und ist weitgehend heilbar; Eine Episode von AKI kann jedoch Patienten prädisponieren, später im Leben eine CNE zu entwickeln ^2,3. Im Gegensatz zu AKI ist die CKD durch eine fortschreitende Fibrose und eine Verschlechterung der Nierenfunktion gekennzeichnet, was zu einer Nierenerkrankung im Endstadium führt, die eine Nierenersatztherapie erfordert. Die meisten Verletzungen der Nieren zielen auf die spezialisierten Epithelzellen ab, wie z. B. Podozyten oder proximale Tubuluszellen, aus denen das Nephron^{besteht 4,5}. Nach einer Verletzung helfen die überlebenden Epithelzellen, die Reparaturreaktion durch die Sekretion von Zytokinen und anderen Proteinen zu koordinieren. Auf diese Weise können die überlebenden Zellen die Immunantwort modulieren, den Umbau der extrazellulären Matrix steuern und die Organregeneration unterstützen.

Zytokine sind kleine, sezernierte Proteine, die für die Modulation der Reifung, des Wachstums und der Reaktionsfähigkeit mehrzelliger Organismen unerlässlich sind ^6,7. Sie fungieren als Botenstoffe zwischen verschiedenen Zelltypen, einschließlich Immun- und Epithelzellen⁸. Obwohl angenommen wird, dass Zytokine hauptsächlich von Immunzellen sezerniert werden, haben langjährige Forschungen gezeigt, dass Nierenepithel- und interstitielle Zellen auch Zytokine als Signale für andere ansässige Nierenzellen wie Tubuluszellen, interstitielle Zellen und Immunzellen sezernieren ^9,10. Insbesondere PTCs spielen eine wichtige Rolle in der Initiierungs- und Erholungsphase nach AKI¹¹. Es ist jedoch bekannt, dass maladaptiv reparierte PTCs profibrotische Zytokine wie den transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β), den plättchenabgeleiteten Wachstumsfaktor-D (PDGF-D) und den Bindegewebswachstumsfaktor (CTGF) sezernieren, die zur CKD-Progression beitragen¹². Daher verwenden Nierenepithelzellen sekretierte Zytokine, um Nierenschäden zu modulieren.

Es ist zwar bekannt, dass Nierenepithelzellen Zytokine sezernieren, aber die genaue Quelle und der relative Beitrag jedes Zelltyps waren aufgrund der technischen Herausforderungen bei der Untersuchung sekretierter Proteine schwer zu bestimmen¹³. Die Durchflusszytometrie, ein gängiger Ansatz zur Messung von Zytokinen, ist bei verletzten Nieren nur schwer durchzuführen, insbesondere bei stark fibrotischen Nieren. Bei der Cre-Rekombinase, die von einem Zytokin-Promotor angetrieben wird, werden Zytokin-Reportermäuse häufig verwendet, um den Zelltyp zu identifizieren, der ein bestimmtes Zytokin exprimiert. Die Verwendung von Reportermäusen ist jedoch begrenzt, da Reportermäuse in verschiedene Knockout-Hintergründe gekreuzt werden müssen, geeignete Reporter fehlen und jeweils nur ein Zytokin analysiert werden kann. Daher ist es notwendig, eine einfache, vielseitige und erschwingliche Technik zum Nachweis von Zytokin-freisetzenden Nierenzellen zu entwickeln.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die Injektion von BFA, einem Sekretionsinhibitor, der den endoplasmatischen Retikulum-Golgi-Transport in vivo blockiert, die Färbung von sezernierten Proteinen im Nierengewebe ermöglichen würde (Abbildung 1A,B), wie mit durchflusszytometrischen Assays^{gezeigt wurde 14,15}. Zusammen mit zelltypspezifischen Makern könnte diese Technik verwendet werden, um die Quelle und den relativen Beitrag von Zytokin-produzierenden Zellen in verletzten Nieren zu identifizieren. Im Gegensatz zu Proben für die Durchflusszytometrie können fixierte Gewebe unter Erhalt von Proteinen und Zellstrukturen langfristig aufbewahrt werden, was eine gründlichere Untersuchung der sekretorischen Zellen ermöglicht. Um diese Hypothese zu testen, wurden die Nieren von Mäusen mit einem Modell von AKI (Cisplatin) und einem Modell von CKD (Aristolochiasäure-Nephropathie (AAN)) verletzt, mit BFA injiziert und mit Standard-Immunfluoreszenztechniken gefärbt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Tierverwendungsprotokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and User Committee des Vanderbilt University Medical Center genehmigt wurde.

1. Tiere

1. Verwenden Sie 8-12 Wochen alte männliche BALB/c-Mäuse (Körpergewicht: ca. 25 g) für Cisplatin- oder Aristolochiasäure-induzierte Nephropathie.
2. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse gesund sind und keine offensichtlichen Anzeichen von Stress oder Wunden vom Kampf aufweisen.
   HINWEIS: Wunden, insbesondere am Schwanz, könnten das hier beschriebene Protokoll beeinträchtigen. BALB/c-Mäuse wurden ausgewählt, da es bei diesen Mäusen einfacher ist, die Schwanzvene für die Injektion sichtbar zu machen. Das hier beschriebene Protokoll funktioniert auch für andere Mausstämme. Die Dosierung von Cisplatin oder Aristolochiasäure kann jedoch von Stamm zu Stamm unterschiedlich sein.

2. Cisplatin-Injektion

1. Cisplatin in steriler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml auflösen.
   HINWEIS: Cisplatin löst sich bei Raumtemperatur nicht vollständig auf. Es sollte in einem Abzug gehandhabt werden.
2. Erwärmen Sie die Cisplatin-Lösung in einem Wasserbad bei 37 °C und wirbeln Sie sie so lange auf, bis sich das Cisplatin vollständig aufgelöst hat.
3. Wiegen Sie die Mäuse und berechnen Sie das Volumen der Cisplatinlösung, das für die Injektion von 20 mg/kg Körpergewicht (KG) benötigt wird.
4. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit Abstrichen von Povidon-Jod (7,5%) und Alkohol (70%) abwechselnd jeweils 3x.
5. Injizieren Sie die Cisplatinlösung mit einer Insulinspritze mit einer 25-G-Nadel intraperitoneal.
6. Fahren Sie mit Abschnitt 4 am Tag 3 nach der Injektion fort.

3. Injektion von Aristolochiasäure (AA)

1. Aristolochiasäure-I wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml gelöst.
   HINWEIS: AA sollte in einem Abzug gehandhabt werden. AA-I sollte verwendet werden, da es die dominante Form ist, die eine Nierenschädigung hervorruft.
2. Die AA-Lösung in einem Wasserbad bei 37 °C erwärmen und wiederholt vortexen, bis sie sich vollständig aufgelöst hat.
3. Wiegen Sie die Mäuse und berechnen Sie das Volumen der AA-Lösung, um 5 mg/kg Körpergewicht zu injizieren.
4. Desinfizieren Sie die Bauchhaut mit Povidon-Jod (7,5%) und Alkohol (70%), tupfen Sie 3x ab.
5. Injizieren Sie die AA-Lösung mit einer Insulinspritze mit einer 25-g-Nadel intraperitoneal.
6. Injizieren Sie AA jeden zweiten Tag für insgesamt 3 Injektionen.
7. Fahren Sie mit Abschnitt 4 am Tag 42 nach der letzten Injektion fort.

4. Herstellung der BFA-Lösung

1. BFA wird in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst, um eine Stammlösung herzustellen.
2. Lagern Sie die Stammlösung bei -20 °C.
3. Verdünnen Sie die BFA-Stammlösung mit sterilem PBS bei der endgültigen Arbeitskonzentration von 1,25 mg/ml
   HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal unmittelbar vor der Injektion eine frische Arbeitslösung vor.

5. Schwanzveneninjektion von BFA

1. Legen Sie den Käfig vor der Injektion 10 Minuten lang halb auf, halb ohne Heizkissen, um sicherzustellen, dass die Mäuse warm sind, um einen Abfall der Körpertemperatur zu verhindern, der zu einer Vasokonstriktion der Gefäße im Schwanz führen und die Injektion beeinträchtigen kann.
   HINWEIS: Stellen Sie den Käfig so auf die Heizkissen, dass sich die Hälfte des Käfigs auf dem Pad befindet und die andere Hälfte nicht. Auf diese Weise können die Mäuse, wenn sie sich warm fühlen, auf die andere Seite des Käfigs wechseln und umgekehrt.
2. Halten Sie die Mäuse mit handelsüblichen Rückhaltevorrichtungen geeigneter Größe fest.
3. Desinfizieren Sie den Schwanz dreimal mit einem Povidon-Jod- und Alkoholtupfer wie oben beschrieben.
4. Halten Sie den Schwanz waagerecht und visualisieren Sie die seitlichen Schwanzvenen (Abbildung 1C). Verwende eine Lichtquelle unter dem Schwanz, um die Venen sichtbar zu machen.
5. Führen Sie eine 28-G-Nadel ein und halten Sie die Nadel und die Spritze parallel zur Vene in Richtung des Kopfes.
6. Injizieren Sie 200 μl der 1,25 mg/ml BFA-Lösung (0,25 mg BFA). Warten Sie, bis die Vene frei wird, während das Blut durch die Injektionslösung ersetzt wird, was darauf hinweist, dass die Injektion erfolgreich war.
7. Entfernen Sie die Nadel und drücken Sie vorsichtig auf den Schwanz, bis die Blutung aufhört.
8. Setzen Sie die Mäuse wieder in den Käfig ein und überwachen Sie sie auf zusätzliche Blutungen oder Anzeichen von Stress.

6. Opferung und Entnahme der Nieren

1. Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer Überdosis Isofluran, gefolgt von einer Zervixluxation 6 h nach der BFA-Injektion.
   HINWEIS: Der 6-Stunden-Zeitpunkt wurde auf der Grundlage von Literatur gewählt, die zeigt, dass eine 6-stündige BFA-Behandlung in anderen Organen eine ausreichende Akkumulation von Zytokinen in den Zellen ermöglicht, um sie durch Immunfluoreszenzfärbung sichtbar zu machen¹⁶.
2. Unmittelbar nach der Tötung legen Sie den Bauch und das Herz der Maus durch einen ventralen Mittellinienschnitt frei.
3. Sammeln Sie 100-500 μl Blut für einen Blutharnstoffstickstoff-Test (BUN) durch Herzpunktion. Verwenden Sie 25-G-Nadeln mit 1-ml-Insulinspritzen, um das Blut zu entnehmen. Um eine Gerinnung zu verhindern, fügen Sie jeder Probe 5 μl Heparinlösung (100 mg/15 ml dH₂O) hinzu.
   HINWEIS: Für den BUN-Assay werden mindestens 20 μl Blut benötigt. Es können jedoch etwa 500 μl durch Herzpunktion nach Euthanasie gesammelt werden, was für andere Assays nützlich sein könnte. Sammle so viel Blut wie möglich.
4. Lagern Sie die Blutproben auf Eis, bis die Nieren in Abschnitt 7 entnommen werden.
   1. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 1.300 × g für 10 min.
   2. Isolieren Sie das Plasma vorsichtig und lagern Sie es bei -20 °C, bis es für die Durchführung des BUN-Assays in Abschnitt 17 unten bereit ist. Alternativ können Sie die Plasmaproben für Kreatinin-Assays aufbewahren.

7. Durchblutung und Entfernung der Nieren

1. Perfusionieren Sie die Maus mit 10-20 ml PBS durch den linken Ventrikel mit einer 20-ml-Spritze bei einer Flussrate von 2-4 ml/min, bis das Perfusat klar wird.
2. Entfernen Sie die Nieren, indem Sie die Nierenarterie und die Vene mit einer Pinzette nahe an der Papille halten und die Gefäße an der von der Niere abgewandten Seite durchtrennen.
3. Entfernen Sie die Nierenkapsel vorsichtig, indem Sie sie von Hand oder mit einer feinen, sterilen Pinzette abziehen.
4. Je nach Antikörper fahren Sie mit Abschnitt 8 für die Aufbereitung von fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe oder Abschnitt 10 für die Aufbereitung von fixiertem gefrorenem Gewebe fort.
   HINWEIS: Die Gewebeverarbeitung muss für jeden Antikörper, der für die Färbung verwendet werden soll, optimiert werden.

8. In Paraffin eingebettetes Gewebe für die TGF-β- und PDGF-D-Färbung

1. Halbieren Sie die Niere, indem Sie sie auf einen sauberen Glasobjektträger legen und mit einer neuen Rasierklinge horizontal schneiden. Legen Sie eine Hälfte in 10 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 24 Stunden auf einen End-over-End-Rotator mit einer Geschwindigkeit von 10 Umdrehungen pro Minute (U/min).
   HINWEIS: Die gesamte Niere wird für die Sektion nicht benötigt. Eine Hälfte der Niere kann gelagert oder für andere Assays verwendet werden.
2. Ersetzen Sie das PFA durch 70% Ethanol.
3. In diesem Stadium wird die Nierenhälfte zur Verarbeitung und Paraffineinbettung eingereicht, dann wird das in Paraffin eingebettete Nierengewebe bei 4 bis 6 μm mit einem Mikrotom geschnitten und auf vorgereinigte, geladene Objektträger^{montiert 17,18}.
   HINWEIS: Die Nieren wurden von der Translational Pathology Shared Resource des Vanderbilt University Medical Center verarbeitet und in Paraffin eingebettet und bei Raumtemperatur gelagert.

9. Entparaffinisierung und Rehydrierung

1. Legen Sie die Objektträger in ein Färbegestell für Objektträger und tauchen Sie sie 5 Minuten lang in eine Färbevertiefung, die D-Limonen enthält, wobei Sie darauf achten, dass das Gewebe vollständig untergetaucht ist. In einer Vertiefung mit frischem D-Limonen wiederholen.
2. Rehydrieren Sie das Gewebe, indem Sie die Objektträger in serielle Verdünnungen von Ethanol zu 100 % (2x), 95 %, 90 % und 70 % für jeweils 5 Minuten tauchen.
3. Waschen Sie die Objektträger 5 Min. in fließendem dH₂O.
4. Führen Sie die Antigengewinnung durch, indem Sie die Abschnitte in Citratpuffer (pH 6,0) in einem Schnellkochtopf bei 121 °C und 15 psi für 45 Minuten inkubieren.
5. Waschen Sie die Objektträger in fließendem dH₂O für 20 min.
6. Fahren Sie mit Abschnitt 12 fort.

10. Vorbereitung des gefrorenen Gewebes für die CTGF-Färbung

1. Halbieren Sie die Niere entlang der horizontalen Achse mit einer frischen Rasierklinge.
   HINWEIS: Die gesamte Niere wird für die Sektion nicht benötigt. Eine Hälfte der Niere kann gelagert oder für andere Assays verwendet werden.
2. Legen Sie die Nierenhälfte in 10 mL 0,5 % PFA in ein 15 mL Röhrchen auf einen Rotator für 2 h bei 4 °C und einer Geschwindigkeit von 10 U/min.
3. Dekantieren Sie das PFA zur ordnungsgemäßen Entsorgung in einen Behälter und fügen Sie 10 mL 0,1 M Glycin in PBS für 1 h bei 4 °C bei einer Geschwindigkeit von 10 U/min hinzu.
4. Dekantieren Sie das Glycin, fügen Sie 10 ml 15%ige in PBS gelöste Saccharose hinzu und stellen Sie das Röhrchen über Nacht bei 4 °C und 10 U/min auf einen Rotator.
5. Die 15%ige Saccharose dekantieren und durch 10 ml 30%ige Saccharose, gelöst in PBS, für 1 h bei 4 °C und 10 U/min ersetzen.
6. Füllen Sie die Einbettungsform mit optimaler Schnitttemperaturmasse (OCT) und betten Sie die Nierenhälfte aus Schritt 10.5 mit der Schnittfläche der Niere nach unten ein.
7. Lege den Schimmelpilz mit der halben Niere und dem OCT vorsichtig in ein Becken mit flüssigem Stickstoff, um ihn einzufrieren.
   HINWEIS: Lassen Sie den flüssigen Stickstoff nicht direkt mit dem OCT in Kontakt kommen, da dies zur Blasenbildung führen kann. Bei der Verwendung von flüssigem Stickstoff muss geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden, z. B. Schutzbrille/Gesichtsschutz, Kryohandschuhe und Laborkittel. Es ist am besten, eine lange, ~25 cm lange Pinzette zu verwenden, um die Formen in flüssigen Stickstoff zu legen.
8. Sobald die Form fest gefroren ist, lagern Sie sie bei -80 °C.

11. Gefrorenes Trennen

1. Stellen Sie sicher, dass der Kryostat bei -20 °C ist.
2. Formen mit Proben in OCT im Kryostaten bei -20 °C für 2 h lagern, um die Temperatur auszugleichen.
3. Entfernen Sie die Form, indem Sie die Laschen festhalten und von unten drücken.
4. Legen Sie frisches OCT auf einen Probenhalter und legen Sie den gefrorenen Probenblock mit der Gewebeseite vom Probenhalter weg darauf.
5. Stellen Sie den Probenhalter und die Probe auf das Gefrierregal.
6. Platzieren Sie einen gewichteten Wärmeabzug auf dem Block, um die Oberfläche abzuflachen. Halten Sie die Kryostatabdeckung geschlossen, wenn Sie sie nicht verwenden, um Temperaturschwankungen zu vermeiden.
7. Sobald das frische OCT zwischen dem Probenblock und dem Probenhalter eingefroren ist, überprüfen Sie, ob die Verbindung sicher ist.
8. Klemmen Sie den Probenhalter auf den Kryostat-Mikrotomkopf.
9. Beginnen Sie mit dem Schnitt, bis das Gewebe im Probenblock sichtbar ist.
10. Das Nierengewebe wird bei 4-6 μm geschnitten und die Schnitte auf einen mit Raumtemperatur geladenen Objektträger¹⁹ aufgenommen.
11. Sobald das Gewebe aufgenommen ist, lagern Sie den Objektträger bei -20 °C bis -80 °C, bis er zum Färben bereit ist. Lassen Sie es nicht auftauen, bis es bereit ist, mit dem Färben zu beginnen.
12. Nehmen Sie vor dem Färben den/die Objektträger aus der Lagerung und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur erwärmen. Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen.
13. Sobald Sie Raumtemperatur erreicht haben, waschen Sie die Abschnitte sofort zweimal bei Raumtemperatur 5 Minuten lang mit PBS, um die OCT-Verbindung zu entfernen.
14. Fahren Sie mit Abschnitt 12 fort.

12. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Umranden Sie die Gewebeschnitte mit einem hydrophoben Barrieremarkierungsstift. Halten Sie mindestens 5 mm Abstand vom Gewebe zur hydrophoben Barrierekontur ein.
2. 50 μl Blockierungspuffer mit 3 % Eselsserum und 0,1 % Triton in 1 % Rinderserumalbumin/Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) auf den Schnitt geben und 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer inkubieren.
3. Verdünnen Sie die Primärantikörper mit PBS in der entsprechenden Konzentration. Zum Nachweis von Zytokinen verwenden Sie 50 μl Lösungen von Primärantikörpern, die gegen TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) und CTGF (1:200) gerichtet sind. Zur Markierung von Myofibroblasten verwenden Sie 50 μl einer Lösung des primären Antikörpers, die gegen Alpha-Glattmuskel-Aktin (α-SMA) gerichtet ist und mit Cy3 bei 1:200 konjugiert ist.
4. Entfernen Sie die Blockierungslösung und geben Sie die primären Antikörper in den Schnitt, um sicherzustellen, dass sie nicht aus der kreisförmigen hydrophoben Kontur austreten, und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer. Tragen Sie die hydrophobe Barriere erneut auf, wenn eine Leckage auftritt.
5. 3x mit PBS 5 min waschen.
6. Verdünnen Sie die entsprechenden Sekundärantikörper bei 1:200 mit PBS.
7. Inkubieren Sie die Proben mit 50 μl Sekundärantikörperlösungen für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
8. 5 Min. mit PBS waschen.
9. Verdünntes Lotus-Tetragonolobus-Lektin (LTL), konjugiert mit Fluorescein in PBS mit Ca2⁺ und Mg²⁺ in einer Konzentration von 10 μg/ml.
   HINWEIS: Ca²⁺ und Mg²⁺ sind für die LTL-Bindung erforderlich.
10. Inkubieren Sie das Gewebe mit 50 μl LTL-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer.
11. Mit PBS mit Ca²⁺ und Mg²⁺ 5 Min. waschen.
12. Inkubieren Sie mit 50 μl 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 5 μg/ml in Wasser), um DNA/Zellkerne 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zu färben.
13. Montieren Sie die Deckgläser, indem Sie 20 μl Antifading-Eindeckreagenz auf das Gewebe geben und das Deckglas langsam aufsetzen. Warten Sie 24 Stunden, bis sich das Antifading-Reagenz verfestigt hat, bevor Sie es aufnehmen.
    HINWEIS: Die Lektinbindung kann sich mit der Zeit verschlechtern, was zu einem Signalverlust führt. Es ist am besten, mit Lektin gefärbte Proben kurz nach dem Einrichten des Einbettreagenzes abzubilden. Wenn ein Signalverlust beobachtet wird, können Ca²⁺ und Mg²⁺ zum Einbettreagenz hinzugefügt werden, um die Färbung zu erhalten.

13. Bilderfassung

1. Schalten Sie das inverse Mikroskop (siehe Materialtabelle) mit einem automatischen XY-Tisch ein.
2. Wählen Sie das Ziel "20x" aus.
3. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware (siehe Materialtabelle).
4. Klicken Sie auf Live , um das Live-View-Fenster zu öffnen.
5. Suchen Sie den Gewebeschnitt und stellen Sie sicher, dass er scharf ist.
6. Klicken Sie auf das Menü "Erfassen" und wählen Sie "Großes Bild scannen".
7. Richten Sie im Fenster "Großes Bild scannen " den zu scannenden Bereich ein, indem Sie den Tisch mit dem Joystick an den linken Teil des Gewebeschnitts verschieben und dann auf den Pfeil nach links klicken. Wiederholen Sie den Vorgang für die obersten, rechten und unteren Gewebesegmente.
8. Klicken Sie auf das Akquisitionsmenü .
9. Stellen Sie sicher, dass das Kontrollkästchen für großes Bild aktiviert ist.
   1. Wenn Sie Multichannel-Bilder erfassen, klicken Sie auf die Registerkarte Lambda .
   2. Klicken Sie auf jeden Kanal und stellen Sie die Belichtungszeit auf einen Wert ein, bei dem die Färbung sichtbar ist, ohne dass ein Teil des Bildes gesättigt wird.
      HINWEIS: Diese Einstellungen müssen innerhalb einer Versuchsgruppe konsistent sein. Das Ändern der Erfassungseinstellungen zwischen den Proben führt zu ungenauen Ergebnissen.
   3. Wiederholen Sie Schritt 9.2 für jeden Kanal, der erfasst werden soll.
10. Klicken Sie auf Scannen.

14. Bildanalyse

1. Öffnen Sie die Bildaufnahmesoftware.
2. Klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie das Bild und wählen Sie es aus.
3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bildfenster und wählen Sie polygonale Region-of-Interest (ROI).
4. Skizzieren Sie den ROI mit dem Freihand-Tool . Umreißen Sie die LTL-positiven Tubuluszellen oder α-SMA-positiven interstitiellen Zellen.
5. Klicken Sie auf die Registerkarte Messung | Schwelle.
6. Legen Sie die obere und untere Grenze des Schwellenwerts fest, indem Sie die Schieberegler auf beiden Seiten des positiven Signalbereichs einstellen.
7. Klicken Sie auf die Registerkarte ROI .
8. Klicken Sie auf das Symbol Exportieren , um die Werte zu speichern. Verwenden Sie eine Tabellenkalkulationssoftware, um den Prozentsatz des positiven Signalbereichs/ROI-Bereichs zu berechnen.

15. Alternative: Bildanalyse mit freier Software (ImageJ)

1. Öffnen Sie ImageJ.
2. Klicken Sie auf Datei | Öffnen , um ein Bild anzuzeigen.
3. Klicken Sie auf Freihandauswahl.
4. Wählen Sie den ROI aus, indem Sie mit dem Freihandwerkzeug skizzieren. Umreißen Sie die LTL-positiven Tubuluszellen oder α-SMA-positiven interstitiellen Zellen.
5. Klicken Sie auf das Menü Bearbeiten und wählen Sie Außen löschen.
6. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Messen aus, um den ROI-Bereich zu bestimmen.
7. Gehe zu Bild | Farbe | Kanäle teilen.
8. Passen Sie die obere und untere Grenze des Schwellenwerts an, um den positiven Signalbereich zu erkennen.
9. Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Messen aus.
10. Speichern Sie die Daten.
11. Öffnen Sie die Daten mit einer Tabellenkalkulationssoftware und berechnen Sie das Verhältnis von positivem Signalbereich zu ROI-Bereich.

16. Optional: Bildgebung mit konfokalem Laserscanning-Mikroskop

HINWEIS: Um Bilder mit höherer Auflösung für die Veröffentlichung zu erhalten, liefert die konfokale Rastermikroskopie klarere Bilder und einen reduzierten Hintergrund im Nierengewebe.

1. Schalten Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop ein (siehe Materialtabelle).
2. Wählen Sie das 40-fach-Objektiv (siehe Materialtabelle).
3. Klicken Sie auf die Registerkarte "Lokalisieren " und suchen Sie die Taschentücher, indem Sie den Fokus anpassen.
4. Gehen Sie zur Registerkarte Erfassung , klicken Sie auf Kanäle und wählen Sie 1 AU in der Lochkamera-Einstellung.
5. Stellen Sie die Intensität der Laserverstärkung in jedem Kanal so ein, dass das positive Signal sichtbar, aber nicht gesättigt ist. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen innerhalb eines Satzes von experimentellen Stichproben konstant bleiben.
6. Klicken Sie auf Snap und speichern Sie das Bild im gewünschten Format.

17. Plasma-BUN-Spiegel

1. Die Proben bei -20 °C entnehmen und auf Eis auftauen.
2. Verdünnen Sie das Plasma mit dH₂O im Verhältnis 1:10.
3. Richten Sie für jede Probe drei separate Reaktionen in doppelter Ausführung in einer 96-Well-Platte ein.
   1. Für Probe plus Standard fügen Sie 5 μl 200 mg/dl Harnstoff und 20 μl verdünntes Plasma hinzu.
   2. Für die Probe allein sind 5 μl dH₂O und 20 μl verdünntes Plasma zuzugeben.
   3. Für die Blindprobe werden 5 μl dH₂O und 20 μl verdünntes Plasma zugegeben.
4. Mischen Sie 85 μl des Reagenzes + 1 μl Urease pro Probe, um die Arbeitslösung herzustellen.
5. Geben Sie 80 μl der Arbeitslösung in die Vertiefungen "Probe plus Standard" und "Probe allein".
6. 80 μl des Reagenzes (ohne Urease) werden in die Vertiefung "Probenblindprobe" aus Schritt 17.3 gegeben.
7. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um sie zu mischen, und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
8. Lesen Sie den OD₅₆₀ mit einem Tellerleser aus.
9. Berechnen Sie die Harnstoffkonzentration Gl (1) und rechnen Sie sie mit Gl (2) in BUN um.
   Harnstoff (mg/dl) = (Probe allein-Probe leer)/(Standard-Probe allein) x (Standard/4) x (Verdünnungsfaktor) (1)
   BUN (mg/dl) = Harnstoffkonzentration/2,14 (2)
   HINWEIS: Dieser Assay misst den Harnstoffgehalt (Molekulargewicht: 60) des Serums; BUN bezieht sich jedoch nur auf den Stickstoffgehalt von Harnstoff (Molekulargewicht: 28). Daher ist eine Korrektur von 2,14 (60/28) erforderlich, um die Harnstoffkonzentration in BUN umzurechnen.

Um die Rolle von tubulären Epithelzellen bei der Zytokinproduktion nach Cisplatin-induzierter AKI zu untersuchen, wurde Cisplatin in einer Konzentration von 20 mg/kg injiziert, gefolgt von einer intravenösen Injektion von 0,25 mg BFA am Tag 3 nach der Cisplatin-Injektion. Die Nieren wurden 6 h später entnommen. Paraffineingebettete Nieren wurden geschnitten und mit TGF-β, PDGF-D und CTGF gefärbt, repräsentativen Zytokinen, die für die Gewebereparatur bei AKI verantwortlich sind. Wie in Abbildung 2A gezeigt, werden TGF-β⁺ -Vesikel in PTCs, die mit LTL markiert sind, in Cisplatin-behandelten Nieren in Gegenwart von BFA beobachtet. In der Zwischenzeit wurden TGF-β⁺ -Vesikel in unverletzten oder BFA-unbehandelten Nieren nicht beobachtet.

Die Quantifizierung ergab eine Zunahme der TGF-β1⁺ -Fläche unter BFA-Behandlung bei Cisplatin-induzierter AKI (Abbildung 2B). Ähnlich wie TGF-β akkumulierten auch PDGF-D⁺ - oder CTGF⁺ -Vesikel bei Cisplatin-induzierter AKI unter BFA-Behandlung (Abbildung 2C und Abbildung 2E). Die Quantifizierung zeigte, dass PDGF-D⁺ - und CTGF⁺ -Flächen mit BFA in LTL⁺ -PTCs signifikant erhöht waren (Abbildung 2D und Abbildung 2F). Um die Wirkung der BFA-Behandlung auf die Nierenfunktion zu untersuchen, wurden die Plasma-BUN-Spiegel am Tag 3 nach der Cisplatin-Injektion gemessen. Wie in Abbildung 2G gezeigt, erhöhte die BFA-Injektion die BUN-Plasmaspiegel nicht signifikant.

Um zu untersuchen, welche Zytokine von interstitiellen Zellen bei Cisplatin-induzierter AKI sezerniert werden, wurden die Nieren auf TGF-β oder CTGF gefärbt und interstitielle Myofibroblasten mit α-SMA markiert. Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurden TGF-β⁺ -Vesikel in α-SMA-markierten interstitiellen Zellen in Cisplatin-AKI unter BFA-Behandlung beobachtet (Abbildung 3A). Um das Signal innerhalb der α-SMA⁺ -Zellen zu quantifizieren, wurde der α-SMA⁺ -Bereich umrissen und die positiven Zytokin- und α-SMA-Signale innerhalb des Bereichs quantifiziert. Die Quantifizierung zeigte, dass die TGF-β⁺ -Fläche im α-SMA⁺ -Bereich durch die BFA-Behandlung bei Cisplatin-AKI signifikant erhöht war (Abbildung 3B). Die CTGF⁺ -Vesikel nahmen auch unter der BFA-Behandlung zu (Abbildung 3C), und die Quantifizierung zeigte, dass die BFA-Behandlung das Verhältnis von ^CTGF+ -Fläche zu α-SMA⁺ -Fläche bei Cisplatin-induzierter AKI verbesserte (Abbildung 3D).

Um festzustellen, ob die BFA-Behandlung in Modellen für chronische Nierenschäden eingesetzt werden kann, wurde eine Nierenschädigung über drei Dosen AA induziert, die eine AKI induziert, die sich zu einer chronischen Schädigung mit reifer Nierenfibrose entwickelt und klinisch relevant für die CKD beim Menschen ist. BFA wurde am Tag 42 nach der AA-Injektion injiziert, und die Nieren wurden 6 Stunden später entnommen. Im Vergleich zu Cisplatin-induzierten Verletzungen waren TGF-β⁺ -Vesikel in PTCs in der chronischen Phase der AA viel kleiner. Es gab nur eine minimale positive Färbung in LTL⁺ PTCs; die Signalintensität von TGF-β in Molekül-1-positiven (KIM-1⁺) PTCs mit Nierenschädigung war jedoch unter BFA-Behandlung erhöht (Abbildung 3E). Die mittlere Intensität von TGF-β war bei BFA-Injektion 3-mal höher als ohne BFA (Abbildung 3F). Dieser Befund deutet darauf hin, dass die in vivo BFA-Injektion für die Immunfluoreszenzfärbung und in Kombination mit anderen Markern verwendet werden kann, um die Zytokinproduktion zelltypspezifisch zu bewerten.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Wirkmechanismus von BFA. (A) BFA blockiert den ER-zu-Golgi-Transport von Vesikeln, die zu sekretierende Proteine wie TGF-β enthalten. (B) BFA induziert den Aufbau von intrazellulären Zytokinen wie TGF-β in röhrenförmigen Epithelzellen der Niere. (C) Schematischer Querschnitt eines Mausschwanzes. Die Seitenvenen sind für die Injektion am besten zugänglich. Abkürzungen: BFA = brefeldin A; ER = endoplasmatisches Retikulum; TGF-β = transformierender Wachstumsfaktor-Beta; BFA- = BFA-negativ; BFA+ = BFA-positiv. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Immunfluoreszenz mit BFA-Injektion weist zytokinreiche Vesikel in tubulären Epithelzellen nach Cisplatin-induzierter akuter Nierenschädigung nach. (A) Repräsentative Bilder von TGF-β⁺ -Vesikeln am Tag 3 nach Verabreichung von Cisplatin (20 mg/kg) oder Kochsalzlösung. Maßstabsleiste = 20 μm. Die Pfeile zeigen TGF-β⁺ Vesikel in PTCs. (B) Quantifizierung von TGF-β⁺ Vesikel/Tubuli in Kochsalzlösung (n = 5), Kochsalzlösung + BFA (n = 5), Cis (n = 5), Cis + BFA (n = 5). (C) Repräsentative Bilder von PDGF-D-Vesikeln am Tag 3 nach Verabreichung von Cisplatin (20 mg/kg) oder Kochsalzlösung. Maßstabsbalken = 20 μm. (D) Quantifizierung von PDGF-D⁺ Vesikel/Tubuli in Kochsalzlösung (n = 4), Kochsalzlösung + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (E) Repräsentative Bilder von CTGF⁺ -Vesikeln am Tag 3 nach Verabreichung von Cisplatin (20 mg/kg) oder Kochsalzlösung. Maßstabsbalken = 20 μm. (F) Quantifizierung von CTGF⁺ Vesikel/Tubuli in Kochsalzlösung (n = 4), Kochsalzlösung + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (G) Plasma-BUN-Spiegel am Tag 3 nach Verabreichung von Cisplatin (20 mg/kg): Cisplatin (Cis) (n = 7) und Cisplatin + BFA (Cis + BFA) (n = 3). Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Bereiche, die durch gestrichelte weiße Kästchen begrenzt sind, werden im Einschubfenster mit höherer Vergrößerung angezeigt. Abkürzungen: BFA = brefeldin A; TGF-β = transformierender Wachstumsfaktor-Beta; Cis = Cisplatin; PDGF-D = Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor-D; CTGF = Bindegewebswachstumsfaktor; BUN = Blutharnstoffstickstoff; LTL = Lotus tetragonolobus Lektin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; HM = Hohe Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Zytokinreiche Vesikel, die in Myofibroblasten nach Cisplatin-induziertem akutem Nierenversagen und tubulären Epithelzellen in der chronischen Phase der Aristolochiasäure-Nephropathie beobachtet wurden. (A) Repräsentative Bilder von TGF-β⁺ -Vesikeln am Tag 3 nach Verabreichung von Cisplatin (20 mg/kg) oder Kochsalzlösung. Maßstabsleiste = 20 μm. Pfeile zeigen TGF-β⁺ -Vesikel in interstitiellen a-SMA⁺ -Zellen. (B) Quantifizierung der TGF-β⁺ -Fläche/α-SMA⁺ -Fläche in Kochsalzlösung (n = 4), Kochsalzlösung + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (C) Repräsentative Bilder von CTGF⁺ -Vesikeln am Tag 3 nach Verabreichung von Cisplatin (20 mg/kg) oder Kochsalzlösung. Maßstabsleiste = 20 μm. Pfeile zeigen CTGF⁺ -Vesikel in interstitiellen a-SMA⁺ -Zellen. (D) Quantifizierung der CTGF⁺ -Fläche/α-SMA⁺ -Fläche in Kochsalzlösung (n = 4), Kochsalzlösung + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (E) Repräsentative Bilder von TGF-β-gefärbten (roten) Nieren bei chronischer Aristolochiasäure-Nephropathie. Maßstabsbalken = 20 μm. (F) Quantifizierung der TGF-β⁺ Signalintensität / KIM-1⁺ PTCs in AAN (n = 6) und AAN + BFA (n = 6). Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. * p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Bereiche, die durch gestrichelte weiße Kästchen begrenzt sind, werden im Einschubfenster mit höherer Vergrößerung angezeigt. Abkürzungen: BFA = brefeldin A; TGF-β = transformierender Wachstumsfaktor-Beta; α-SMA = Alpha-glattes Muskelaktin; Cis = Cisplatin; CTGF = Bindegewebswachstumsfaktor; KIM-1 = Molekül für Nierenversagen-1; LTL = Lotus tetragonolobus Lektin; AAN = Aristolochiasäure-Nephropathie; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol; HM = hohe Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Es ist bekannt, dass Nieren-PTCs AKI und CKD durch die Sekretion von TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor sowie vielen anderen Proteinen regulieren 20,21,22,23. In ähnlicher Weise sezernieren Glomeruli, distale Tubuli und andere Nierenepithelzellen sowie interstitielle Zellen diese und/oder andere Proteine während einer Verletzung 24,25,26. Der relative Beitrag jedes dieser Zelltypen zur Zytokinsekretion ist schwer zu klären, da Zytokine kurz nach ihrer Produktion sezerniert werden. Während die In-situ-Hybridisierung und andere RNA-Färbetechniken verwendet werden können, um die RNA von sezernierten Proteinen zu färben, ist es schwierig, diese Techniken mit der Färbung auf zelltypspezifische Marker oder Verletzungsmarker zu kombinieren. Alternativ kombinieren viele Studien In-vivo-Ergebnisse mit In-vitro-Experimenten, die an kultivierten Nierenzellen durchgeführt wurden. In diesem Fall werden Daten zu Nierenschäden mit Daten zur Zytokinsekretion aus kultivierten Zellen verknüpft, um Schlussfolgerungen zu ziehen, die nur begrenzt auf die In-vivo-Situation übertragbar sind.

Das Aufkommen der Next-Generation-Sequenzierung und der Einzelzell-RNAseq hat die Klassifizierung von Zelltypen anhand der Genexpression und die Identifizierung anderer Gene ermöglicht, die von jedem Zelltyp exprimiert werden²⁷. Dies liefert zwar exquisite Details auf Populationsbasis, lässt aber oft viele der anatomischen und pathologischen Daten aus, die aus Nierenschnitten gewonnen werden können. Darüber hinaus identifiziert die Einzelzellsequenzierung oft nur die wichtigsten 3.000 bis 7.000 Gene, die in jeder Zelle exprimiert werden, was möglicherweise nicht genügend Tiefe bietet, um alle interessierenden Zytokine zu screenen²⁸. Diese Arbeit bietet eine Alternative zu diesen Ansätzen. Durch die Verwendung von BFA zur Blockierung der Proteinsekretion kann Nierengewebe unter Verwendung von Standard-Immunfluoreszenztechniken direkt auf Zytokine und andere Proteine von Interesse, einschließlich Zelltypmarkern, gefärbt werden.

TGF-β, PDGF-D und CTGF gehören zu den am häufigsten untersuchten Zytokinen bei Nierenschäden. Alle drei sind dafür bekannt, dass sie als zweischneidige Schwerter wirken, die die Genesung nach AKI fördern und gleichzeitig zum Fortschreiten der Fibrose bei CKD beitragen^29,30. Es ist zwar bekannt, dass Nierentubuli-Epithelzellen und interstitielle Zellen möglicherweise TGF-β, PDGF-D und CTGF bei Nierenschäden sezernieren können, aber die direkte Identifizierung des Zelltyps und der relativen Produktion bleibt eine Herausforderung. In der aktuellen Studie haben wir uns entschieden, TGF-β, PDGF-D und CTGF in Nieren während Cisplatin-induzierter AKI und TGF-β im AAN CKD-Modell zusammen mit dem PTC-Marker LTL, dem PTC-Verletzungsmarker KIM-1 oder dem Myofibroblastenmarker α-SMA zu färben. Dies wird es ermöglichen zu bestimmen, ob PTCs oder Myofibroblasten diese Zytokine produzieren und wie hoch die relativen Expressionsniveaus zwischen den Versuchsgruppen sind.

Bei Mäusen, die nur mit BFA behandelt wurden, gab es wenig bis keine positive Färbung eines der beiden Zytokine. Ebenso führte die Behandlung mit Cisplatin nur zu einem marginalen Anstieg der Zytokinfärbung. Die Kombination von Cisplatin-Schädigung mit einer BFA-Behandlung für 6 Stunden führte zu einem dramatischen Anstieg der intrazellulären positiven Signale aller drei Zytokine, was darauf hindeutet, dass diese Zytokine normalerweise sezerniert werden. In ähnlicher Weise zeigte nur die Cisplatin + BFA-Gruppe einen signifikanten Anstieg des TGF-β- und CTGF-Signals in interstitiellen α-SMA⁺-Zellen. Im chronischen AAN-Modell, in dem TGF-β mit einer pathologischen Reaktion assoziiert ist, induzierte die AA-Injektion allein eine gewisse TGF-β-Färbung, insbesondere bei verletzten KIM-1⁺ PTCs. Die BFA-Behandlung erhöhte das positive intrazelluläre Signal in KIM-1⁺ PTCs (PTCs sind die einzigen bekannten Nierentubuli-Zellen, von denen bekannt ist, dass sie KIM-1 exprimieren³¹). Interessanterweise zeigten LTL⁺ KIM-1⁺ oder LTL⁺ KIM-1^- PTCs keine signifikante TGF-β Färbung, während LTL-KIM-1⁺ PTCs eine höhere TGF-β-Positivität aufwiesen. Der Verlust der LTL-Färbung deutet darauf hin, dass die PTCs, die höhere Spiegel an TGF-β exprimieren, in der chronischen Phase der Verletzung sowohl verletzt als auch dedifferenziert sind. Bei diesem Phänotyp handelt es sich wahrscheinlich um die zuvor beschriebene maladaptive Reparatur^32,33. Die BFA-Behandlung zeigt also, dass TGF-β in PTCs nach AKI und während der CKD exprimiert wird.

Während sich die aktuelle Studie auf die Immunfluoreszenzfärbung konzentriert, ist es wichtig zu beachten, dass die BFA-Behandlung mit anderen Assays kombiniert werden kann. Wenn das Experiment beispielsweise keine Identifizierung des Zelltyps erfordert, der das Protein von Interesse sezerniert, könnte man BFA injizieren und einen Immunoblot oder ELISA an ganzen Nierenlysaten in Kontroll- und Versuchsgruppen durchführen. Ein weiterer Assay, der in Betracht gezogen werden könnte, ist die Durchflusszytometrie. Die BFA-Behandlung wurde in immunologischen Studien mit der Durchflusszytometrie kombiniert, um die relative Produktion von Zytokinen in verschiedenen Zelltypen zu bestimmen¹⁵. Während die Trennung von Nierenepithelzellen aus Nierengewebe in einzelne Zellen eine Herausforderung darstellen kann, kann die Durchflusszytometrie in Laboratorien, die die Technik etabliert haben, eine Alternative sein. Darüber hinaus kann die BFA-Behandlung für In-vitro-Zellkulturstudien in allen oben aufgeführten Assays verwendet werden.

Die aktuelle Studie beschreibt zwei der gebräuchlichsten Gewebepräparationsmethoden, fixiertes paraffineingebettetes Gewebe und gefrorenes Gewebe, die für die in der Studie verwendeten Antikörper gut funktionieren. Angesichts der Variabilität von Antikörpern ist es jedoch wahrscheinlich, dass Forscher, die diese Technik anwenden, je nach Antikörper die Färbeprotokolle oder die Gewebeverarbeitung weiter standardisieren müssen. Da Zytokine normalerweise sezerniert werden, werden nur wenige Anti-Zytokin-Antikörper für die Färbung im Gewebe getestet. Um die Standardisierung des Protokolls zu beschleunigen, empfehlen wir, Positivkontrollen zu erstellen, bei denen Organe, von denen bekannt ist, dass sie die interessierenden Zytokine sezernieren, nach der BFA-Behandlung entnommen werden. So könnte beispielsweise Milz von Tieren, die mit Lipopolysacchariden und BFA behandelt wurden, als positives Kontrollgewebe für viele verschiedene Zytokine dienen. Die Entnahme von Milz und die Verarbeitung als in Paraffin eingebettetes oder gefrorenes Gewebe würde eine schnellere Standardisierung der Antikörperkonzentration und der Puffer ermöglichen. Wenn die Anti-Zytokin-Antikörper so charakterisiert wurden, dass sie Zytokine in ihrer nativen Konformation in vitro färben, ist es wahrscheinlicher, dass diese Antikörper ihr Ziel im weniger verarbeiteten gefrorenen Gewebe erkennen.

Die BFA-Behandlung kann zwar ein mächtiges Instrument bei der Messung sekretierter Proteine sein, ist aber nicht ohne Einschränkungen. Die offensichtlichste Einschränkung besteht darin, dass das sezernierte Protein, das analysiert wird, dem ER-Golgi-Sekretionsweg folgen muss. andernfalls kann BFA nur eine begrenzte Wirkung haben. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass Tiere, die mit BFA behandelt wurden, in anderen experimentellen Versuchen veränderte Ergebnisse aufweisen können. Zum Beispiel sind einige Biomarker für Nierenverletzungen, wie z. B. KIM-1, auf den ER-Golgi-Transport angewiesen, um auf der Zelloberfläche präsentiert zu werden. Daher wird der KIM-1-Spiegel im Urin bei BFA-behandelten Tieren wahrscheinlich reduziert sein. Darüber hinaus besteht die Befürchtung, dass BFA zu erhöhtem zellulärem Stress führen kann. Dieses Problem kann zwar durch eine Verkürzung der Zeit der BFA-Behandlung gemildert werden, sollte aber in Betracht gezogen werden. In dieser Studie wurde kein signifikanter Anstieg des BUN beobachtet; Es gab jedoch einen Anstieg von ~10 %. Daher ist bei der Entscheidung über andere Ziele oder Marker, die bei BFA-behandelten Tieren analysiert werden sollen, Vorsicht geboten.

Diese Studie zeigt, dass BFA verwendet werden kann, um die Sekretion von Proteinen zu blockieren, was zum intrazellulären Aufbau von Zytokinen führt, die mit Standard-Immunfluoreszenztechniken gefärbt werden können. Dies ermöglicht die Identifizierung der Zelltypen, die spezifische Zytokine oder andere Proteine sezernieren, und die Quantifizierung der Zytokinproduktion durch diese Zellen. Der andere Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass histologische und pathologische Daten in denselben oder benachbarten seriellen Schnitten aufbewahrt und analysiert werden können. Somit bietet die BFA-Behandlung einen kostengünstigen und relativ einfachen Ansatz zur Untersuchung der Zytokinproduktion im Nierengewebe.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

American Heart Association (AHA): Kensei Taguchi, 20POST35200221; Das Gesundheitswesen | NIH | Nationales Institut für Diabetes und Verdauungs- und Nierenkrankheiten (NIDDK): Craig Brooks, DK114809-01 DK121101-01.