Identification de la source des protéines sécrétées dans le rein par injection de Brefeldin A

L’identification du type de cellule responsable de la sécrétion de cytokines est nécessaire pour comprendre la pathobiologie de la maladie rénale. Ici, nous décrivons une méthode pour colorer quantitativement le tissu rénal pour les cytokines produites par les cellules épithéliales ou interstitielles rénales à l’aide de la bréfeldine A, un inhibiteur de sécrétion, et de marqueurs spécifiques au type de cellule.

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est l’une des dix principales causes de décès aux États-Unis. L’insuffisance rénale aiguë (IRA), bien que souvent guérissable, prédispose les patients à l’IRC plus tard dans la vie. Les cellules épithéliales rénales ont été identifiées comme des nœuds de signalisation clés dans l’IRA et l’IRC, par lesquels les cellules peuvent déterminer l’évolution de la maladie grâce à la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. Dans l’IRC en particulier, plusieurs éléments de preuve ont démontré que les cellules tubulaires mal réparées entraînent la progression de la maladie par la sécrétion du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), du facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) et d’autres cytokines profibrotiques. Cependant, l’identification de la source et du nombre relatif de protéines sécrétées par différents types de cellules in vivo reste difficile.

Cet article décrit une technique utilisant la brefeldine A (BFA) pour empêcher la sécrétion de cytokines, permettant la coloration des cytokines dans le tissu rénal à l’aide de techniques d’immunofluorescence standard. Le BFA inhibe le transport du réticulum endoplasmique (RE) vers l’appareil de Golgi, qui est nécessaire à la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. L’injection de BFA 6 h avant le sacrifice entraîne une accumulation de TGF-β, de PDGF et de CTGF à l’intérieur des cellules des tubules proximaux (PTC) dans un modèle murin de cisplatine de l’IRA et du TGF-β dans un modèle murin d’acide aristolochique (AA) de l’IRC. L’analyse a révélé que BFA + cisplatine ou BFA + AA augmentait significativement le signal positif TGF-β par rapport à BFA + solution saline, cisplatine ou AA seul. Ces données suggèrent que la BFA peut être utilisée pour identifier le type de cellule produisant des cytokines spécifiques et quantifier les quantités relatives et/ou les différents types de cytokines produites.

On estime que >10 % de la population mondiale souffre d’une forme de maladie rénale¹. Définie par son apparition rapide, l’IRA est en grande partie curable ; cependant, un épisode d’IRA peut prédisposer les patients à développer une MRC plus tard dans la vie ^2,3. Contrairement à l’IRA, l’IRC est caractérisée par une fibrose progressive et une aggravation de la fonction rénale, conduisant à une insuffisance rénale terminale nécessitant un traitement de remplacement rénal. La plupart des lésions rénales ciblent les cellules épithéliales spécialisées, telles que les podocytes ou les cellules tubulaires proximales, qui composent le néphron ^4,5. Après une blessure, les cellules épithéliales survivantes aident à coordonner la réponse de réparation par la sécrétion de cytokines et d’autres protéines. De cette façon, les cellules survivantes peuvent moduler la réponse immunitaire, diriger le remodelage de la matrice extracellulaire et aider à la récupération des organes.

Les cytokines sont de petites protéines sécrétées essentielles à la modulation de la maturation, de la croissance et de la réactivité des organismes multicellulaires ^6,7. Ils fonctionnent comme des messagers de signaux entre divers types de cellules, y compris les cellules immunitaires et épithéliales⁸. Bien que l’on pense que les cytokines sont sécrétées principalement par les cellules immunitaires, des recherches de longue date ont démontré que les cellules épithéliales et interstitielles rénales sécrètent également des cytokines comme signaux pour d’autres cellules rénales résidentes, telles que les cellules tubulaires, les cellules interstitielles et les cellules immunitaires ^9,10. Les PTC, en particulier, jouent un rôle important dans la phase d’initiation et de récupération après l’IRA¹¹. Cependant, les PTC mal réparés sont connus pour sécréter des cytokines profibrotiques telles que le facteur de croissance transformant-β (TGF-β), le facteur de croissance dérivé des plaquettes-D (PDGF-D) et le facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF), contribuant à la progression de l’IRC¹². Ainsi, les cellules épithéliales rénales utilisent des cytokines sécrétées pour moduler les lésions rénales.

Bien que l’on sache que les cellules épithéliales rénales sécrètent des cytokines, la source exacte et la contribution relative de chaque type de cellule ont été difficiles à déterminer en raison des défis techniques liés à l’étude des protéines sécrétées¹³. La cytométrie en flux, une approche couramment utilisée pour mesurer les cytokines, est difficile à réaliser sur les reins lésés, en particulier chez les reins très fibreux. Avec la recombinase Cre pilotée par un promoteur de cytokines, les souris rapporteures de cytokines sont souvent utilisées pour identifier le type de cellule qui exprime une cytokine donnée. Cependant, l’utilisation de souris rapporteures est limitée en raison de la nécessité de croiser des souris rapporteures dans divers contextes de knock-out, du manque de rapporteurs appropriés et du fait qu’une seule cytokine peut être analysée à la fois. Ainsi, il est nécessaire de développer une technique simple, polyvalente et abordable pour détecter les cellules rénales libérant des cytokines.

Nous avons émis l’hypothèse que l’injection de BFA, un inhibiteur de sécrétion qui bloque le transport du réticulum endoplasmique-Golgi in vivo, permettrait la coloration des protéines sécrétées dans le tissu rénal (Figure 1A,B), comme le montrent les tests basés sur la cytométrie en flux^14,15. Avec des fabricants spécifiques de type de cellule, cette technique pourrait être utilisée pour identifier la source et la contribution relative des cellules productrices de cytokines dans les reins lésés. Contrairement aux échantillons de cytométrie en flux, les tissus fixes peuvent être conservés à long terme avec la préservation des protéines et des structures cellulaires, ce qui permet une étude plus approfondie des cellules sécrétoires. Pour tester cette hypothèse, des reins de souris ont été blessés avec un modèle d’IRA (cisplatine) et un modèle de CKD (néphropathie acide aristolochique (NAA)), injectés avec BFA et colorés à l’aide de techniques immunofluorescentes standard.

Toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au protocole d’utilisation des animaux approuvé par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université Vanderbilt.

1. Animaux

1. Utiliser des souris mâles BALB/c âgées de 8 à 12 semaines (poids corporel : environ 25 g) pour la néphropathie induite par l’acide cisplatine ou aristolochique.
2. Assurez-vous que les souris sont en bonne santé et qu’elles ne présentent aucun signe évident de détresse ou de blessure causée par le combat.
   REMARQUE : Les blessures, en particulier à la queue, pourraient interférer avec le protocole décrit ici. Les souris BALB/c ont été choisies parce qu’il est plus facile de visualiser la veine de la queue pour l’injection chez ces souris. Le protocole décrit ici fonctionne pour d’autres souches de souris ; Cependant, la posologie du cisplatine ou de l’acide aristolochique peut différer d’une souche à l’autre.

2. Injection de cisplatine

1. Dissoudre le cisplatine dans une solution saline stérile jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL.
   REMARQUE : Le cisplatine ne se dissout pas complètement à température ambiante. Il doit être manipulé dans une hotte.
2. Réchauffez la solution de cisplatine dans un bain-marie à 37 °C et agitez à plusieurs reprises jusqu’à ce que le cisplatine soit complètement dissous.
3. Pesez les souris et calculez le volume de solution de cisplatine nécessaire pour injecter 20 mg/kg de poids corporel (p.c.).
4. Désinfectez la peau abdominale à l’aide d’écouvillons à la povidone iodée (7,5 %) et à l’alcool (70 %) en alternant 3 fois chacun.
5. À l’aide d’une seringue à insuline munie d’une aiguille de 25 G, injectez la solution de cisplatine par voie intrapéritonéale.
6. Passer à la section 4 le 3e jour après l’injection.

3. Injection d’acide aristolochique (AA)

1. Dissoudre l’acide aristolochique-I dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration finale de 0,5 mg/mL.
   REMARQUE : AA doit être manipulé dans une hotte. L’AA-I doit être utilisé car c’est la forme dominante induisant des lésions rénales.
2. Réchauffez la solution AA dans un bain-marie à 37 °C et agitez à plusieurs reprises jusqu’à ce qu’elle soit complètement dissoute.
3. Pesez les souris et calculez le volume de la solution d’AA à injecter à 5 mg/kg p.c.
4. Désinfectez la peau abdominale à l’aide d’un tampon de povidone iodé (7,5 %) et d’alcool (70 %) 3 fois.
5. À l’aide d’une seringue à insuline munie d’une aiguille de 25 G, injectez la solution d’AA par voie intrapéritonéale.
6. Injectez AA tous les deux jours pour un total de 3 injections.
7. Passer à la section 4 le 42e jour après la dernière injection.

4. Préparation de la solution BFA

1. Dissoudre le BFA dans du diméthylsulfoxyde à une concentration de 10 mg/mL pour obtenir une solution mère.
2. Conservez la solution mère à -20 °C.
3. Diluer la solution mère de BFA avec du PBS stérile à la concentration de travail finale de 1,25 mg/mL
   REMARQUE : Préparez une solution de travail fraîche à chaque fois immédiatement avant l’injection.

5. Injection de BFA dans la veine caudale

1. Avant l’injection, mettez la cage à moitié sur un coussin chauffant pendant 10 minutes pour vous assurer que les souris sont au chaud afin d’éviter une baisse de la température corporelle, ce qui peut provoquer une vasoconstriction des vaisseaux de la queue et interférer avec l’injection.
   REMARQUE : Placez la cage sur les coussins chauffants de sorte que la moitié de la cage soit sur le coussin tandis que l’autre moitié ne l’est pas. De cette façon, lorsque les souris se sentent chaudes, elles peuvent se déplacer de l’autre côté de la cage et vice versa.
2. Immobiliser les souris à l’aide de dispositifs de contention de taille appropriée disponibles dans le commerce.
3. Désinfectez la queue à l’aide de povidone iodée et d’un tampon d’alcool trois fois comme décrit ci-dessus.
4. Tenez la queue horizontalement et visualisez les nervures latérales de la queue (Figure 1C). Utilisez une source de lumière sous la queue pour aider à visualiser les veines.
5. Insérez une aiguille de 28 G, en gardant l’aiguille et la seringue parallèles à la veine dans la direction de la tête.
6. Injecter 200 μL de la solution de BFA à 1,25 mg/mL (0,25 mg de BFA). Attendez que la veine devienne claire car le sang est remplacé par la solution d’injection, indiquant que l’injection a réussi.
7. Retirez l’aiguille et appuyez doucement sur la queue jusqu’à ce que le saignement cesse.
8. Remettez les souris dans la cage et surveillez-les pour détecter d’autres saignements ou des signes de détresse.

6. Sacrifice et récolte des reins

1. Euthanasier les souris avec une surdose d’isoflurane suivie d’une luxation cervicale 6 h après l’injection de BFA.
   REMARQUE : Le point temporel de 6 heures a été choisi sur la base de la littérature démontrant que 6 h de traitement BFA dans d’autres organes permettent une accumulation suffisante de cytokines dans les cellules pour les visualiser par coloration immunofluorescente¹⁶.
2. Immédiatement après le sacrifice, exposez l’abdomen et le cœur de la souris par une incision médiane ventrale.
3. Prélever 100 à 500 μL de sang pour un dosage de l’azote uréique du sang (BUN) par ponction cardiaque. Utilisez des aiguilles de 25 g avec des seringues d’insuline de 1 ml pour prélever le sang. Pour prévenir la coagulation, ajoutez 5 μL de solution d’héparine (100 mg/15 mL de dH₂O) à chaque échantillon.
   REMARQUE : Un minimum de 20 μL de sang est nécessaire pour le dosage de l’urgie ; cependant, environ 500 μL peuvent être collectés par ponction cardiaque après l’euthanasie, ce qui pourrait être utile pour d’autres tests. Prélevez autant de sang que possible.
4. Conservez les échantillons de sang sur de la glace jusqu’à ce que les reins soient prélevés dans la section 7 ci-dessous.
   1. Centrifuger les échantillons de sang à 1 300 × g pendant 10 min.
   2. Isolez délicatement le plasma et conservez-le à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer le dosage BUN dans la section 17 ci-dessous. Vous pouvez également stocker les échantillons de plasma pour les tests de créatinine.

7. Perfusion et ablation des reins

1. Perfuser la souris avec 10 à 20 ml de PBS à travers le ventricule gauche à l’aide d’une seringue de 20 ml à un débit de 2 à 4 ml/min jusqu’à ce que le perfusat devienne clair.
2. Retirez les reins en tenant l’artère rénale et la veine avec des pinces près de la papille et en coupant les vaisseaux du côté opposé au rein.
3. Retirez délicatement la capsule rénale en la décollant à la main ou à l’aide d’une paire de pinces fines et stériles.
4. En fonction de l’anticorps, passer à la section 8 pour la préparation des tissus fixés inclus dans la paraffine ou à la section 10 pour la préparation des tissus congelés fixés.
   REMARQUE : Le traitement des tissus devra être optimisé pour chaque anticorps à utiliser pour la coloration.

8. Tissu inclus en paraffine pour la coloration TGF-β et PDGF-D

1. Coupez le rein en deux en le plaçant sur une lame de verre propre et en le coupant horizontalement avec une nouvelle lame de rasoir. Placer la moitié dans 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans du PBS pendant 24 h sur un rotateur bout à bout à une vitesse de 10 rotations par minute (tr/min).
   REMARQUE : Le rein entier n’est pas nécessaire pour la section. Une moitié du rein peut être stockée ou utilisée pour d’autres tests.
2. Remplacez le PFA par de l’éthanol à 70 %.
3. À ce stade, soumettez la moitié rénale pour le traitement et l’intégration de la paraffine, puis sectionnez les tissus rénaux inclus dans la paraffine à 4-6 μm à l’aide d’un microtome et montez-les sur des lames chargées et prénettoyées^17,18.
   REMARQUE : Les reins ont été traités et incorporés dans de la paraffine par la ressource partagée de pathologie translationnelle du centre médical de l’Université Vanderbilt et stockés à température ambiante.

9. Déparaffinisation et réhydratation

1. Placez les lames dans un support de coloration pour lames et plongez-les dans un puits de coloration contenant du D-limonène pendant 5 min, en vous assurant que le tissu est complètement immergé. Répétez l’opération dans un puits contenant du D-Limonène frais.
2. Réhydratez les tissus en trempant les lames dans des dilutions successives d’éthanol à 100 % (2x), 95 %, 90 % et 70 % pendant 5 minutes chacune.
3. Laver les lames à l’eau dH₂O pendant 5 min.
4. Effectuer le prélèvement de l’antigène en incubant les sections dans un tampon de citrate (pH 6,0) dans un autocuiseur à 121 °C et 15 psi pendant 45 min.
5. Lavez les lames à coulant dH₂O pendant 20 min.
6. Passez à l’article 12.

10. Préparation de tissus congelés pour la coloration CTGF

1. Coupez le rein en deux le long de l’axe horizontal à l’aide d’une lame de rasoir fraîche.
   REMARQUE : Le rein entier n’est pas nécessaire pour la section. Une moitié du rein peut être stockée ou utilisée pour d’autres tests.
2. Mettre la moitié du rein dans 10 mL de PFA à 0,5 % dans un tube de 15 mL sur un rotateur pendant 2 h à 4 °C à une vitesse de 10 tr/min.
3. Décanter le PFA dans un récipient pour une élimination appropriée et ajouter 10 mL de glycine 0,1 M dans du PBS pendant 1 h à 4 °C à une vitesse de 10 tr/min.
4. Décantez la glycine, ajoutez 10 ml de saccharose à 15 % dissous dans du PBS et placez le tube sur un rotateur pendant une nuit à 4 °C et 10 tr/min.
5. Décantez le saccharose à 15 % et remplacez-le par 10 ml de saccharose à 30 % dissous dans du PBS pendant 1 h à 4 °C et 10 tr/min.
6. Remplissez le moule d’enrobage avec un composé à température de coupe optimale (OCT) et enfoncez la moitié du rein à partir de l’étape 10.5 avec la surface coupée du rein vers le bas.
7. Placez soigneusement le moule contenant le demi-rein et l’OCT dans une flaque d’azote liquide pour le congeler.
   REMARQUE : Ne laissez pas l’azote liquide entrer directement en contact avec l’OCT car cela peut entraîner la formation de bulles. Un équipement de protection individuelle approprié doit être porté lors de l’utilisation d’azote liquide, comme des lunettes de protection/un écran facial, des gants cryogéniques et une blouse de laboratoire. Il est préférable d’utiliser de longues pinces, ~25 cm, pour placer les moules dans de l’azote liquide.
8. Une fois congelé, stockez le moule à -80 °C.

11. Section congelée

1. Assurez-vous que le cryostat est à -20 °C.
2. Stocker les moules contenant des échantillons en OCT dans le cryostat à -20 °C pendant 2 h pour équilibrer la température.
3. Retirez le moule en tenant les languettes et en appuyant par le bas.
4. Placez l’OCT frais sur un porte-échantillon et placez le bloc d’échantillon congelé sur le dessus, le côté tissu tourné vers le dos du porte-échantillon.
5. Placez le porte-échantillon et l’échantillon sur l’étagère de congélation.
6. Placez un extracteur de chaleur lesté sur le dessus du bloc pour aplatir la surface. Gardez le couvercle du cryostat fermé lorsqu’il n’est pas utilisé pour éviter les fluctuations de température.
7. Une fois que l’OCT frais entre le bloc d’échantillon et le porte-échantillon est congelé, assurez-vous que la connexion est sécurisée.
8. Fixez le porte-échantillon sur la tête du microtome du cryostat.
9. Commencez la section jusqu’à ce que le tissu soit visible dans le bloc d’échantillons.
10. Sectionnez le tissu rénal à 4-6 μm et prélevez les sections sur une lame¹⁹ chargée de température ambiante.
11. Une fois le mouchoir ramassé, conservez la lame à une température de -20 °C à -80 °C jusqu’au moment de la coloration. Ne le laissez pas décongeler jusqu’au moment de commencer à teindre.
12. Avant de teindre, retirez la ou les lames de l’entreposage et laissez-les réchauffer à température ambiante. Ne laissez pas les sections sécher.
13. Une fois à température ambiante, laver immédiatement les sections avec du PBS pendant 5 minutes deux fois à température ambiante pour éliminer le composé OCT.
14. Passez à l’article 12.

12. Coloration par immunofluorescence

1. Tracez le contour des sections de tissu à l’aide d’un marqueur de barrière hydrophobe. Maintenez une distance d’au moins 5 mm entre le tissu et le contour de la barrière hydrophobe.
2. Ajouter 50 μL de tampon de blocage contenant 3 % de sérum d’ânesse et 0,1 % de Triton dans 1 % de sérum de bovin, d’albumine/solution saline tamponnée au Tris (TBS) sur le dessus de la section et incuber pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
3. Diluez les anticorps primaires avec du PBS à la concentration appropriée. Pour la détection des cytokines, utilisez 50 μL de solutions d’anticorps primaires dirigés contre le TGF-β1 (1:200), le PDGF-D (1:400) et le CTGF (1:200). Pour le marquage des myofibroblastes, utiliser 50 μL d’une solution de l’anticorps primaire dirigé contre l’actine du muscle alpha-lisse (α-SMA) conjuguée à Cy3 à 1:200.
4. Retirez la solution bloquante et ajoutez les anticorps primaires dans la section, en veillant à ce qu’elle ne s’échappe pas du contour hydrophobe circulaire et incubez toute la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée. Réappliquez la barrière hydrophobe en cas de fuite.
5. Laver 3 fois avec du PBS pendant 5 min.
6. Diluez les anticorps secondaires appropriés à 1:200 avec du PBS.
7. Incuber les échantillons avec 50 μL de solutions d’anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
8. Laver avec du PBS pendant 5 min.
9. Lectine de lotus tetragonolobus diluée (LTL) conjuguée à la fluorescéine dans du PBS avec Ca²⁺ et Mg²⁺ à la concentration de 10 μg/mL.
   REMARQUE : Ca²⁺ et Mg²⁺ sont nécessaires pour la liaison LTL.
10. Incuber les tissus avec 50 μL de solution LTL pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humidifiée.
11. Laver avec du PBS avec Ca²⁺ et Mg²⁺ pendant 5 min.
12. Incuber avec 50 μL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 5 μg/mL dans l’eau) pour colorer l’ADN et les noyaux pendant 5 minutes à température ambiante.
13. Montez les lamelles en ajoutant 20 μL de réactif de montage anti-décoloration sur le tissu et en plaçant lentement la lamelle. Attendez 24 h pour que le réactif anti-décoloration se solidifie avant d’imager.
    REMARQUE : La liaison des lectines peut se dégrader avec le temps, entraînant une perte de signal. Il est préférable d’imager les échantillons colorés à la lectine peu de temps après la mise en place du réactif de montage. Si une perte de signal est observée, Ca²⁺ et Mg²⁺ peuvent être ajoutés au réactif de montage pour préserver la coloration.

13. Acquisition d’images

1. Allumez le microscope inversé (voir le tableau des matériaux) avec une platine XY automatisée.
2. Sélectionnez l’objectif 20x.
3. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images (voir la Table des matériaux).
4. Cliquez sur Live pour ouvrir la fenêtre d’affichage en direct.
5. Trouvez la section du tissu et assurez-vous qu’elle est nette.
6. Cliquez sur le menu Acquérir et sélectionnez Numériser une grande image.
7. Dans la fenêtre Scanner une grande image , configurez la zone à numériser en déplaçant la platine à l’aide du joystick vers la partie la plus à gauche de la section de tissu et cliquez sur la flèche gauche. Répétez l’opération pour les segments tissulaires supérieur, le plus à droite et inférieur.
8. Cliquez sur le menu d’acquisition .
9. Assurez-vous que la case pour les grandes images est cochée.
   1. Si vous capturez des images multicanaux, cliquez sur l’onglet Lambda .
   2. Cliquez sur chaque canal et réglez le temps d’exposition à un niveau où la coloration est apparente sans saturation d’aucune partie de l’image.
      REMARQUE : Ces paramètres doivent être cohérents au sein d’un groupe expérimental. La modification des paramètres d’acquisition entre les échantillons entraînera des résultats inexacts.
   3. Répétez l’étape 9.2 pour chaque canal à collecter.
10. Cliquez sur Scan.

14. Analyse d’images

1. Ouvrez le logiciel d’acquisition d’images.
2. Cliquez sur Fichier | Ouvrez et sélectionnez l’image.
3. Faites un clic droit sur la fenêtre de l’image et choisissez la région d’intérêt polygonale (ROI).
4. Décrivez le retour sur investissement à l’aide de l’outil à main levée . Décrivez les cellules tubules LTL-positives ou les cellules interstitielles α-SMA positives.
5. Cliquez sur l’onglet Mesure | Seuil.
6. Configurez les limites supérieure et inférieure du seuil en ajustant les curseurs de chaque côté de la zone de signal positif.
7. Cliquez sur l’onglet ROI .
8. Cliquez sur l’icône Exporter pour enregistrer les valeurs. Utilisez un tableur pour calculer le pourcentage de zone de signal positif/zone de retour sur investissement.

15. Alternative : Analyse d’images avec un logiciel libre (ImageJ)

1. Ouvrez ImageJ.
2. Cliquez sur Fichier | Ouvrir pour afficher une image.
3. Cliquez sur Sélections à main levée.
4. Sélectionnez le retour sur investissement en le décrivant à l’aide de l’outil à main levée . Décrivez les cellules tubules LTL-positives ou les cellules interstitielles α-SMA positives.
5. Cliquez sur le menu Edition et sélectionnez Effacer à l’extérieur.
6. Cliquez sur Analyser et sélectionnez Mesurer pour déterminer la zone de retour sur investissement.
7. Aller à l’image | Couleur | Diviser les chaînes.
8. Ajustez les limites supérieure et inférieure du seuil pour détecter la zone du signal positif.
9. Cliquez sur Analyser et sélectionnez Mesurer.
10. Enregistrez les données.
11. Ouvrez les données à l’aide d’un tableur et calculez le rapport entre la surface du signal positif et la zone ROI.

16. En option : Imagerie avec microscope confocal à balayage laser

REMARQUE : Pour obtenir des images à plus haute résolution pour la publication, la microscopie confocale à balayage fournit des images plus claires et un bruit de fond réduit dans le tissu rénal.

1. Allumez le microscope confocal à balayage laser (voir le tableau des matériaux).
2. Sélectionnez l’objectif 40x (voir le tableau des matériaux).
3. Cliquez sur l’onglet Localiser et recherchez les tissus en ajustant la mise au point.
4. Allez dans l’onglet Acquisition , cliquez sur Canaux, puis choisissez 1 AU dans le paramètre sténopé.
5. Ajustez l’intensité du gain laser dans chaque canal de sorte que le signal positif soit visible mais non saturé. Assurez-vous que les paramètres d’un ensemble d’échantillons expérimentaux restent constants.
6. Cliquez sur Snap (Snap ) et enregistrez l’image dans le format souhaité.

17. Taux plasmatique d’azote urétique

1. Retirez les échantillons à -20 °C et décongelez-les sur de la glace.
2. Diluer le plasma avec du dH₂O dans un rapport de 1:10.
3. Pour chaque échantillon, mettez en place trois réactions distinctes en double dans une plaque à 96 puits.
   1. Pour l’échantillon plus l’étalon, ajoutez 5 μL d’urée à 200 mg/dL et 20 μL de plasma dilué.
   2. Pour l’échantillon seul, ajouter 5 μL de_dH2O et 20 μL de plasma dilué.
   3. Pour un échantillon à blanc, ajouter 5 μL de dH₂O et 20 μL de plasma dilué.
4. Mélanger 85 μL de réactif + 1 μL d’uréase par échantillon pour préparer la solution de travail.
5. Ajouter 80 μL de la solution de travail dans les puits « échantillon plus étalon » et « échantillon seul ».
6. Ajoutez 80 μL de réactif (sans uréase) dans le puits « blanc d’échantillon » de l’étape 17.3 ci-dessus.
7. Tapotez doucement la plaque pour mélanger et incubez pendant 5 min à température ambiante.
8. Lisez OD₅₆₀ avec un lecteur de plaques.
9. Calculez la concentration d’urée Eq (1) et convertissez-la en BUN à l’aide de Eq (2).
   Urée (mg/dL) = (Échantillon seul-Échantillon blanc)/(Étalon-Échantillon seul) x (Étalon/4) x (Facteur de dilution) (1)
   BUN (mg/dL) = concentration d’urée/2,14 (2)
   REMARQUE : Ce test mesure la teneur en urée (poids moléculaire : 60) du sérum ; cependant, BUN ne fait référence qu’à la teneur en azote de l’urée (poids moléculaire : 28). Ainsi, une correction de 2,14 (60/28) est nécessaire pour convertir la concentration d’urée en BUN.

Pour examiner le rôle des cellules épithéliales tubulaires dans la production de cytokines après l’IRA induite par le cisplatine, le cisplatine a été injecté à une concentration de 20 mg/kg suivi d’une injection intraveineuse de 0,25 mg de BFA le jour 3 après l’injection de cisplatine. Les reins ont été prélevés 6 h plus tard. Des reins inclus dans de la paraffine ont été sectionnés et colorés avec du TGF-β, du PDGF-D et du CTGF, des cytokines représentatives responsables de la réparation tissulaire de l’IRA. Comme le montre la figure 2A, des vésicules TGF-β⁺ sont observées dans les PTC marqués avec LTL dans les reins traités au cisplatine en présence de BFA. Pendant ce temps, les vésicules TGF-β⁺ n’ont pas été observées dans les reins non blessés ou non traités par BFA.

La quantification a révélé une augmentation de la zone TGF-β1⁺ avec le traitement BFA dans l’IRA induite par le cisplatine (Figure 2B). À l’instar du TGF-β, les vésicules PDGF-D⁺ ou CTGF⁺ se sont également accumulées avec le traitement BFA dans l’IRA induite par le cisplatine (Figure 2C et Figure 2E). La quantification a démontré que les surfaces PDGF-D⁺ et CTGF⁺ étaient significativement augmentées avec la BFA dans les PTC LTL⁺ (Figure 2D et Figure 2F). Pour étudier l’effet du traitement par BFA sur la fonction rénale, les taux plasmatiques d’BUN ont été mesurés le jour 3 après l’injection de cisplatine. Comme le montre la figure 2G, l’injection de BFA n’a pas augmenté de manière significative les taux plasmatiques d’urée.

Ensuite, pour déterminer quelles cytokines sont sécrétées par les cellules interstitielles dans l’IRA induite par le cisplatine, les reins ont été colorés pour le TGF-β ou le CTGF, et les myofibroblastes interstitiels ont été marqués par le α-SMA. Comme le montre la figure 3A, des vésicules TGF-β⁺ ont été observées dans des cellules interstitielles marquées au α-SMA dans le cisplatine-IRA avec traitement BFA (Figure 3A). Pour quantifier le signal à l’intérieur des cellules α-SMA⁺ , la zone α-SMA⁺ a été décrite et les signaux positifs des cytokines et des α-SMA ont été quantifiés à l’intérieur de la zone. La quantification a révélé que la zone TGF-β⁺ dans la zone α-SMA⁺ était significativement augmentée avec le traitement par BFA dans l’IRA au cisplatine (Figure 3B). Les vésicules CTGF⁺ ont également augmenté avec le traitement BFA (Figure 3C), et la quantification a démontré que le traitement BFA augmentait le rapport entre la surface CTGF⁺ et la zone α-SMA⁺ dans l’IRA induite par le cisplatine (Figure 3D).

Pour déterminer si le traitement BFA peut être utilisé dans des modèles d’insuffisance rénale chronique, l’insuffisance rénale a été induite par trois doses d’AA, ce qui induit une IRA qui se transforme en une lésion chronique avec fibrose rénale mature et est cliniquement pertinente pour l’IRC humaine. Le BFA a été injecté le 42e jour après l’injection d’AA, et les reins ont été prélevés 6 h plus tard. Par rapport aux lésions induites par le cisplatine, les vésicules TGF-β⁺ dans les PTC étaient beaucoup plus petites dans la phase chronique de l’AA. Il y avait une coloration positive minime dans les PTC LTL⁺ ; cependant, l’intensité du signal du TGF-β dans les PTC positives pour les lésions rénales (KIM-1⁺) a été augmentée avec le traitement BFA (Figure 3E). Le niveau d’intensité moyen du TGF-β était 3 fois plus élevé avec l’injection de BFA qu’en l’absence de BFA (Figure 3F). Cette découverte indique que l’injection in vivo de BFA peut être utilisée pour la coloration par immunofluorescence et en combinaison avec d’autres marqueurs pour évaluer la production de cytokines d’une manière spécifique au type de cellule.

Figure 1 : Représentation schématique du mode d’action BFA. (A) BFA bloque le transport ER-Golgi des vésicules contenant des protéines à sécréter, telles que le TGF-β. (B) BFA induit une accumulation de cytokines intracellulaires, telles que le TGF-β, dans les cellules épithéliales tubulaires rénales. (C) Coupe transversale schématique d’une queue de souris. Les veines latérales sont les plus accessibles pour l’injection. Abréviations : BFA = brefeldin A ; RE = réticulum endoplasmique ; TGF-β = facteur de croissance transformant-bêta ; BFA- = BFA-négatif ; BFA+ = BFA-positif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’immunofluorescence avec injection de BFA détecte les vésicules riches en cytokines dans les cellules épithéliales tubulaires après une lésion rénale aiguë induite par le cisplatine. (A) Images représentatives des vésicules TGF-β⁺ au jour 3 après administration de cisplatine (20 mg/kg) ou de solution saline. Barre d’échelle = 20 μm. Les flèches indiquent les vésicules TGF-β⁺ dans les CTP. (B) Quantification des vésicules/tubules TGF-β⁺ dans les salines (n = 5), salines + BFA (n = 5), Cis (n = 5), Cis + BFA (n = 5). (C) Images représentatives des vésicules PDGF-D au jour 3 après l’administration de cisplatine (20 mg/kg) ou d’une solution saline. Barre d’échelle = 20 μm. (D) Quantification des vésicules/tubules PDGF-D⁺ dans une solution saline (n = 4), saline + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (E) Images représentatives des vésicules CTGF⁺ au jour 3 après administration de cisplatine (20 mg/kg) ou de solution saline. Barre d’échelle = 20 μm. (F) Quantification des vésicules/tubules CTGF⁺ dans une solution saline (n = 4), saline + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (G) Taux plasmatique d’azote uréique le jour 3 après l’administration de cisplatine (20 mg/kg) : cisplatine (Cis) (n = 7) et cisplatine + BFA (Cis + BFA) (n = 3). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écart-type. * p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les régions délimitées par des cases blanches en pointillés sont affichées dans le panneau inséré à fort grossissement. Abréviations : BFA = brefeldin A ; TGF-β = facteur de croissance transformant-bêta ; Cis = cisplatine ; PDGF-D = facteur de croissance dérivé des plaquettes-D ; CTGF = facteur de croissance du tissu conjonctif ; BUN = azote uréique du sang ; LTL = lectine de lotus tetragonolobus ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; HM = Grossissement élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Vésicules riches en cytokines observées dans les myofibroblastes après une lésion rénale aiguë induite par le cisplatine et les cellules épithéliales tubulaires dans la phase chronique de la néphropathie acide aristolochique. (A) Images représentatives des vésicules TGF-β⁺ au jour 3 après administration de cisplatine (20 mg/kg) ou de solution saline. Barre d’échelle = 20 μm. Les flèches indiquent les vésicules TGF-β⁺ dans les cellules interstitielles a-SMA⁺. (B) Quantification de la surface TGF-β⁺/α-SMA⁺ dans une solution saline (n = 4), une solution saline + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (C) Images représentatives des vésicules CTGF⁺ au jour 3 après administration de cisplatine (20 mg/kg) ou de solution saline. Barre d’échelle = 20 μm. Les flèches indiquent les vésicules CTGF⁺ dans les cellules interstitielles a-SMA⁺. (D) Quantification de l’aire CTGF⁺/α-SMA⁺ dans une solution saline (n = 4), saline + BFA (n = 4), Cis (n = 4), Cis + BFA (n = 4). (E) Images représentatives d’un rein (rouge) coloré au TGF-β dans la néphropathie acide aristolochique chronique. Barre d’échelle = 20 μm. (F) Quantification de l’intensité du signal TGF-β⁺ / PTC KIM-1⁺ en AAN (n = 6) et AAN + BFA (n = 6). Données présentées en moyens ± écart-type. * p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Les régions délimitées par des cases blanches en pointillés sont affichées dans le panneau inséré à fort grossissement. Abréviations : BFA = brefeldin A ; TGF-β = facteur de croissance transformant-bêta ; α-SMA = actine musculaire alpha-lisse ; Cis = cisplatine ; CTGF = facteur de croissance du tissu conjonctif ; KIM-1 = molécule de lésion rénale-1 ; LTL = lectine de lotus tetragonolobus ; AAN = néphropathie acide aristolochique ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; HM = fort grossissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les PTC rénaux sont connus pour réguler l’IRA et l’IRC par la sécrétion de TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, facteur de croissance de l’endothélium vasculaire, ainsi que de nombreuses autres protéines 20,21,22,23. De même, les glomérules, les tubules distaux et d’autres cellules épithéliales rénales, ainsi que les cellules interstitielles, sécrètent ces protéines et/ou d’autres protéines lors d’une lésion 24,25,26. La contribution relative de chacun de ces types de cellules dans la sécrétion de cytokines est difficile à élucider car les cytokines sont sécrétées peu de temps après leur production. Bien que l’hybridation in situ et d’autres techniques de coloration de l’ARN puissent être utilisées pour colorer l’ARN des protéines sécrétées, il est difficile de combiner ces techniques avec la coloration pour des marqueurs spécifiques au type de cellule ou des marqueurs de blessures. Alternativement, de nombreuses études combinent des résultats in vivo avec des expériences in vitro réalisées sur des cellules rénales en culture. Dans ce cas, les données sur les lésions rénales sont associées aux données sur la sécrétion de cytokines à partir de cellules cultivées pour tirer des conclusions, ce qui a une translatibilité limitée à la situation in vivo.

L’avènement du séquençage de nouvelle génération et du RNAseq unicellulaire a permis la classification des types cellulaires par expression génique et l’identification d’autres gènes exprimés par chaque type de cellule²⁷. Bien que cela fournisse des détails exquis sur une base de population, il omet souvent une grande partie des données anatomiques et pathologiques qui peuvent être glanées à partir de coupes de reins. De plus, le séquençage unicellulaire n’identifie souvent que les 3 000 à 7 000 premiers gènes exprimés dans chaque cellule, ce qui peut ne pas fournir suffisamment de profondeur pour cribler toutes les cytokines d’intérêt²⁸. Cet article propose une alternative à ces approches. En utilisant la BFA pour bloquer la sécrétion de protéines, le tissu rénal peut être directement coloré pour les cytokines et d’autres protéines d’intérêt, y compris les marqueurs de type cellulaire à l’aide de techniques d’immunofluorescence standard.

Le TGF-β, le PDGF-D et le CTGF sont parmi les cytokines les plus étudiées dans les lésions rénales. Tous les trois sont connus pour agir comme des épées à double tranchant, favorisant la récupération après l’IRA tout en contribuant à la progression de la fibrose dans l’IRC^29,30. Bien que l’on sache que les cellules épithéliales des tubules rénaux et les cellules interstitielles peuvent potentiellement sécréter du TGF-β, du PDGF-D et du CTGF dans les lésions rénales, l’identification directe du type de cellule et de la production relative reste difficile. Dans la présente étude, nous avons choisi de colorer le TGF-β, le PDGF-D et le CTGF dans les reins pendant l’IRA induite par le cisplatine, et le TGF-β dans le modèle AAN CKD, ainsi que le marqueur PTC LTL, le marqueur de lésion PTC KIM-1 ou le marqueur myofibroblastique α-SMA. Cela permettra de déterminer si les PTC ou les myofibroblastes produisent ces cytokines et les niveaux d’expression relatifs entre les groupes expérimentaux.

Chez les souris traitées avec BFA seul, il y avait peu ou pas de coloration positive de l’une ou l’autre cytokine. De même, le traitement au cisplatine n’a induit qu’une augmentation marginale de la coloration des cytokines. La combinaison d’une lésion au cisplatine et d’un traitement par BFA pendant 6 heures a entraîné une augmentation spectaculaire des signaux positifs intracellulaires des trois cytokines, indiquant que ces cytokines sont normalement sécrétées. De même, seul le groupe cisplatine + BFA a montré une augmentation significative du signal TGF-β et CTGF dans les cellules interstitielles α-SMA⁺. Dans le modèle AAN chronique, dans lequel le TGF-β est associé à une réponse pathologique, l’injection d’AA seule a induit une coloration du TGF-β, en particulier chez les PTC KIM-1⁺ lésés. Le traitement BFA a augmenté le signal intracellulaire positif dans les PTC KIM-1⁺ (les PTC sont les seules cellules de tubule rénal connues pour exprimer KIM-1³¹). Il est intéressant de noter que les PTC LTL⁺ KIM-1⁺ ou LTL⁺ KIM-1^- n’ont pas montré de coloration significative au TGF-β, tandis que les PTC LTL-KIM-1⁺ avaient une positivité au TGF-β plus élevée. La perte de coloration LTL suggère que les PTC exprimant des niveaux plus élevés de TGF-β sont à la fois endommagés et dédifférenciés dans la phase chronique de la lésion. Ce phénotype est probablement la réparation inadaptée décrite précédemment ^32,33. Ainsi, le traitement BFA démontre que le TGF-β est exprimé dans les PTC après l’IRA et pendant l’IRC.

Bien que l’étude actuelle se concentre sur la coloration immunofluorescente, il est important de noter que le traitement BFA peut être combiné avec d’autres tests. Par exemple, si l’expérience ne nécessite pas d’identifier le type de cellule sécrétant la protéine d’intérêt, on pourrait injecter du BFA et effectuer un immunoblot ou un ELISA sur des lysats de rein entier dans des groupes témoins par rapport à des groupes expérimentaux. Un autre test qui pourrait être envisagé est la cytométrie en flux. Le traitement BFA a été combiné à la cytométrie en flux dans des études immunologiques pour déterminer la production relative de cytokines dans différents types de cellules¹⁵. Bien qu’il puisse être difficile de séparer les cellules épithéliales rénales du tissu rénal en cellules uniques, la cytométrie en flux peut être une alternative dans les laboratoires qui ont établi la technique. De plus, le traitement BFA peut être utilisé pour des études de culture cellulaire in vitro dans tous les tests énumérés ci-dessus.

L’étude actuelle décrit deux des méthodes de préparation des tissus les plus courantes, les tissus fixés inclus dans la paraffine et les tissus congelés, qui fonctionnent bien pour les anticorps utilisés dans l’étude. Cependant, étant donné la nature variable des anticorps, il est probable que les chercheurs adoptant cette technique devront normaliser davantage les protocoles de coloration ou le traitement des tissus, en fonction de l’anticorps. Comme les cytokines sont normalement sécrétées, peu d’anticorps anti-cytokines sont testés pour la coloration dans les tissus. Pour accélérer la standardisation du protocole, nous recommandons de générer des contrôles positifs dans lesquels les organes connus pour sécréter les cytokines d’intérêt sont prélevés après le traitement BFA. Par exemple, les rates d’animaux traités par des lipopolysaccharides et des BFA pourraient servir de tissu de contrôle positif pour de nombreuses cytokines différentes. Le prélèvement de la rate et son traitement sous forme de tissu enrobé de paraffine ou congelé permettraient une normalisation plus rapide de la concentration d’anticorps et des tampons. De plus, si les anticorps anti-cytokines ont été caractérisés pour colorer les cytokines dans leur conformation native in vitro, ces anticorps sont plus susceptibles de reconnaître leur cible dans le tissu congelé moins traité.

Bien que le traitement BFA puisse être un outil puissant pour mesurer les protéines sécrétées, il n’est pas sans limites. La limitation la plus apparente est que la protéine sécrétée analysée doit suivre la voie de sécrétion ER-Golgi ; sinon, la BFA peut avoir un effet limité. Une autre limitation est que les animaux traités avec BFA peuvent avoir des résultats modifiés dans d’autres tests expérimentaux. Par exemple, certains biomarqueurs de lésions rénales, tels que KIM-1, reposent sur le transport ER-Golgi pour être présentés à la surface de la cellule. Ainsi, les niveaux de KIM-1 dans l’urine seront probablement réduits chez les animaux traités à l’ABF. De plus, on craint que l’AMF n’entraîne une augmentation du stress cellulaire. Bien que cette préoccupation puisse être atténuée en réduisant la durée du traitement par BFA, elle devrait être prise en considération. Aucune augmentation significative de l’urne n’a été observée dans cette étude ; Cependant, il y a eu une augmentation de ~10 %. Ainsi, il faut faire attention lors du choix d’autres cibles ou marqueurs à analyser chez les animaux traités par BFA.

Cette étude démontre que la BFA peut être utilisée pour bloquer la sécrétion de protéines, conduisant à l’accumulation intracellulaire de cytokines, qui peuvent être colorées par des techniques d’immunofluorescence standard. Cela permet d’identifier les types de cellules sécrétant des cytokines spécifiques ou d’autres protéines, et de quantifier la production de cytokines par ces cellules. L’autre avantage de ce protocole est que les données histologiques et pathologiques peuvent être conservées et analysées dans les mêmes coupes en série ou dans des coupes en série voisines. Ainsi, le traitement BFA offre une approche rentable et relativement simple pour étudier la production de cytokines dans le tissu rénal.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Association américaine du cœur (AHA) : Kensei Taguchi, 20POST35200221 ; Le HHS | NIH | Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK) : Craig Brooks, DK114809-01 DK121101-01.